时间：2023-06-16 16:05:31
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇基因工程载体的种类，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
2008－2010年高考生物江苏卷中连续出现了三道基因工程方面的大题，它们是2008年的第32题(8分)、2009年的第34题(7分)、2010年的第27题(8分)。2011年的第33题(8分)。下面以这几道题目为例深度分析该类试题易考知识点及几点思考。
1 试题分析
2008年第32题主要考查了：PCR中使用的DNA聚合酶的最主要特点(耐高温)；PER中退火温度的设定与引物DNA的碱基种类的关系(G-E碱基对多，DNA结构稳定，退火温度高)；DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专业性要求(没有)；将目的基因导入植物细胞采用最多的是农杆菌；两种限制性内切酶切割重组质粒得到DN段的种类。
2009年第34题中第(1)(2)小题考查了两种不同的限制性内切酶切割目的基因和质粒后可得重组质粒的种类。第(3)小题考查目的基因导人质粒后对质粒结构和功能的影响(只能在特定位置，不能在质粒复制原点、启动子、终止子及抗生素抗性基因中)。第(4)～(6)小题分别考查了DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体问的特异性结合、转基因植物栽培种降低害虫种群抗性基因频率增长速度的措施等问题。
2010年第27题仍然考查了质粒DNA热稳定性与碱基种类的关系、酶切位点的选择(不能破坏质粒标记基因及目的基因)、DNA连接酶的作用、单酶切载体和目的基因自身环化的问题(这个问题比较新颖，需要一定的实践经验，考生一般是想不到的，要解决这个问题只有选择两种不同的限制性内切酶来切割目的基因和载体)、目的基因表达的检测与鉴定的具体操作方法(这个问题涉及到配制选择性培养基的问题，由于教科书中缺乏这方面的知识，考生一般无法作答)。
2011年第3题考查了利用PCR技术扩增目的基因的原理和用限制酶切割质粒产生的位点问题。这部份内容教材当中虽然有相关知识点但学生回答时必须对书本知识有深入的理解的应用。试题中所提出的PCR技术扩增目的基因时出现的问题，是在PCR技术扩增目的基因实际实际操作中经常发生的问题和必须解决的问题，可以说这个考点来源于实际生产或者实验，对于有实验或实践经验的学生和老师解答起来没有问题，但是有多少学生做了PCR技术扩增目的基因这实验呢，出题者的意图是希望教材中应该做的实验应该让学生动手操作，让学生体会实验教程和解决实验过程中出现的问题。
以上列举了DNA重组工程的易考知识点和已考知识点，从易考知识点来看这类题目考查的方面很集中重复性也很强，但是从2010年的已考知识点来看这类题目的难度已经远远超出了课本的范围，对学生的实践经验要求很强(基因工程实验的学习应该是在大学课程中)，这对没有这方面经验的学生作答题目是很困难得。所以下面列举一些笔者能想到的未考查知识点。
2 对今后高考中考查基因工程内容的思考与展望
2.1 DNA连接酶的种类及作用
E.coli DNA连接酶只能将双链DN段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DN段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
2.2 受体细胞选择原核生物(特别是大肠杆菌)的原因
原核生物遗传背景简单、繁殖快、多为单细胞；而真核生物遗传背景复杂繁殖较慢，都是多细胞生物，所以经常选择原核生物作为受体细胞，且大肠杆菌是原核生物中遗传背景最简单的模式生物，自然是受体细胞的首选。
2.3 目的基因进入大肠杆菌的方法(除去Ca2+之外)
重组质粒导入受体细胞最常用的是Ca2+处理受体细胞，使受体细胞在温和的环境下能吸收周围环境中DNA分子。除了Ca2+处理受体细胞外，还可以用电转化的方法在高压环境下使受体细胞细胞膜的通透性增强，重组DNA分子就容易进入细胞。一般情况下电转化的效率要比ca2+转化高100多倍，如果要求获得高效率的重组DNA分子就要采用电转化的方法将目的基因导入受体细胞。
2.4 检验自我复制的质粒导入受体细胞(主要是原核生物)后是否是重组的
2.4.1 如果自我复制的质粒连接的是带有标记基因(该标记基因与质粒上的标记基因不同)的目的基因
比如质粒上带有抗氨苄青霉素基因(ampr)，目的基因带有卡那霉素基因(kanr)，检验自我复制的质粒导入受体细胞后是否是重组的，只要将受体菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上培养，能正常生长出来的菌株都是含有重组的质粒，没有重组的质粒在卡那霉素的培养基上是不能生长的。
2.4.2 如果自我复制的质粒连接的是没有标记基因的目的基因
关键词:生物技术;基因工程;细胞工程
现代生物技术的迅猛发展,成就非凡,推动着科学的进步,促进着经济的发展,改变着人类的生活与思维,影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容,具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测,到2010～2020年,生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。生物技术是以生命科学为基础,利用生物机体、生物系统创造新物种,并与工程原理相结合加工生产生物制品的综合性科学技术。现代生物技术则包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等领域。在我国的食品工业中,生物技术工业化产品占有相当大的比重;近年,酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%。现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景,本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。
一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用
基因工程技术是现代生物技术的核心内容,采用类似工程设计的方法,按照人类的特殊需要将具有遗传性的目的基因在离体条件下进行剪切、组合、拼接,再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞,进行无性繁殖,并使目的基因在受体细胞中高速表达,产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。
发酵工业的关键是优良菌株的获取,除选用常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外,还可与基因工程结合,进行改造生产菌种。
(一)改良面包酵母菌的性能
面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。将优良酶基因转入面包酵母菌中后,其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高,面包加工中产生二氧化碳气体量提高,应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。
(二)改良酿酒酵母菌的性能
利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株,用以改进传统的酿酒工艺,并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉发酵,使生产流程缩短,工序简化,革新啤酒生产工艺。目前,已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株,提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。
(三) 改良乳酸菌发酵剂的性能
乳酸菌是一类能代谢产生乳酸,降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型,其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH 诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言,德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏,但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子,第二种方法是依赖于克隆的基因组DNA 片断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能,产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。
二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用
细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80 年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下,使两个或两个以上的异源(种、属间) 细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法,主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合,使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交,获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前,微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,不断培育出用于各种领域的新菌种。
三、酶工程技术在食品发酵生产中的应用
酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分,酶工程又称酶反应技术,是在一定的生物反应器内,利用生物酶作为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面,一是用酶技术处理发酵原料,有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程,主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时,会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白质降解不足,从而减慢发酵速度,影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂,可补充麦芽中酶活力不足的缺陷,提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分,缩短糖化时间,减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出,从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物,缩短发酵过程,促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素,是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d 的时间。崔进梅等报道,发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含量。
四、小结
在食品发酵生产中应用生物技术可以提高发酵剂的性能,缩短发酵周期,丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值,生产出符合不同消费者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展,相信会开发出更多物美价廉的发酵制品,使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。
参考文献
[1]赵志华,岳田利等.现代生物技术在乳品工业中的应用研究[J].生物技术通报.2006,04:78-80.
[2]王春荣,王兴国等.现代生物技术与食品工业[J].山东食品科技.2004,07:31.
什么是转基因
基因是染色体上的DN段。DNA又称脱氧核糖核酸，形状像两股螺旋的楼梯，它是生物体遗传信息的载体，决定着生物体的性状，并把遗传信息传递给下一代。
基因转移在自然界中广泛存在，植物界的异花授粉是物种内基因转移的典型现象。这种种内基因交流现象便是杂交育种的生物学基础，人们通过干预植物的授粉活动，将需要的性状的基因组合到一起，并通过一代代的人工选择，使杂交得到的性状组合得以稳定遗传，形成新的品种。
除了种内的基因转移外，自然界还存在一种特殊的物种间的基因转移。这种基因转移多由病毒或者细菌感染产生。病毒可以插入宿主细胞的DNA链中，并正常表达，一些细菌的质粒也具有类似病毒的功能。农杆菌侵染植物伤口的过程就是物种间基因转移的典型案例。
转基因技术便模仿这种自然界的物种间基因转移，利用基因工程的手段，人为的把外源基因（可以是同种不同植株中的基因，也可以是种外基因）整合到目标生物体中，使后者获得新的性状，并能把这些性状遗传下去。例如，转基因抗虫棉，是把微生物体内的抗虫基因转移到普通棉花中，使棉花可以产生一种针对棉铃虫的蛋白质，避免植株叶片被虫子啃噬，从而达到抗虫的效果。
与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：拓宽可利用的基因资源，为培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径，可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择，可以大大提高选择效率，加快育种进程，此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。
如何实现转基因
一个转基因作物的诞生一般要经过以下流程：
首先要选择需要的性状，并找到相关性状的基因编码。然后将需要的基因分离出来，建构到合适的载体上。然后通过中间介质或物理方式导入目标体，进行转化，形成转化体。再通过用作标记的抗性性状筛选，选出成功表达外源基因的植株。
载体介导转移系统是最常见的转基因方法：将外源基因重组到合适的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒或Ri质粒介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清晰、最理想的载体转移方法。农杆菌细胞Ti质粒上有段T-DNA，农杆菌侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入植物基因中。人们将目的基因放入经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合。除了使用中介外，外源基因还可以通过物理方法直接进入植物细胞。基因枪是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒）射进植物细胞，获得转基因植株。
利用植物开花、授精过程中形成的花粉管通道，在授粉后向子房注射目的基因的DNA溶液，也可将外源DNA导入受精卵细胞。
在将外源基因导入目标植物细胞后，还需要确定细胞是否能正确表达外源基因并将其稳定遗传。只有少部分细胞能将外源基因整合到核基因组，而整合后能够成功表达的细胞更是少数。因此在转基因操作中，常使用特异性选择标记基因进行标记，以便有效地选择出真正的转化体。抗生素抗性基因与除草剂抗性基因常用作选择标记基因，与目标基因在同一载体上标记转化体。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来，非转化细胞则被抑制，杀死。
有了合适的转化体，就可以进入安全性评估和育种试验。通过转基因的方法往往难以直接获得理想的品种，转基因个体面临着外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其他性状变化等问题。因此人们往往结合杂交等常规育种手段进一步筛选，最终选出综合性状优良的转基因品种。
转入的外源基因有何功能
2000年，已获得转基因植株的物种达上百种，其中包括重要的粮食作物如水稻、小麦、玉米、大豆和马铃薯等；经济作物如棉花、油菜、向日葵和亚麻等；另外还有重要的蔬菜、牧草、花卉和部分木本植物（2000年数据）。在建立转化体系的基础上，人们已将许多具有重要价值的目的基因转入植物。以下是转基因植物育种的几个主要方面。
抗病毒基因工程：抗病毒是植物基因工程早期比较成功的研究领域之一。20世纪90年代末起，转基因抗病毒产品西葫芦和番木瓜等多种作物被培育出来，并获得商品化生产许可，其中抗病毒型番木瓜在美国广泛种植。
抗虫性基因工程：1996年，转Bt基因（一种源自苏云杆菌，被广泛使用的生物杀虫剂）的棉花、玉米和马铃薯已在美国获得批准进行商品化生产，抗虫玉米和抗虫棉是推广面积仅次于抗除草剂大豆的两种转基因作物。
抗除草剂基因工程：抗除草剂转基因植物的研究在北美很受重视。在新大陆的几个农业大国中，抗除草剂作物被大面积种植。抗除草剂作物的出现是为了适应大规模机械化农业生产，使生产者能以简单、高效的方式进行除草作业，并减少除草剂的使用种类和使用量。抗除草剂植物中转入了抗特定除草剂的基因，理想状态，生产者在除草作业时只需要用相应的除草剂即可完成除草作业，不需要多种除草剂混合使用，或人工除草，节省了大量的人力。代表性作物为抗除草剂大豆、玉米和油菜。
文/张敏杰
转基因技术通常也称为基因工程技术，是指利用载体系统的重组DNA技术以及通过物理、化学和生物学等方法，将重组DNA导入有机体的技术。转基因技术是首先在体外进行基因操作，然后转入受体细胞表达。外源基因在受体细胞中的表达可进行人为调控，克服了生物物种之间生殖隔离的自然屏障，可按照人们的意志创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。
1 转基因植物
转基因作物的研究规模已达到了空前的水平。自1983年世界上第一例转基因抗病毒植物诞生以来，转基因作物的研制、中间试验、田间释放和商业化种植得到了迅速的发展，到1997年底，转基因植物已达几百种；转基因作物于1986年在美国和法国首次进入大田试验，到1997年底全世界转基因作物的田间试验已达25000多例；1994年，美国批准了转基因延熟番茄的商业化生产，到1997年底，全世界共有51种转基因植物产品被正式投入商品化生产。
转基因作物的种植面积正在迅速扩大。全世界转基因作物的种植面积在1995年仅为1．2×106hm2，1996年为2．84×106hm2，1997年为1．25×107hm2，1998年为2．78×107hm2，1999年增至3．99×107hm2。2000年进一步增至4．42×107hm2，2001年已达5．26×107hm2。2001年全球转基因作物按作物种类统计为：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按国家统计：美国占70%（面积，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中国占1%～3％，上述4国占全球转基因作物种植面积的99%；按目标性状分类：抗除草剂转基因作物占77%，抗虫转基因作物占15%。据统计，1999年美国转基因大豆、棉花和玉米的种植面积，分别占该国相应作物种植面积的55%、50%和30%。
转基因作物具有巨大的经济效益，1997年美国转基因抗虫棉种植面积为1×106hm2，平均增产70%，每公顷抗虫棉可增加净收益83美元，直接经济效益近1亿美元；1998年美国种植转基因抗虫玉米达5×106hm2，平均增产9%，其净收益为68．1美元／hm2，可产生直接经济效益3．4亿美元。1995年全球转基因作物的销售额仅为0．75亿美元，1998年达到12亿美元～15亿美元，2000年已达30亿美元，5年间增加了40倍。预计2005年将达60亿美元，2010年将达到200亿美元。
2 植物用转基因微生物
自上世纪80年代以来，重组农业微生物工程研究取得了突破性进展，其中新型重组固氮微生物研究已进入田间试验，一些杀虫、防病遗传工程微生物进入田间试验或商业化生产。防冻害基因工程菌株已于1987年进入田间试验，防治果树根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亚和美国获准登记，目前已在澳大利亚、美国、加拿大和西欧一些国家销售，这是世界上首例商品化生产的植病生防基因工程细菌制剂。具有杀虫活性的转B．t基因工程细菌，自1991年起已有多个产品进入市场。在高铵条件下仍保持良好固氮能力的耐铵工程菌株，也进入田间试验。
3 转基因动物
转基因动物主要应用于以下几个方面：改良动物品种和生产性能；生产人药用蛋白和营养保健蛋白；生产人用器官移植的异种供体；建立疾病和药物筛选模型；生产新型生物材料等。1998年全球动物生物技术产品总销售额约为6．2亿美元，预计2010年总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元是转基因动物产品。
4 兽用基因工程生物制品
兽用基因工程生物制品是指利用重组DNA技术生产的兽用免疫制剂。主要包括：单克隆抗体等诊断试剂，目前国内外正在研究、开发或已应用的单克隆抗体诊断试剂已达1000多种；基因工程疫苗，已有44例获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重组活疫苗2例。此外，还有DNA疫苗和兽用基因植物源生物制品等。
5 转基因水生生物
迄今为止，全世界研究的转基因水生生物达20余种，已有8种进入中间试验，其中我国有一种两例，仅有大西洋鲑1种可能已开始小规模商品化生产。
6 我国农业转基因生物研发现状与产业化概况
我国转基因植物的研究开发始于20世纪80年代，1986年启动的863高新技术计划起到了关键性的导向、带动和辐射作用。据1996年统计，国内正在研究和开发的转基因植物约47种，涉及各类基因103种。1997年～1999年，有26例转基因植物获准进行商业化生产。按转基因性状分：抗虫16例，抗病毒9例，改良品质1例。按作物划分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牵牛1例。
转基因抗虫棉是国内植物基因工程应用于农业生产的第一个成功范例，使我国成为继美国之后独立研制成抗虫棉，并具有自主知识产权的第二个国家。1998年～2001年4年累计种植逾1．3×106hm2，减少农药使用量70%以上，产生了巨大的社会、经济和生态效益。由于其伞形辐射的带动作用，抗虫转基因水稻、玉米、杨树等一批后继转基因产品正在进行田间试验，蓄势待发。转基因技术将使农业产业发生深刻的结构变化，向农业与医药、农业与食品、农业与加工结合的方向发展。
我国植物用转基因微生物研究已取得长足进展，正在研发的防病杀虫微生物13种，涉及基因16种；固氮微生物8种，涉及基因12种，大多已进入中间试验和环境释放试验。我国兽用基因工程生物制品研究与产业化进展迅速，已有近70种单克隆抗体等诊断试剂投放市场，2例基因工程疫苗获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗1例，基因重组活疫苗1例。
我国转基因水生生物研究取得了举世注目的成就，1985年，我国培育出世界首批转基因鱼。此后，培育出比正常生长速度快3倍～4．6倍的转基因泥鳅。目前，转生长激素基因鲤、转大麻哈鱼生长激素基因鲤均进入中试阶段。此外，我国还开展了藻类、贝类等其他水生生物的转基因研究。我国转基因动物研究成绩斐然，生长速度快、瘦肉率高、对某些病毒有一定抗性的转基因猪培育成功，乳腺组织能够表达人药用蛋白凝血因子IX、人生长激素、人红细胞生成素的转基因羊已进入中试和安全性评价阶段，此外，还成功地培育了转基因牛。
生物育种方法的运用是体现高考生物试题难度、区分度的良好命题素材。近年来高考对该知识点的考查发生了较大的变化。从命题的理念看，由传统的杂交育种转向太空育种（诱变育种）和生物工程（基因工程和细胞工程）育种；从命题素材看，由对某种方法的单一考查转向对多种育种方法的综合考查；从能力要求看，由理解能力转向综合运用和实验探究能力的考查。现就如何根据育种的目的，选择不同需求的育种方法及规范作答等作一探讨。
一、根据目的，选择育种方法
育种的根本目的是培育具有优良性状（抗逆性好、生命力强、产量高、品质优良）的新品种，以便更好地为人类服务。从基因组成上看，目标基因型可能是纯合体，可防止后生性状分离，便于制种和推广；也可能是杂合体，即利用杂种优势的原理，如杂交水稻的培育、玉米的制种等。
例1 粮食是人类生存的基本条件，提高单位面积粮食的产量、质量是解决粮食问题的主要途径之一。
（1）为提高农作物的产量，得到抗倒伏、抗锈病等优良性状，科学家往往采取多种育种方法来培育符合农业生产要求的新品种。根据下面提供的材料，设计育种方案，以便最快得到所需品种。非生物材料：可自选。生物材料有：
A.水稻的高秆（显性）抗锈病（显性）纯种
B.水稻的矮秆（隐性）不抗锈病（隐性）纯种
C.水稻的高秆（显性）不抗锈病（隐性）纯种
①要得到能直接应用于生产的具有抗倒伏、抗锈病等优良性状的品种，该品种应是 。
②所选择的生物材料： （填写代表生物材料的字母）。
③育种过程中运用的最常见的方法是 。
④预期产生这种结果（所需性状类型）的概率是 。如果从播种到获得种子需要一年，则获得该品种植株至少需要 年。
（2）随着科技的发展，许多新的育种方法已经出现并投入使用。
①用普通小麦和黑麦培育的八倍体小黑麦的原理是 。
②航天育种是目前的一个热门话题，如“神七”就搭载了萌发着的植物种子。那么利用这种方法是否一定能获得人们所期望的理想性状？为什么？ 。
③螟虫是危害水稻的主要害虫之一。科学家为了减少农药的使用，希望培育出具有抗螟虫性状的水稻新品种，最适合的育种方法是 ，其原理是 。
【解析】（1）①能直接应用于生产的品种要保持优良性状，其自交后代不发生性状分离，一般为纯合子。②杂交育种的原理是基因重组，将两个品种的优良性状（抗倒伏、抗锈病）组合到一起，选择A、B两个亲本可以达到这一目的。③最快的育种方法是单倍体育种，常用技术有杂交、花药离体培养、人工诱导染色体加倍等。④亲本杂交后的子代花药离体培养、人工诱导染色体加倍后得到4种纯合子，比例相同，因此抗倒伏抗锈病性状的概率为1/4。亲本杂交得到种子（子代）需要1年，子代花药离体培养、人工诱导染色体加倍后，得到纯合子需要1年。
（2） ①普通小麦为六倍体，黑麦为二倍体，两者杂交得到的个体有4个染色体组，人工诱导染色体加倍后为八倍体，属于染色体变异。②“神七”搭载萌发着的植物种子的主要目的是借助太空的紫外线诱导基因突变，由于基因突变是不定向的，所以不一定能获得人们所期望的理想性状。③抗虫性状的基因一般来自原核生物，运用转基因技术将抗虫基因移接到植物体，属于基因重组。
【答案】（1）①纯合子（纯种） ②A、B ③单倍体育种 ④1/4 2
（2）①染色体变异 ②不一定；因为基因突变是不定向的 ③基因工程育种 基因重组
【方法规律】在解答“育种”类试题时，需要根据提供的材料选择合适的亲本及育种方法，分析育种过程中出现的问题，推测育种结果，并得出相关结论。
育种方法的选用要求：一般作物育种可以选用杂交育种和单倍体育种。如果检测纯合子，则用测交或自交；若既要检测纯合子又要分离纯合子时，如果优良性状是显性性状则用连续自交，如果优良性状是隐性性状则直接分离；已知多对性状要获得纯合子，首选单倍体育种，然后才是自交。为了得到特殊性状，可以选择诱变育种或多倍体育种，如果将不同物种的性状组合在一起，可以选用基因工程等。方法小结：
（1）若要培育隐性性状个体，则可用自交或杂交，只要出现该性状即可。
（2）有些植物如小麦、水稻等，杂交实验较难操作，则选择自交方法最简便。
（3）若要快速获得纯种，则用单倍体育种方法。
（4）若实验植物为营养繁殖类如土豆、地瓜等，则只要出现所需性状即可，不需要培育出纯种。
（5）若要培育之前没有的性状，则可用诱变育种。
（6）提高营养物质含量可运用多倍体育种。
（7）将两个亲本的不同优良性状集中在一起，可利用杂交育种（含植物细胞的杂交）。
（8）若要定向地改造生物性状，则可用基因工程育种。
（9）在实际育种过程中，并非单一地运用某种育种方式，而是根据需要选择多种育种方式综合运用。
二、掌握策略，设计育种实验
例2 如图所示，科研小组用60Co照射棉花种子，诱变当代获得棕色（纤维颜色）新性状，诱变1代获得低酚（棉酚含量）新性状。已知棉花的纤维颜色由一对基因（A、a）控制，棉酚含量由另一对基因（B、b）控制，两对基因独立遗传。
（1）两个新性状中，棕色是 性状，低酚是 性状。
（2）诱变当代中，棕色、高酚的棉花植株基因型是 ，白色、高酚的棉花植株基因型是 。
（3）棕色棉抗虫能力强，低酚棉产量高。为获得抗虫高产棉花新品种，研究人员将诱变1代中棕色、高酚植株自交，每株自交后代种植在一个单独的区域，从 的区域中得到纯合棕色、高酚植株。请你利用该纯合体作为一个亲本，再从诱变1代中选择另一个亲本，设计一方案，尽快选育出抗虫高产（棕色、低酚）的纯合棉花新品种（用遗传图解和必要的文字表示）。
【解析】棕色、高酚自交后代是棕色、高酚和白色、高酚，因此棕色是显性，亲代白色、高酚自交后代是白色、低酚和白色、高酚，因此低酚是隐性。诱变当代中，棕色、高酚的棉花植株的基因型是AaBB，白色高酚的棉花植株基因型是aaBb，纯合体后代不发生性状分离，因此应从不发生性状分离（或全为棕色棉或没有出现白色棉）的区域中选择出纯合棕色、高酚植株。育种时间短应选择单倍体育种方案。
【答案】（1）显性 隐性 （2）AaBB aaBb （3）不发生性状分离或全为棕色棉或没有出现白色棉
【思维拓展】设计育种方案时，应该注意是“动物育种”还是“植物育种”。植物育种时，可以用连续自交的方法获得纯合子，这是由于植物中雌雄同体的物种较多。动物只能选相同性状的个体相互，待性状分离后筛选，然后用测交方法检测纯合子，这是由于动物大多是雌雄异体，不能“自交”。
育种年限的要求及计算方法：若需要获得植株，则比获得种子多一年，因为获得种子后，第二年才能获得植株。若需要获得跨年度的植物（如小麦），则比不跨年度的植物（如豌豆）要多一年。
生物工程技术育种的组合及其遗传性：
（1）转基因植物培育：基因工程+植物组织培养，具有两亲本的遗传性。
（2）转基因动物培育：基因工程+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（3）核移植（克隆）动物培育：核移植+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（4）胚胎移植：有性生殖+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（5）植物体细胞杂交：酶工程+体细胞融合+植物组织培养，具有两亲本的遗传性。
（6）试管婴儿：体外受精+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
注：异源多倍体具有两亲本的遗传性；胚胎分割产生的后代遗传性相同，相当于无性繁殖。
例3 家蚕是二倍体生物，含56条染色体，ZZ为雄性，ZW为雌性。幼蚕体色中的有斑纹和无斑纹性状分别由Ⅱ号染色体上的A和a基因控制。雄蚕由于吐丝多，丝的质量好，更受蚕农青睐，但在幼蚕阶段，雌雄不易区分。于是，科学家采用下图所示的方法培育出了“限性斑纹雌蚕”来解决这个问题。请回答：
（1）家蚕的一个染色体组含有 条染色体。
（2）图中变异家蚕的“变异类型”属于染色体变异中的 。由变异家蚕培育出限性斑纹雌蚕所采用的育种方法是 。图中的限性斑纹雌蚕的基因型为 。
（3）在生产中，可利用限性斑纹雌蚕和无斑纹雄蚕培育出根据体色辨别幼蚕性别的后代。请用遗传图解和适当的文字，描述选育雄蚕的过程。
【解析】（1）家蚕是二倍体生物，其体细胞含56条染色体的二倍体生物，其生殖细胞含有28条染色体，因此一个染色体组有28条染色体。（2）由图可知，该家蚕的变异属于非同源染色体之间的易位，应属于染色体结构变异。由变异家蚕培育出限性斑纹雌蚕所采用的育种方法为杂交育种。限性斑纹雌蚕的Ⅱ号染色体有2个a基因，W性染色体上有1个A基因，故基因型为aaZWA。（3）用限性斑纹雌蚕和无斑纹雄蚕杂交，其后代中无斑纹的都是雄蚕，有斑纹的都是雌蚕。
【答案】（1）28 （2）结构变异 杂交育种 aaZWA （3）如图所示
（文字说明：后代中有斑纹的均为雌蚕，应淘汰；无斑纹的均为雄蚕，应该保留）
【应对策略】不同的育种方法所依据的原理不同，其适用的条件会有一定的差别。解答此类试题时，一定要认真审题，明确试题要求，结合各种育种方法的特点及其适用条件进行合理选择。如：
（1）集中不同亲本的优良性状选用杂交育种，集中优良性状且缩短育种年限选用单倍体育种。
（2）获得较大果实或大型植株或提高营养物质含量选用多倍体育种。
（3）提高变异频率，改良或直接改变现有性状，获得当前不存在的基因（性状）选择诱变育种。
（4）实现定向改变现有性状选用基因工程育种。
三、规范审题，精准解答育种类试题
例4 假设A、b代表玉米的优良基因，这两种基因是自由组合的。现有AABB，aabb两个品种，为培育出优良品种Aabb，可采用的方法如图所示。有关叙述不正确的是（ ）
A.由品种AABB、aabb经过①、②、③过程培育出新品种的育种方式称为杂交育种
B.基因型为Aabb的植株经过过程③，子代中AAbb与aabb的数量比是1：1
C.与过程“①②③”的育种方法相比，过程⑤⑥的优势是明显缩短了育种年限
D.过程④在完成目的基因和运载体结合时，必须用到的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体
【解析】首先规范审题，审出关键词或关键语句。如本题题干中包含如下信息：两种基因遗传遵循自由组合定律；将不同品种优良性状集中到一个个体上，应用杂交手段，育种方式为杂交育种（①②③过程）；⑤⑥利用花粉培育新品种，为单倍体育种；利用物理因素获取新品种（⑦过程）为诱变育种；利用转基因技术获取新品种（④过程）为基因工程育种。
依据审出的信息，作出精准判断。选项A，对杂交育种本质不理解会错选A项。选项B，题干确定亲本基因型为Aabb，其自交（③过程）的后代基因型及比例为AAbb∶Aabb∶aabb=1∶2∶1，即AAbb∶aabb=1∶1。选项C，该选项是“⑤⑥”单倍体育种与“①②③”杂交育种相比较，单倍体育种大大缩短了育种年限，若不了解单倍体育种的优势会错选C项。选项D，运载体不是酶，而是一种运输工具，所以D选项叙述错误。
【关键词】反向PCR;反转录PCR;锚定PCR;基因克隆;方法
据实践可知，实施基因工程的程序，首先是要取得目的DNA的片段，这是前期必要的步骤。因此，怎么去圆满地完成这一过程，就成为了基因工程中的首要因素。单从目的DNA的提供方式而言，其只有分离天然动植物DNA及人造DNA两种方式。而就获得目的基因的方法而言，其基本上有PCR、化学合成、cDNA和设置基因文库的方式进行优选等几种类型。
1.何谓基因工程的PCR
在一九八五年，美国相关公司的数名专家首先设置了快速复制增加特性DN段的工艺技术，具体的化学名称叫做聚合酶链式反应，其英文缩写即为PCR。基因聚合酶起初是在一九五五年被发现的，而富含较高实用价值的聚合酶是在七十年代初期才被发现的。然而，因为此聚合酶不具有耐高温性能，其在高温的情况下就会发生较大的性能改变，所以，不适合高温的聚合酶链式反应。现时被广为使用的一种聚合酶，是在一九七六年取自于温泉水里的一种细菌。它是具有相当耐高温性能且极为完好的一种酶。初始的PCR概念基本是指基因的修复和复制，它具有单一和短暂的性能缺陷。从一九八三年开始，PE公司就率先应用了新的PCR。
因为PCR属于一类体外快速增加指定DNA或其序列的功能系统，所以还可以取名为DNA的体外扩增法。在当今PCR工艺已经是人类获取外部基因的一个最佳手段，只要掌握了目的DNA的核苷酸排序，人们即能够拟定出一段引物，采取PCR工艺，在试管内设置反应过程，经历若干小时以后，即可以把相当小量的目的DNA或指定的基因片段增加数十万倍。甚至达到百万倍。
2.PCR工艺过程机理
由于PCR工艺是一项体外复制特定基因片段的生物技术，所以，其与基因分子的体内复制过程有若干相似的情况，同时也存在着不少的相异地方。细胞里基因的复制过程是首先把双链DNA分解螺旋变成单链DNA。尔后，RNA引物与单链DNA模板结好对，在有四种核苷酸底物的前提下，基因聚合酶与RNA引物的3’端依据碱基互补配对的规则组合成具有互补性的基因链。经过一个复制过程后，单个基因分子变成了双个基因分子。PCR就是代表试管里进行的基因复制经历，其余体内基因复制模式相同，都要具备单链模板、引物、四种核苷酸底物、基因聚合酶，复制后达到相同的效果。其区别就是PCR所使用的引物是单链的基因引物，其聚合酶是属于耐高温性能的。在试管中所作的整个复制过程分三个过程：第一步是变性过程，其为PCR反应的第一阶段，也就是把模板基因放置在九十五摄氏度左右的高温之中，将双链基因转变成单链基因;第二步即为退火过程，也就是把反应温度下调到五十摄氏度左右，促使一队引物先后与变性后的两个模板实施配对;第三步为延伸过程，即把反应温度设置在聚合酶反应的最佳温度七十二摄氏度，尔后，用目的基因做模板合成新的基因链。因为其所用聚合酶的耐高温品质，在每个复制阶段完成后，无需增加任一别的反应组分即能够重新开始下一阶段的复制。
3.PCR方法的基因复制
采用PCR复制DN段系基因工程的一项重要手段。
3.1依托反向PCR复制目的基因片段
由基因组依托PCR复制基因片段过程的重要一环是引物的拟定，通常能够依据业已公布的基因排列拟定引物，也可以凭借原有的相关基因序列拟定引物。若要依据cDNA排列拟定引物增加基因数目，拟定引物时，必须顾及到cDNA基因没有内含子，而gDNA存在内含子，拟定引物时，不能够置于外显子的拼接点上。拟定引物时，一般可以在引物的末端设置一个酶切位点，从而促进基因片段与载体的连接。
反向PCR系一类依托原有系列增加其旁侧序列的模式，凭借此方法，能够实施染色体步移。其开始的步骤，是把基因组DNA依靠限制性的内切酶给予切割开来，莎草用的限制酶必须在原有序列中不存在切点，而后再依托连接酶把酶切片段连接起来，与此类产物中，其含有原来序列的环形基因会得到大幅度增加。由此获取原来基因片段的旁侧序列。
3.2 cDNA的制备及cDNA文库的建立
cDNA的制备可以采用RT-PCR方法。亦被称作反转录PCR。其属于一类酶促进制备方法，就是用mDNA做模板，依靠反转录酶的作用，用四种脱氧核甘三磷酸为反应物成分制备DNA，再通过复制以后就可得到双链的基因。
3.3锚定PCR过程及基因的复制
经过RT-PCR过程获取的大规模双链cDNA以后，欲要精选分离出所需的特定目的基因，若不用cDNA文库筛选时，尚可运用锚定PCR的方法将其收获。此种措施的特点，是凭借原已存在的一异性的引物来实现，其尤其适合于扩增那些紧掌握一段序列形态的目的基因，比如一端序列已经知道，而另一段序列未知的基因片段，能够依托基因末端转移酶将cDNA第一个末端添上一端多聚dG尾巴，尔后添加一个末端属于多聚dC的特异引物，由此决定了扩增的特性。锚定PCR是研究遗传学及医学的有效方法。
小结
通过上述介绍和分析，我们基本掌握了获取目的基因的来源和几种相当实用的基因克隆方法，这几种很常用的方法，它们都有各自的特性和优点，我们在实际基因工程研究中，还要不断的总结、完善并加以创新，促使其能够更好地为我们人类的遗传、医学等相关行业服务。
【参考文献】
[1]赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2007.16（4）：492-497
[2]董明，宫月华，王兰等.DNA提取的应用与相关技术分析[J].遗传，2003.25（2）：205-207
[3]郭燕霞，刘开会，邱宁等.6种特殊生物检材的DNA提取[J].刑事技术，2002.5：52-53
【作者简介】
从普通留学生到国际医药学界的领军人物
许瑞安教授是福建晋江人，其故乡既是一个环山面海的渔、农、侨村，山川揽胜，日月钟华；又是一个文化底蕴十分厚重的中国历史文化名村一晋江福全。史载唐宋开科取士以来，全村进士，举人共20多人，出将入相，该村乃是我国最著名的抗倭历史名城，明代曾在没有官军奥援下，孤城三次打败入侵倭寇；许教授自幼沐浴于海洋文化和中原文化的交汇，其童年就在惊涛拍浪的变质岩礁上外婆家的住屋度过，大自然春风造化孕育着他对万物之灵有着不尽迷思与眷恋；失学，饱受天风海涛的锤炼，不仅为日后的工作打下了坚实的基础，而且从科学态度、科学素养到人生目的都得到了良好的洗礼与升华，立志一生从事科研。
1983年许瑞安教授考上国家教育部公派出国留学。到了国外之后，他不仅迅速克服了独自在异国他乡求学所必然面临的种种不适和不便，而且抓紧一切机会刻苦学习，将绝大部分时间都泡在图书馆和实验室里。正是源于这种严谨认真的治学精神和态度，1989年，他顺利获得了Otago大学的博士学位，之后又前往加拿大攻读博士后。
完成学业后的许瑞安曾在国外多家著名的国际大学、科研机构从事科研教学工作，先后出任过大学载体研究中心、神经载体研究室主任的职务。从那时候起直到2005年年底归国，他主要从事的工作范畴包括病毒载体、分子医学、分子药物学的项目科研和教学，还曾担任过奥克兰大学载体研究中心的主任和美国托马斯・杰弗逊大学的神经载体研究室主任。
在国外期间，许瑞安从1983年起开始陆续发表专业学术论文，迄今为止已经有超过百篇的重要学术文章发表，其中SCl论文就占到了七成以上，SCl影响影子总分超过400分。他在基因治疗研究方面的部分工作发表于NatureMedicine【1998年第5期封面】、Science、PNAS等国际一流学术刊物，2005年发表在美国医学科学检测杂志上的“Stabilityof lnfectiOUS rAAV vector stock”一文更是被世界卫生组织选定为分子疗法临床应用的主要参考文献之一。2006年他在Histopathology杂志发表结肠癌治疗一文，2011年入选结肠癌治疗领域5年来TOP 10论文，且位居榜首。
许瑞安在学术上获得的成果不仅在理论研究方面，更包括了技术实践应用领域。由他创新发明的专利成果达16项，他是国际口服基因疗法的主要奠基人和发明人之一，在分子药物学、癌细胞与基因疗法领域取得一系列的科研成果。
凭借着严谨的科学态度和坚韧不拔的精神毅力，许瑞安从一名普通的留学生成长为一位国际医药学界知名的科学家。
肩负重任，归国奉献
2005年，许瑞安回到家乡，为祖国的药物研究事业贡献才华和智慧。同年，他受聘于华侨大学，并出任所长、主任。由于许教授在分子医学与基因治疗研究领域内的突出贡献和成就，奠定了他在国内外相关领域的学术地位，2007年受命，开始负责组建分子药物教育部工程研究中心的工作。他在任职国家教育部分子药物工程研究中心主任、华侨大学分子药物所所长之外，还兼任了国际癌细胞与基因疗法学会常务理事、国家科技部科技发展战略专家／国际科技合作管理专家、国家教育部学位中心评审专家、福建省生物医药工程研究生培养基地负责人、厦门海洋与基因工程重点实验室主任、厦门市国际科技合作生物医药基地负责人、教授、博士生导师、北京协和医学院荣誉教授、《中国临床药理学和治疗学》编委、顾问，《中国海洋资源》特邀编委、中国海洋大学海洋药物客座教授，山东大学兼职教授等职务。在国际上，许教授同时还是瑞典卡罗琳医学院国际学术刊物lslet编委，美国International Panel of MedicalScience Monitor，我国World JournalOf Gastroenterology PharmacologyandTreatment编委、美、英、德、日、瑞典等国际18家Hepatology，Gene The rapy等SCI学术刊物审稿人、“行政院”台北荣民总院荣誉教授、爱尔兰国家自然基金评审专家、新西兰食品科学技术研究院专业委员。
回到祖国之后，许瑞安教授将全部智慧和毕生对科学事业追求的所有热忱投入到了我国的分子药物与基础医学研究事业当中。他负责组建了华侨大学分子药物学研究所，带领研究所的同仁以新药研发为主旨，积极开展了一系列工作，也由此揭开了华侨大学药学学科和生物医学工程建设的序幕。
自2007年10月分子药物教育部工程研究中心获得教育部批准立项、开始建设以来，在许瑞安教授的带领下，该研究中心依托于华侨大学，得到了迅速地成长。经过了三年的建设时期，到2010年时研究中心已经完善建立起了分子药物、中药复方、厦门市海洋与基因工程药物重点实验室三大药物研究与开发平台。
早在1998年，许瑞安和During就曾经首开人类口服基因疗法的先河，在分子药物领域做出了开拓式的大胆创新并获得了首创的成果。回国后许教授继续发扬在这一领域内的优势，致力于口服基因药物的研发工作，他负责研究的“rAAV基因药物的口服吸收机制”获得了2009年度国家自然科学基金资助。而由许瑞安和肖卫东领军的团队，已经建立起成熟的rAAV载体的产业化技术。
时至今日，在许瑞安教授的不懈努力和推动下，占地500平方米的AAV载体中试生产车间已经建成，可为国内外各家生物医药研发单位提供各种类型中试级别的AAV病毒载体。
推动创新成果研究，建设人才培养体系
许瑞安教授是我国“863”“十五”肺癌基因疗法课题组组长、首席科学家，肝癌基因疗法课题组副组长、国家“863”“十一五”肺癌基因疗法课题组首席科学家，在我国的癌症与基因疗法研究领域力尽所能。与此同时，许瑞安并未满足和止步于个人的研究成果创新，他在积极推动产品开发和研究成果转化、发展学科建设和人才培养等方面依旧付出了极大的心血和努力。由许教授带领的分子药物教育部工程研究中心
重视蛋白药物的临床应用，迄今已建立多种小量蛋白的真核／原核表达系统，并已有三个蛋白产品(Kallistatin，Cygb，Vasostatin)完成动物实验并达到中试规模制备并纯化成功，保证了较大量蛋白纯品可用于药物学、药理学的探索，同时亦能满足基因工程蛋白药物开发的临床研究需要；其团队研发的基因重组FSH，还对妇女不孕具有确切临床价值。目前已提交得到验证的抗病毒和抗感染药物的专利申请，中试、临床试验和报批国家新药的工作正在筹备中，并有望按照欧美标准在国外注册和销售。
与此同时，基因药物平台申请的“肝纤维逆转药物”，利用具有特异的细胞靶向性的基因运载系统携带具有抗氧化和抗炎症双重功能基因抑制星状细胞激活达到防止肝硬化目的，颠覆了目前纤维化治疗的传统思路，具有巨大的市场开发潜力。在中药研发的制备领域，工程中心目前也已经拥有授权或已申请的中药相关专利项目超过10项；在合成药物方面，中心开发出了有效的抗癌药物肉桂酸乙酯衍生物的绿色合成工艺，以成本低、绿色化、操作简单等特色为市场所看好；在海洋药物领域，中心以东南沿海、台湾海峡、东南亚海域有特殊功效的海洋分子药物为研究对象，建设的海洋药物研发平台现如今已发展成为与厦门市政府共建的高校海洋药物重点实验室。
学科建设是重中之重，根深才能树大，许教授牢牢把握学科建设方向。在他的努力下，分子药物工程研究中心2007年正式开始建设，2008年就开始独立招收医学生物工程、分子药物学、微生物生药学和药学方向硕士研究生，2009年福建省唯一的“福建省生物医药工程研究生创新培养基地”落户分子药物学研究所。如今他们已经拥有了一个二级博士点，3个硕士点1个专业硕士点以及完备的科研、教学团队还从美国宾州大学、英国牛津大学、香港大学的教授以及曾在辉瑞、默克等国际知名制药公司承担开发工作的高级工程师中聘请了多位兼职教授或名誉教授。
作为中心领军人物的许教授不仅是科技部科技发展战略专家，还是国际知名的分子药物学家，在他的主持或策划下，工程研究中心仅立项建设期间就申请获得各类国家、省部级、市级课题22项，而且大力加强国际间科技合作与学术交流；与新西兰皇家科学院合作的“核糖开关及其在基因治疗的应用”已获得新西兰政府和国家科技部的资助；2011年与美国伊利诺伊大学芝加哥分校药学院联合建立培养一本一硕一博体系。从今年起开始招收本科生。全体师生们众志成城，同心同德，努力把教育部分子药物工程中心建成了一个分子医药基础研究、产品开发和成果转化一条龙的基地，涉及分子医学，分子药物，医用口服病毒纳米颗粒，药物合成，转化医学，海洋基因药物，天然药物等多门学科，同时为国内培养和凝聚了分子药物领域里的大批技术创新型人才。
与此同时，许教授极力推崇产学研相结合，先后与中侨药业、福建太平洋药业，沈阳天一药业等签订项目合作、转化及技术培训协议；该团队2009年研发的硫酸沙丁胺醇口腔崩解片、药物中间体等项目的研发和成果转化投放市场，每年产值均超2，000万。
如今的分子药物教育部工程研究中心已形成一支囊括多学科、从基础研究至产业化的完整的产学研研发链条。许瑞安教授介绍说：“在这个链条上，我们可以独立设计基因药物载体、蛋白药物和靶向基因药物，可以对病毒载体和基因工程蛋白进行中试规模生产，还可以承担或独立进行新产品的开发与市场化，满足临床药物研发和接受企业委托项目的需要。”
关键词：甘薯（Ipomoea batatas）；现代生物技术；育种；诱变育种；细胞工程；分子标记；基因工程
中图分类号：S531；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2721-06
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.001
Application of Modern Biotechnology in Ipomoea batatas Breeding
YANG Han1，CHAI Sha-sha2，SU Wen-jin2，LEI Jian2，WANG Lian-jun2，SONG Zheng2，LIU Yi3，YANG Xin-sun2
（1.College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；2. Institute of Food Corps， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China；3. Agronomy College， Yangtze University， Jingzhou 434023， Hubei， China）
Abstract：The modern biotechnology has overcome the difficulties which could not be solved in the past in Ipomoea batatas breeding.Mutation breeding， cell engineering， molecular markers，genetic engineering etc.， are playing very important roles in Ipomoea batatas breeding for high yield， good quality，resistance to diseases and pests and other characteristics.The research and utilization of mutation breeding， cell engineering，molecular markers and genetic engineering in Ipomoea batatas breeding are reviewed in this paper.
Key words：Ipomoea batatas； modern biotechnology； breeding； mutation breeding； cell engineering； molecular marker； genetic engineering
甘薯（Ipomoea batatas）属旋花科甘薯属，为一年生或多年生蔓生草本，是中国的重要粮食作物、饲料作物和新型生物能源作物，具有极高的经济价值。甘薯含有60%～80%的水分，10%～30%的淀粉（支链淀粉含量高，易被人体消化吸收），5%左右的糖分，还富含人体必需的多种维生素（VA、VE、VB1、VB2、VC等）、氨基酸（赖氨酸含量较高）、蛋白质、脂肪、膳食纤维以及钙和铁等多种矿物质。甘薯中的活性化学物质（脱氢表雄酮）可以抑制癌症和预防癌细胞增殖[1]。因此，培育出高产、稳产、优质的品种及各类不同用途和种类的品种如食用、加工用、饲料用、茎尖菜用等[2]具有非常重要的现实意义。但是由于甘薯的高度杂合性、杂交不亲和性、遗传资源匮乏、遗传基础狭窄、优异近缘野生种利用困难和病虫害、病毒病危害严重[3]，极大地制约了甘薯的生产和发展。但传统育种模式周期长，品种改良进度缓慢，难以满足发展需求。生物育种是目前应用推广最为迅速的技术，它突破了传统育种的局限性，有利于加速培育高产、优质、抗逆、广适的新品种。本文重点介绍近年来几种主要生物技术，包括诱变育种、细胞工程、分子标记辅助选择育种和基因工程在甘薯育种中的发展与应用。
1 诱变育种
甘薯是一种无性繁殖作物，其自然变异和人工诱变产生的变异，是甘薯育种重要的变异来源，因此诱变育种一直是甘薯育种的一条重要途径，也是发展比较早的一种技术。
在自然条件下，由于外界环境的变化和遗传结构的不稳定性，植物本身会发生自发突变，但是这类突变发生的频率较低。自然变异突变体的选择、鉴定是甘薯种质创新的主要途径。张连顺等[4]从抗薯瘟病的闽抗329中选育出了兼抗蔓割病、藤蔓旺盛的闽抗330，张永涛等[5]、李培习等[6]分别从高抗根腐病的徐薯18芽变体中选育出了兼抗茎线虫病的临选1号和富贵1号。
辐射诱变的方式包括χ射线、60Co处理、80 Gy γ射线处理、搭载返回式卫星进行空间诱变处理等。但诱发突变的方向难以控制，有利突变频率不够高。通过辐射诱变育种加以多年筛选获得了比较好的品种如较徐薯18高抗黑斑病的品系农大601[7]和抗线虫扩展、薯皮色同质、干物率高、食味优、高胡萝卜素突变体及淀粉类型和紫色素类型育种材料[8]。
化学诱变具有专一性强、突变频率高，突变范围大的特点，为多基因点突变，诱变后代的稳定过程较短，可以缩短育种年限。Luan等[9]用EMS处理鲁薯8号愈伤组织，并通过离体筛选，获得3个耐盐突变体株系（ML1，ML2，ML3）。王凤保等[10]用0.05%秋水仙素和2%二甲基亚砜混合水溶液处理秦薯1号甘薯种子，选育出高产、高淀粉、低β-淀粉酶活性、高蛋白质、高铁、早熟的短蔓型甘薯新品种短蔓3号。王芳等[11]用0.5% NaN3处理澳大利亚Au1990sp紫甘薯的胚性细胞团，选育出品种适应性广、产量高、品质佳、抗性强的甬紫薯1号。
2 细胞工程
甘薯细胞工程主要有体细胞胚发生、原生质培养、细胞悬浮培养、茎尖分生组织培养等，在种质资源创新、新品种选育和脱毒苗工厂化生产等方面具有广阔的应用前景。目前主要通过茎尖诱导体细胞胚胎的植株再生。利用甘薯茎尖培养诱导得到胚性愈伤后，通过液体振荡悬浮培养可以迅速增殖，利用农杆菌介导、基因枪、电激等方法研究甘薯的遗传转化。在此过程中，常常会出现自发变异，通过对这些突变体进行筛选，也可以用于甘薯新品种选育[12]。
甘薯容易侵染的病毒和类病毒种类较多，加上甘薯属于无性繁殖作物，病毒能够在植株体内不断增殖积累，使甘薯病毒病的危害逐年加重，造成了大幅度的减产。利用甘薯茎尖病毒含量低或不带病毒的特点，通过茎尖分生组织培养可以生产甘薯无毒苗。脱毒甘薯增产效果显著，根茎叶生长旺盛，光合效率高，抗逆能力强[13]。经检测确定为不带病毒的组培苗可以进行快繁和原种生产。
3 分子标记辅助选择育种
分子标记在甘薯遗传育种中的应用是利用标记将不同甘薯品种DNA序列上的多态性体现出来，可利用其进行种质鉴定、基因定位、遗传图谱构建和辅助育种等并最终应用到生产实践中。在作物遗传改良过程中，形态标记、细胞学标记和同工酶标记等已很难满足对它们的基因组进行更详细研究的需要。随着分子生物学的发展，产生了多种基于DNA多态性的分子标记技术，在甘薯育种中应用较多的是RAPD、AFLP、ISSR、SCAR和SNP等。
3.1 构建甘薯分子遗传图谱
由于甘薯的遗传背景较复杂，对甘薯基因组的研究较滞后，分子标记的数量和种类相对匮乏，分子遗传图谱的构建要落后于水稻、玉米等作物。Kriegner等[14]在2003年用AFLP技术构建了首张甘薯遗传连锁图，632个母本标记和435个父本标记分别排列在Tanzania的90个连锁群和Bikilamaliya的80个连锁群上，共定位了1 100个AFLP标记，平均遗传距离为5.9 cM。随着甘薯栽培种转录组测序的完成和分子标记技术的发展，李爱贤等[15]在2010年利用SRAP标记构建了漯徐薯8号和郑薯20连锁图谱，漯徐薯8号的81个连锁群由473个SRAP标记组成，总图距为5 802.46 cM，标记间距为10.16 cM，郑薯20的66个连锁群由328个SRAP标记组成，总图距为3 967.90 cM， 标记间距为12.02 cM。Zhao等[16]在2013年利用AFLP和SSR标记构建了徐781（高抗茎线虫病）和徐薯18（高抗茎线虫病）的连锁图，徐薯18的90个连锁群含有1 936个AFLP和141个SSR标记，总图距为8 184.5 cM，标记间距为3.9 cM；徐781的90个连锁群含有1 824个AFLP和130个SSR标记，总图距8 151.7 cM，标记间距为4.2 cM。这也是到目前为止标记密度最高、基因组覆盖率最广的甘薯栽培品种分子标记遗传图谱。
3.2 绘制指纹图谱，鉴定甘薯品种
甘薯是一种无性繁殖作物，其品种数量多、同种异名、同名异种的情况比较普遍，在甘薯的生产过程中容易出现品种间混淆的情况，使得品种鉴定困难，影响品种的改良和育种。随着分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术已成为指纹图谱构建和品种鉴定的主要方法。指纹图谱能够在分子水平上鉴别生物个体之间的差异，可以有效克服形态和生化上的局限性，是甘薯品种鉴别的重要工具，在生产实践上具有重要意义。
目前用来作DNA指纹图谱的标记主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP等。Arthur等[17]应用RAPD标记分析在美国8个州种植的甘薯品种“Jewel”的无性系，发现其中5个的多态性谱带在7.1%～35.7%之间，表明RAPD标记可以检测无性系中的变异。王红意等[18]研究表明通过RAPD标记产生的指纹图谱可以将30个中国甘薯主栽品种分为3类。罗忠霞等[19]采用EST-SSR标记，利用2对引物将52份甘薯品种区分开，建立了52份甘薯品种的指纹图谱。季志仙等[20]利用ISSR技术对不同引物获得的指纹图谱进行了分析，发现利用2对引物即可将供试的17份甘薯品种区分为4类。蒲志刚等[21]利用AFLP技术通过五对引物构建出47个品种南瑞苕的指纹图谱，将其分为5类。张安世等[22]利用SRAP技术通过2对引物构建出22种甘薯品种的DNA指纹图谱，将其分为7类，随后又利用ISSR技术通过3对引物将22种甘薯品种分为4类[23]。
3.3 甘薯基因定位和DNA分子标记辅助选择育种
甘薯许多重要的农艺性状如块根产量、品质（淀粉含量、胡萝卜素含量）、抗病性（茎线虫病、根腐病和黑斑病）等都属于多基因控制的数量性状，在甘薯分子连锁图谱的基础上，对重要农艺性状进行QTL定位，进而克隆相关性状的主效基因，是甘薯育种研究的重要方向。DNA分子标记辅助选择育种具有方便、快捷、准确等特点，且较少受季节、发病条件、发育条件、鉴定方法等因素的限制，可以在低世代进行早期选择，更适合目前育种的需要。目前该技术已广泛应用于甘薯的育种研究中。
Ukoskit等[24]利用甘薯易感根线虫病品种与抗根线虫病品种杂交，用760个RAPD引物对2亲本和F1分离群体进行分析，筛选出1个抗根线虫病的基因。柳哲胜[25]用RAPG法和改进的SSAP技术对农大603和徐薯18的基因组进行抗茎线虫病相关基因的分析，结果显示由片段54设计的引物在抗病和感病品种之间扩增出多态性带，推测片段54是与甘薯抗茎线虫病有关的RGA（Resistance gene analog），并得出甘薯MIPS基因可能与甘薯抗茎线虫病有关。周忠等[26]对高抗茎线虫病的徐781和高感茎线虫病的徐薯18的后代进行抗病性鉴定和RAPD分析，得到与抗茎线虫病基因相连锁的RAPD标记OPD0l-700，经证明，该标记可作为甘薯抗茎线虫病辅助育种的分子标记，并在甘薯育种尤其是抗病品种选育中发挥较大的作用。王欣等[27]利用对高抗亲本徐781和高感亲本徐薯18的F1分离群体的161个品系进行OPD01-700的克隆和测序，成功地将OPD689标记转化为SCAR标记，初步验证结果与田间鉴定结果基本一致，初步建立了甘薯抗茎线虫病育种分子标记辅助选择技术。袁照年等[28]以金山57×金山630的杂交F1分离群体为材料，按F1单株抗性分群，建立薯瘟病抗病池和易感池，分别以其为模板进行RAPD分析，结果显示其中S213-500在抗感池和易感池间显示多态性，可以作为抗Ⅰ型薯瘟基因的连锁标记，在鉴定甘薯抗I型薯瘟病方面具有应用价值。苏文瑾等[29]在已有的高抗根腐病品种徐薯18与高感品种胜利百号F1分离群体抗性鉴定的基础上，采用分离群体混合分析法（BSA）与AFLP技术相结合，发现显性标记Eco（45）-Mse（45）与感病基因连锁，对甘薯抗根腐病的遗传改良具有指导意义。蒲志刚等[30]以南薯88等12个抗感黑斑病品种为材料，建立了甘薯黑斑病的AFLP分子标记体系，并用该体系找到了与甘薯抗黑斑病紧密相关的特异性DN段，为甘薯抗黑斑病分子标记辅助育种奠定了基础。
吴洁等[31]利用甘薯高淀粉品种绵粉1号和甘薯低淀粉品种红旗4号杂交F1代分离群体采用SRAP分子标记，将1个与淀粉含量相关的QTL定位到绵粉1号遗传图的第三连锁群上。蒲志刚等[32]利用甘薯高淀粉品种绵粉1号与甘薯低淀粉品种红旗4号杂交F1代分离群体，在绵粉1号遗传图的第二连锁群上检测到E1M7-2可作为淀粉的临近QTL。李爱贤等[33，34]以高淀粉、低胡萝卜素含量的甘薯品种漯徐薯8号和低淀粉、高胡萝卜素含量的甘薯品种郑薯20杂交得到的F1分离群体，采用SRAP分子标记的方法在父本郑薯20的Z31连锁群上检测到1个与淀粉含量相关的QTL，并检测到17个与甘薯β-胡萝卜素含量相关的QTLs，其中10个定位在郑薯20图谱上，7个定位在漯徐薯8号图谱上。
3.4 甘薯转录组测序和分子标记的开发
转录组测序（RNA-seq）操作简单，不局限于已知的基因组序列信息，可获得低丰度表达基因，具有通量高、灵敏度高、成本低及应用领域广等优点。转录组研究是基因功能与结构研究的基础和出发点，利用新一代高通量测序，能够快速全面地获得某一物种目标细胞在某一特定状态下的全部RNA序列的信息，例如发现新转录本、了解基因的表达量、挖掘单核苷酸多态性（SNP）、结构性变异等[35]。目前，测序技术已成为分子生物学研究中最常用的技术。相比于其他作物，甘薯的基因数据资源极少，这给甘薯的分子生物学研究带来极大的不便。Gu等[36]应用Illumina的RNA-Seq技术对不同的甘薯组织与发育阶段进行高通量的转录组测序，通过对甘薯的转录组从头组装、基因注释和代谢通路分析，得到了大量重要的转录本信息，如淀粉合成、抗盐、抗旱、转座子和病毒等相关基因。Tao等[37]利用Illumina数字基因表达（DGE）标签分析甘薯的7个组织的转录组的差异，鉴定出大量的差异和特异表达的转录本，主要涉及病毒基因组的基因表达方式、淀粉代谢、潜在耐逆性和抗虫性等方面。
转录组测序的高通量特点使分子标记的大规模发掘得以实现。基于转录组测序开发的分子标记主要为SSR和SNP。Wang等[38]采用同样的方法获得56 516个unigenes，基于与已知的蛋白序列的相似性搜索，总共鉴定发掘出114个cDNA的潜在的SSRs。Xie等[39]通过对紫薯转录组的高通量测序，获得58 800个unigenes，发掘出851个潜在的SSRs。SNP是基因组中最普遍的遗传变异，有着分布广、数量多、遗传稳定性高、密度高、易于实现分析自动化等诸多优点，是构建遗传图谱、完成分子标记辅助育种的一种非常重要的遗传标记，新一代的高通量测序平台为SNP位点的检测提供了强有力的技术支持。许家磊[35]在淀粉含量、薯干产量和茎线虫病抗性差异明显的徐781和徐薯18的Illumina RNA-seq测序结果中已获得1 386个SNP候选位点的基础上，发现Tetra-primer ARMS-PCR可以检测出SNP分子标记，可以用于甘薯SNP分子标记的开发。苏文瑾等[40]利用简化基因组测序技术（SLAF-seq）对300份甘薯种质资源的大群体测序，通过生物信息学分析进行系统设计，筛选特异长度的DN断，构建SLAF-seq文库后高通量测序，通过软件分析比对，获得260 000个多态性SLAF标签，在多态性SLAF标签上共开发得到795 794个群体SNP位点。
4 甘薯基因工程
1983年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基因技术改良植物的开始，至今已有120多种植物转基因获得成功。近年来基因工程技术在农业作物育种领域已经取得成功并逐步推广，基因工程技术已成为普及应用最快的先进农作物改良技术之一。基因工程技术是提高作物产量和改良作物品质的有效途径，给人类带来巨大的社会和经济效益。相对于其他作物，甘薯基因工程的研究起步较晚。自1987年以来，许多学者陆续报道把抗性基因nptII和标记基因Gus转入甘薯，成功地获得了转基因的愈伤组织、芽或再生植株，为进一步转化目的基因改良甘薯积累了经验[41]。近年来，在应用基因工程提高甘薯蛋白质或淀粉含量、改善蛋白质氨基酸组成或淀粉组成、提高甘薯抗虫及抗逆性等方面取得了较大进展。
4.1 甘薯品质改良的基因工程
甘薯品质改良主要集中在淀粉、蛋白质和胡萝卜素方面。Shimada等[42]构建了编码甘薯淀粉分支酶的IbSBEII基因的dsRNA干扰载体并通过农杆菌转化进入甘薯基因组，转基因植株的淀粉具有较高的直链淀粉含量。Otani等[43]通过RNA干扰技术抑制甘薯淀粉粒附着性淀粉合成酶I（GBSSI）基因的表达，培育出不含直链淀粉的转基因甘薯植株。Takahata等[44]通过抑制淀粉合成酶Ⅱ（SS Ⅱ）的表达改变支链淀粉的结构降低甘薯淀粉的糊化温度。Santa-Maria等[45]从海栖热袍菌中克隆了一个编码极端嗜热α-淀粉酶的基因，通过根癌农杆菌介导的转化获得的转基因植株在80 ℃具有自发处理淀粉为可发酵糖的能力。
罗红蓉等[46]用根癌农杆菌介导获得了含人乳铁蛋白基因（hLFc）的甘薯抗性愈伤组织，为获得具有转人乳铁蛋白基因的甘薯材料奠定了基础。高峰等[47]获得了转玉米醇溶蛋白的转基因甘薯植株。脂联素（Adiponectin）具有抗炎、增加机体对胰岛素敏感性和降糖、抗动脉粥样硬化的作用。Berberich等[48]利用根癌农杆菌介导的转化获得表达Adiponectin cDNA的转基因甘薯植株。Kim等[49]利用RNAi沉默CHY-β基因，可以增加甘薯中的β-胡萝卜素的含量和类胡萝卜素含量。
4.2 甘薯抗病虫的基因工程
甘薯病毒、病虫害严重影响产量。Kreuze等[50]研究利用靶向编码SPCSV（甘薯褪绿矮化病毒）和SPFM（甘薯羽状斑驳病毒）序列复制酶的内含子剪接的发夹结构的RNAi策略通过根癌农杆菌转化甘薯，转基因植株对SPCSV和SPFMV的抗性显著增强。Muramoto等[51]的研究表明，转大麦αHT基因的甘薯植株的叶片和块根表现出对黑斑病菌的抗性。蒋盛军等[52]用根癌农杆菌介导法将OCI（水稻巯基蛋白酶抑制剂基因）导入甘薯品种栗子香中获得了转基因植株，对转基因甘薯植株对甘薯线虫病的抗性进行了初步研究。
[43] OTANI M，HAMADA T，KATAYAMA K.Inhibition of the gene expression for granule- bound starch synthase I by RNA interference in sweet potato plants[J]. Plant Cell Reports，2007， 26（10）：1801-1807.
[44] TAKAHATA Y，TANAKA M，OTANI M. Inhibition of the expression of the starch synthase II gene leads to lower pasting temperature in sweetpotato starch[J].Plant Cell Reports，2010， 29（6）：535-543.
[45] SANTA-MARIA M C，YENCHO C G，HAIGLER C H. Starch self-processing in transgenic sweet potato roots expressing a hyperthermophilic α-amylase[J]. Biotechnology Progress，2011， 27（2）：351-359.
[46] 罗红蓉，张勇为，张义正.根癌农杆菌转化甘薯高频获得抗性愈伤组织的研究[J].四川大学学报（自然科学版），2002，39（增刊）：21-24.
[47] 高 峰，龚一富，林忠平.根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生[J].作物学报，2001，27（6）：751-756.
[48] BERBERICH T，TAKAGI T，MIYAZAKI A. Production of mouse adiponectin，an anti-diabetic protein，in transgenic sweet potato plants[J]. Journal of Plant Physiology，2005，162（10）：1169-1176.
[49] KIM S H， AHN Y O，AHN M J. Down-regulation of β-carotene hydroxylase increases β-carotene and total carotenoids enhancing salt stress tolerance in transgenic cultured cells of sweetpotato[J]. Phytochemistry，2012，74：69-78.
[50] KREUZE J F， KLEIN I S， LAZARO M U. RNA silencing-mediated resistance to a crinivirus（Closteroviridae） in cultivated sweetpotato（Ipomoea batatas L.） and development of sweet potato virus disease following co-infection with a potyvirus[J]. Molecular Plant Pathology，2008，9（5）：589-598.
[51] MURAMOTO N， TANAKA T， SHIMAMUR A. Transgenic sweet potato expressing thionin from barley gives resistance to black rot disease caused by Ceratocystis fimbriata in leaves and storageroots[J].Plant Cell Reports，2012，31（6）：987-997.
[52] 蒋盛军，刘庆昌，翟 红.水稻巯基蛋白酶抑制剂基因（OCI）转化甘薯获得转基因植株[J].农业生物技术学报，2004，12（1）：34-37.
[53] BIAN X F， XIE Y Z， GUO X D. Research advance on molecular mechanism of abiotic and biotic stress resistance in sweet potato[J]. Agricultural Science and Technology，2014， 15（6）：901-906.
[54] 阮 龙，高正良，陈义红.干旱耐逆基因（HS1）转化甘薯获得转基因植株[J].激光生物学报，2010，19（4）：552-556.
[55] 闫 会.表达Cu/ZnSOD和APX的转基因甘薯植株的再生与耐盐性评价[D].北京：中国农业科学院，2013.
[56] 李建梅，邓西平.干旱和复水条件下转基因甘薯的光合特性[J].水土保持学报，2007，21（4）：193-196.
[57] 王 欣，过晓明，李 强.转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/Zn SOD和APX基因甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）耐盐性[J].分子植物育种，2011，9（6）：754-759.
[58] 成雨洁，伍小兵，邓西平，等.干旱胁迫下转基因甘薯块根膨大期水分利用效率和生理代谢特征[J].西北植物学报，2012，32（11）： 2255-2263.
[59] KIM S H， AHN Y O， AHN M J. Down-regulation of β-carotene hydroxylase increases β-carotene and total carotenoids enhancing salt stress tolerance in transgenic cultured cells of sweetpotato[J].Phytochemistry，2012，74：69-78.
[60] KIM Y H，KIM M D，PARK S C. SCOF-1 expressing transgenic sweetpotato plants show enhanced tolerance to low-temperature stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（12）：1436-1441.
[61] 陈晓丽，李红兵，孙振玫.过表达IbMYB1基因甘薯增强了对土壤干旱胁迫的抗性[J].植物生理学报，2015，51（9）：1440-1446.
[关键词]人体基因；法律意义；客体性质
[中图分类号]D920.4 [文献标识码]A [文章编号]1671-5918（2015）12-0094-02
一、人体基因的基本认识
（一）基因的概念
基因是指DNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。人体基因是人体特定的DNA分子片段，它携带者人类生老病死的全部遗传信息。DNA分子上有的片段带有遗传信息，有的片段不带有遗传信息，而带有遗传讯息的DN段就被称为基因，而那些不带有遗传讯息的片段就不是基因。
（二）人体基因的生物学认识
首先，它是一段核苷酸序列。DNA是碱基构成的双螺旋结构的长链，这些碱基统称核苷酸。人体基因实际上是DNA分子上的一个片段，因此也是一段核苷酸序列。其次，它具备固定的排列顺序。核苷酸要排成一定的次序，才能决定一种蛋白质的分子结构。所以，人体基因的排列也是有固定的顺序的。第三，人体基因里必须包含遗传信息。不是任意一段连续的DNA都具有“基因”的功能，只有携带有遗传信息控制和编码的相对保守性标志的DNA序列才能成为基因。就人体基因而言，它必须包含着人体的遗传信息。
（三）人体基因的生物学作用
人体基因可以决定人的生命种类，孕育人的生命形态。不同种类的基因将孕育出不同种类的物种，人体基因将孕育出“人”这种物种。同时，它可以决定人体的性状。它不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达，使后代表现出与亲代相似的性状。基因不同，人的高矮胖瘦，黑白美丑等也不同。此外，“许多非传染性疾病直接与一个人的基因有关。正常基因在自身复制过程中或在外界条件发生改变的情况下，有可能发生基因突变而形成缺陷基因。缺陷基因的最大危害在于使人患上遗传病。”可见，人类所有疾病或健康状态与基因都有直接或间接的关系，人体基因与人的健康密切相关。
二、人体基因研究的法律意义
无论从宏观上还是从微观上来说，对人体基因进行研究，尤其是对其客体地位进行研究都具有十分重要的法律意义。本文主要从其微观的角度对其法律意义做一个简单的分析。
（一）有利于促进人体基因生物科学技术研究的良性发展
这主要表现在有利于规范基因工程行为和基因治疗行为。基因工程也叫遗传工程，是非常先进的技术，但对于该行为如何定性和规范，人体基因到底属于谁等问题都只有在明确了人体基因的客体性质后得到解答，从而规范基因工程的实施行为，进而为生物科学家们在生物技术领域的工作开展提供法律依据。而现已拥有用正常基因弥补缺陷基因治疗某些遗传性疾病的方法。对人体基因客体性质进行研究，将可以保障基因治疗活动的顺利开展。
（二）为预防和惩治人体基因犯罪行为作前期法学研究
学界对基因犯罪的概念探讨不多，但基因犯罪行为确有存在的可能性。现实中可能出现功能性犯罪行为，即利用基因技术进行犯罪；也可能出现滥用基因技术，从而形成犯罪的行为。无论是哪一种基因犯罪行为都会带来十分严重的危害性。我们需要加强对人体基因客体性质的研究，为预防和惩治行为人利用人体基因进行犯罪的行为提供前期的法学基础。
（三）规范“基因识别卡”的制作，防止基因信息泄漏和基因歧视
“基因识别卡”，即“基因身份证”，是发展起来的一项新技术。它与普通身份证大小一样，但不具法律意义。其中的信息表述了一个人生活方面的全部秘密，如果违背了个人的主观意愿，利用或公开个人有关的信息就很容易地对其人格利益造成重大的损失，而可能发生由基因差别产生的歧视。“基因歧视”自提出至今，已经被广泛使用。人体基因的巨大作用也决定了基因歧视会给人造成最深层次的伤害。因此我们应该规范“基因识别卡”的制作，防止因建立“基因识别卡”而带来的基因信息的泄漏以及“基因歧视”行为的出现。
三、人体基因的法律客体性质
（一）我国现有法律客体的反思
民事权利客体又被称为民事法律关系客体。我国通说认为民事权利客体有物、行为、智力成果和人身利益等。随着时代的发展“信息”被广泛关注。传统民事权利客体体系中却没有“信息”的存在。不可否认的是信息已然出现，并且无法被现有的法律客体范围所涵盖的，它必须单列出来。信息的含义是广泛的，民法中也没有必要对所有的信息都加以保护，但是对部分必需的、无法被现有法律客体的范围所涵盖的信息则应当被确认保护。因此可以同对其他民事权利客体的内涵规范一样，设定一定的标准来进行有限的并且是积极有效的保护。
（二）人体基因的法律客体属性的学说观点
人体基因的法律客体属性与人体基因的权利属性密切相关。人体基因权利属性的确定直接关系到人体基因权利保护的体系和内容。关于人体基因的权利属性，学界主要有以下观点：
（1）人格权说。身体是人格权中“身体权”的客体，尚未与身体分离的基因，可直接适用身体的法律地位；同时基因具有“人身专属性”，基因就是这个人本身，是人格权的客体，具有人格性。该说看到了人体基因的“身体之一部分”和“人身专属性”的特点，但它忽视了基因的生物学作用和基因对一个人的影响力；（2）财产权说。此学说认为基因信息具备许多财产的特征，形成“财产说”。它侧重于人体基因运用中的巨大“经济价值”，但实际上它并没有看到人体基因与人身之间的关系；（3）知识产权说。该说认为基因不仅是单纯的物质，还具有“人身专属性”。它强调了人体基因不仅是一种物质，还存在人身利益，这也是不对的，因为法律上的物是指有体物、特定物、独立物，而人体基因事实上是一段按一定顺序排列的一个序列，并不具有物的特征；（4）人格权、财产权并存说。该说认为当基因在身体内时就对基因以人格权的客体进行保护；当基因离开身体的时候就以财产利益进行保护。基因是DNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列，不会因为位置的改变而改变，因此该说混淆了基因与人体器官的概念；（5）人类共同财富说。该学说认为每一个人的基因都不完全是自己的，而是祖先经无数年的演化发展，一代一代遗传下来的，人体基因是全人类的共同资源财富。该说主要强调了人体基因“世代遗传”的特性，这是对的，但是我们这里强调的是对个人基因的法律性质进行研究，而不是强调宏观上的一个体系。
（三）人体基因的法律客体性质
1.人体基因是一种民事信息。民法上的信息即民事信息，是指受民法调整的以声音、语言（包括计算机语言）、文字、图像、动画等符号方式对事物进行表现的、关于平等主体之间的人身关系与财产关系的非物质内容。基因是DNA分子上具有遗传信息的一段序列。“序列”的意思是按次序排好的行列，不是一个物，物只是它的载体。它也是确定的，可以被人类所控制的，独立的存在的。同时，人体基因对人巨大作用就说明了它是有价值的。因此，人体基因满足民事信息的所有属性，它是一种民事信息。
2.人体基因是一种人身性质的信息。民事信息客体可以分为财产性质的信息与人身性质的信息。人身性质的信息第一属性便是与人身相关，它与民事主体自身的主体资格密不可分。人体基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达。它包含着决定人类生、老、病、死以及精神、行为等活动的全部遗传信息，具有“人身专属性”。因此人体基因是一种人身性质的信息，而不是一种财产性质的信息。
3.人体基因是自然人最机密、最根本的人格信息。人身性质的信息可以分为身份信息和人格信息。人格是指人作为权利、义务主体的资格。人体基因是人生而具备的，不是因为后天被“赋予”的，因此它是一种人格信息而不是一种身份信息。
人体基因具有隐私属性，但不是一般的隐私信息，仅仅归纳入隐私权进行调整是不够的。人格信息有很多种，例如人的身高、体重、身体机能的各项指标等。这些信息也是一种隐私信息，如果被窃取可能会对人产生不利影响，但是一般不会危害到人最宝贵的生命和健康。而如果一个人的基因信息被不法获取之后可能会被不法利用，给人的生命健康造成影响。这种影响无疑是巨大的、无法挽回的。因此可以说人体基因是自然人最机密、最根本的人格信息，它应当被特殊保护而不是仅仅规定在一般的隐私信息中。
参考文献：
[1]孙明.基因工程[M].北京：高等教育出版社，2006.
1K．marxianus生产酶类
K．marxianus在产酶方面的应用是其在现代工业生物技术应用过程中的最重要的组成部分之一。实验结果表明，K．marxianus可以分泌产生十余种工业生物技术领域的水解酶(表1)。K．marxianus在生产酶类方面具有的优势，除去本身的耐高温、生长快等特点，还可以利用较为廉价的底物或者诱导物，如乳清和玉米浆［4］等发酵生产酶类，是工业生产过程中获得更为廉价、更多种类酶类的重要保证。同时，一些热稳定酶类如脂肪酶、葡萄糖苷酶等均可以从K．marxianus的培养过程中获得。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或者乳糖酶可以水解奶制品中的乳糖供许多乳糖不耐症患者食用，可以解决乳清的处理问题，而且还能生成一种功能性食品 添加剂———低聚半乳糖，促进人体内双歧杆菌等益生菌增殖，在食品和医药工业中具有重要应用。目前的商业用半乳糖酶一般来自于乳酸克鲁维等菌株，但其分泌效率太低。K．marxianus是近年来备受关注的产酶菌株，其产生的半乳糖苷酶是一种诱导酶，在葡萄糖培养基中表达量不高，在含有乳糖的培养基中能够得到较高产量的半乳糖苷酶。但也有研究表明一些其他的廉价底物也可以作为诱导物用于K．marxianus半乳糖苷酶的生产，如玉米浆。以100g/L的玉米浆为底物，K．marxianus所产半乳糖苷酶比用乳糖为培养基时高20%。此外，溶氧对半乳糖苷酶的生产至关重要，当搅拌转速/通气速率为700r/min/0．66vvm时，半乳糖苷酶的产量比在500r/min/2vvm时高50%。采用γ-射线对K．marxianus进行诱变后，提高了β-半乳糖苷酶的产量及对热的耐受性，敲除转录抑制因子Mig1的突变株K．marxianusKM实现了β-半乳糖苷酶的过表达，达到121．0U/ml。同时，由于半乳糖苷酶是胞内酶，为了提高其水解乳糖的效果，纯酶的使用更能满足产业化需求。因此，研究半乳糖苷酶分离纯化方法，是满足其工业化使用的必要前提。
菊粉酶是一类能够水解β-2，1果糖糖苷键的水解酶，按其作用方式，可分为内切型菊粉酶(o-inulinase)和外切型菊粉酶(ex-inulinase)。目前，菊粉酶广泛应用于低聚果糖和高果糖浆生产、以及菊芋乙醇生产等多个领域。但到目前为止，国内外学者关于菊粉酶的研究大多注重产酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因克隆等方面，涉及菊粉酶分泌表达调控的报道极少。菊粉酶的表达调控机制十分复杂，而且表现为明显的菌种依赖特性。目前还没有完整的调控体系了解其合成过程，严重阻碍了菊粉酶在工业化中的应用。菊粉酶的分泌除受底物诱导、分解物阻遏外，还与发酵体系中的溶氧和氮源等因素密切相关。克鲁维酵母菊粉酶的表达受到分解产物的阻遏，该阻遏是发生在转录水平，但对于其中的调控机制仍不清楚。碳源代谢抑制因子CreA和糖代谢激活因子InuR在菊粉酶表达调控中具有重要作用。Silva-Santisteban等发现在葡萄糖、果糖和蔗糖中，菊粉酶分泌的细胞外动力学相似，但是蔗糖浓度对菊粉酶活力影响很大，而且富含O2的空气，既不能提高菊粉酶的产量也不能抑制乙醇的生产。菊粉酶的活性是采用集成生物加工策略(CBP)发酵菊芋生产乙醇的最关键因素。因此，研究和了解菊粉酶的相关调控机制，对于菊粉基原料的CBP技术的发展至关重要。我们实验室研究了K．marxianusYX01菊粉酶的表达调控的相关影响因素，结果表明菊粉对菊粉酶的产生具有一定的诱导作用，而葡萄糖对产酶过程有一定程度的抑制作用;碳源浓度对K．marxinausYX01产酶具有较为显著的抑制作用，当菊粉浓度为60g/L时，菊粉酶的活性仅有20g/L时的50%。通气量对菊粉酶分泌有较大影响，当通气量超过0．5vvm时，菊粉酶活力可达到不通气时的4倍。外加高浓度乙醇对细胞生长有明显的抑制作用，但并没有影响菊粉酶分泌，而且对于分泌到胞外的菊粉酶，其活性基本不受外加乙醇的影响。菊粉酶的产生与乙醇发酵条件是矛盾的两个方面，阐明乙醇发酵条件下菊粉酶分泌及相关代谢调控机制，是提高菊粉酶活性进而提高生产效率的关键。
多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase，PG)能够随机地水解两个非甲基化的半乳糖醛酸间的α-1，4-糖苷键，在水果和蔬菜加工领域具有重要应用。PG除在高等植物、霉菌和细菌中存在，也存在于蜗牛的消化液中。但商业化应用的半乳糖醛酸酶除含PG活性外，还存在不需要的甲酯酶(PE)和淀粉酶。K．marxianus能够分泌PG而无PE活性，是生产多聚半乳糖醛酸酶的理想菌株。目前影响K．marxianusPG合成因素的研究主要集中在碳源和溶氧两个方面。溶氧是PG合成过程中的限制因素，无氧条件有利于PG的积累，而随着溶氧浓度的增加，PG合成明显受到抑制，甚至停止分泌。同时碳源对于PG的合成也具有不同程度的影响。研究结果表明，果胶的添加有助于PG的合成分泌，而半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸或乳糖抑制了PG的合成，甚至使其无法表达。因此，合适的微氧环境(同时满足单细胞生长及PG生产的必须)及碳源诱导物的添加将是K．marxianusPG合成研究的重要方向。脂肪酶广泛应用于有机化学合成、医药、食品、皮革、生物转化等多个领域。K．marxianus分泌的脂肪酶由于具有明显的热稳定性而受到广泛关注。而且以K．marxianus作为宿主异源表达酯酶(或脂肪酶)为酯酶的研究提供了新的方向。K．marxianus能够分泌β-葡萄糖苷酶、木糖酶等纤维素水解所需的酶类，在纤维素降解过程中起重要作用。过氧化物歧化酶(SOD)［34-35］、氨肽酶等也均见于K．marxianus分泌产物中，它们也都是因其较高的热稳定性而被人们所关注。但是对于这些低产量酶来说，浓缩以及分离纯化技术的研究显得尤为重要。110综上所述，K．marxianus所产不同种类的水解酶在生产过程中具有不同的优势与缺点，但就总体而言仍停留在实验室阶段，并未真正实现工业化，主要的问题就是如何尽可能提高其产酶水平来达到工业化的要求。据文献报道，克鲁维酵母与酿酒酵母不同，属于Crabtree-negative，因此其生长发酵的调控机制存在差异。最基础的方式可以采用培养条件的优化在一定程度上提高酶活力;进一步研究产酶过程对于氧气传递的响应，全面理解氧气在产酶过程中的重要作用;最后可以采取突变育种或者基因工程改造的方式，获得较为高产的菌株。另外，对于酶的分离纯化工艺的研究，也将是推进其工业化进程的重要方面。
2K．marxianus乙醇发酵
生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品，是公认的最有可能替代化石能源的生物质能源之一。而K．marxianus因其较为广泛的碳源谱，是现今利用廉价原料生产乙醇的理想菌株。K．marxianus能够在较高温度的条件下发酵乙醇，为工业生产过程大大节约了成本，并减小了污染的可能性。表2给出了K．marxianus利用菊芋、糖蜜、乳清、纤维素等不同底物产乙醇的情况。菊芋(Jerusalemartichoke，JA)以其耐瘠薄、耐盐碱、抗干旱和生物质产量高等优点被国家列为重点发展的非粮能源植物，其块茎中的主要成分是菊粉，占干重的60%～70%，由果糖残基经β-2，1糖苷键脱水聚合而成，末端为一个葡萄糖分子，可以通过酸解和酶解等途径转化为易于发酵的果糖。以菊芋作为燃料乙醇的底物已进行了广泛的研究，其中利用同时具有产菊粉酶和乙醇发酵能力的克鲁维酵母进行乙醇发酵(CBP技术)是最有希望实现工业化生产的技术路线，但仍然存在发酵时间长、终点乙醇浓度低及剩余残糖高等缺点。最近，有学者报道了综合利用菊芋秸秆和块茎，进行全生物质的发酵过程，也为菊芋乙醇的工业化提供了更为全面的保证。我们实验室对于利用菊芋生产乙醇进行了大量的工作。筛选得到的K．marxianusYX01，以菊粉为底物，发酵终点乙醇浓度92．2g/L，达到理论值的85．5%;同时开发了批式补料工艺，菊芋干粉生料发酵的终点乙醇浓度达到94．2g/L。通过添加辅助酶制剂及换用不同的搅拌桨，进一步降低发酵过程中醪液黏度大的问题，使乙醇的终浓度及收率得到提升，为其工业化生产奠定了基础。但是，我们实验发现在相对无氧条件下乙醇得率高于有氧条件，而发酵时间却大大延长，这严重制约了菊芋乙醇的工业化进程。因此，今后的工作将从提高限氧发酵过程中菊粉酶活力或调控发酵过程的通气量来达到在较短发酵时间下实现更高的乙醇得率。K．marxianus可以直接利用乳清中的乳糖生产乙醇。乳清是干酪和干酪素生产过程中的一种副产品，主要成分为乳糖(74%)，其次还有一些蛋白质、矿物质和脂肪等，是一种理想的生产乙醇的廉价原料。发酵乳清生产乙醇还可以解决乳制品生产中废水排放的问题。但是，一般来说乳清中的乳糖含量较低，使得发酵终点的乙醇浓度较低，增加了后续蒸馏成本。但是，通过培养条件的不断优化，利用乳清中的乳糖直接生产乙醇的规模化生产也将越来越具有竞争力。
对于K．marxianus发酵糖蜜生产乙醇的报道也比较广泛。糖蜜是制糖工业的一种副产品，也是一种较为理想的廉价材料。糖蜜种类较多，包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜等，不同种类的糖蜜糖含量、糖种类具有差异。以甘蔗糖蜜为例，其还原糖总量可以达到50%～60%(w/v)，其中蔗糖占60%左右。此外，糖蜜中还含有一些氮源、生物素等促进细胞生长的物质，但同时也含有一些对细胞有毒害作用的物质。在使用糖蜜为碳源时，由于糖浓度较高，要求细胞耐渗透压的能力好，对乙醇的耐性也要求较高。利用秸秆等纤维素原料生产乙醇一直都是人们关注的重点，廉价的原材料可以更大程度地降低燃料乙醇的生产成本，使其在燃料市场上具有更强的竞争力。秸秆中主要含有40%左右的纤维素，还含有半纤维素、木质素和灰分等组分，水解后得到的葡萄糖、木糖等可以被微生物利用生产乙醇。同步糖化发酵工艺(SSF)由于能降低分解产物对纤维素酶的抑制作用，是纤维素乙醇生产最有前途的工艺路线。从目前的研究来看，纤维素酶的最适温度为50℃左右，与大多数微生物生长的最适温度30℃或者37℃不一致，使得SSF发酵过程效率很低。K．marxianus具有在高温条件下生长并产生乙醇的特性，所以利用K．marxianus实现纤维素乙醇的同步糖解共发酵，是未来纤维素乙醇的重要研究方向。来源于Aspergillusniger的内切β-1，4葡聚糖酶(o-β-1，4-glucanase，EG)基因和来源于Thermoascusaurantiacus的β-葡糖苷酶(β-glucosidase，BGL)基因、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)基因已成功地整合于K．marxianusNBRC1777基因组，在45～50℃条件下，实现了纤维素酶的功能表达，为今后更好地实现同步糖化发酵纤维素类原料生产乙醇奠定了基础;此外，纤维素降解后含有35%左右的五碳糖，很难被常规的乙醇发酵微生物如酿酒酵母所利用。K．marxianus可以利用木糖等生产乙醇，在五碳糖的利用方面具有较为明显的优势。但是，K．marxianus利用木糖的速率方面及乙醇的产率还需要进一步提高。以K．marxianus为宿主，利用表面展示的方法，将纤维素降解所需的各种酶类如EG、BGL、CBH及木聚糖利用的酶类如木糖苷酶、木糖转运酶等表达，构建联合加工菌株(CBP菌株)，可能是未来解决纤维素乙醇生产的途径。
3K．marxianus作为宿主表达外源蛋白
酵母细胞用于外源蛋白的分泌表达一直受到人们的广泛关注，S．cerevisiae、P．pastoris等研究相对成熟的表达系统以其适于大规模生产、翻译后修饰系统较为完善以及无内毒素污染等优点而被研究人员广泛应用。但同样酵母细胞也具有信号肽加工不完全、诱导周期长等缺点。近年来，K．marxianus作为宿主细胞用于表达外源蛋白方面的应用越来越多。三种表达系统的优势和不足见表3。正是由于K．marxianus在表达外源蛋白方面所特有的优势，对其进一步的研究以及开发利用显得更为重要，而且随着研究和应用的深入，K．marxianus作为宿主表达外源蛋白将能更好地弥补另两种酵母的不足，取长补短，更加深化酵母宿主表达外源蛋白的应用。
3．1K．marxianus表达载体、启动子以及转化方法的研究进展表达载体是基因外源表达的关键。最早应用于K．marxianus转化的表达载体，pGL2，出现在1984年。但是，真正使得K．marxianus作为表达宿主而受到人们关注是由于pKD1质粒的发现，pKD1质粒全长4．8kb，目前以其为基础而获得的多种杂交质粒已广泛应用于外源蛋白表达的研究中。启动子的选择决定了外源基因表达的成败。目前应用于K．marxianus表达系统的启动子分为三类:(1)其自身启动子，如PCLP，INU1［68-69］等，而且有实验表明，比起S．cerevisiae启动子，K．marxianus自身启动子会明显提高异源基因在其中的表达量。Bergkamp等使用INU1成功地实现了β-半乳糖苷酶的异源表达;(2)来源于S．cerevisiae启动子，如TDH3，GAL1等。目前针对它们的研究也较为广泛，许多S．cerevisiae中较为成熟、功能明确的启动子均可直接用于K．marxianus外源基因表达。Nonklang等以ScTDH3为启动子使得曲霉α-淀粉酶基因得到表达;Lee等测试了四种在S．cerevisiae较为常见的启动子应用于K．marxianus异源表达的情况，4种启动子表达强弱为PGPD＞PADH～PTEF＞＞PCYC，为今后异源基因在K．marxianus不同程度的表达奠定了基础;(3)非酵母启动子，如利用Tet-off［70］启动子构建的pTetGus载体成功地实现了β-葡萄糖醛酸酶基因的异源表达。适当的转化方法也在整个重组过程中发挥重要作用。一套由LiAc介导的K．marxianus细胞转化方法可以简单、快捷地用于K．marxianus的转化过程。而且DMSO对于转化过程具有抑制作用，而DTT具有促进作用，10mmol/L的DTT最适于转化过程的进行。多基因同时整合入K．marxianus染色体技术［73］的实现不但大大节省了人力与时间，也说明了K．marxianus作为宿主正在研究中逐步趋于成熟。
3．2典型外源蛋白在K．marxianus表达系统中的分泌表达K．marxianus作为宿主表达异源蛋白具有更高的分泌效率，这为后续的分离纯化以及工业化生产降低成本奠定了基础。研究表明，K．marxianus所表达的一种热稳定酯酶，50%左右分泌到了胞外，而相应的在K．lactis和S．cerevisiae中只有12%左右，而且在K．marxianus中，只有17%的酶存在于周质空间，但在K．lactis中达到了25%，在S．cerevisiae中，甚至超过了80%。负责酵母菌絮凝性状的絮凝基因成功地在K．marxianus中得到表达［71］，使其具有絮凝性状，可能会提高其对纤维素预处理过程中生成的有毒物质的耐性及乙醇耐性，为今后其在纤维素乙醇发酵中的应用提供了保证。对于K．marxianus外源基因的表达研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理论的不足，很多在S．cerevisiae和K．lactis中比较成熟的转化系统、启动子等都很难用于K．marxianus的表达过程，而且成功表达的基因在其蛋白产量、酶活力或者优良性状的获得方面还有待于进一步改善，蛋白或者酶的进一步分离提纯方法以及产量的进一步提高也有待于更多的研究。
4展望
关键词:高三生物复习 精心备课 提高课堂效率
生物学科具有知识点多,相互联系紧密、层次分明,颇有形散而神不散的特点。高三生物教学的主要目标就是让学生理顺众多知识点,理清知识点之间的相互联系,使知识网络间层次分明,解题时能再现相应知识点,经过加工、分析、判断得出合理的结论,从而提高高三学生的记忆能力、整理能力、分析能力、解题能力、联系发散的思维能力等。自江苏省实施新课改始,面对减时不减量这一矛盾,生物教师最迫切的问题就是如何提高四十五分钟的课堂教学教育的效率,尽量在有限的时间里,出色地完成高三生物教学任务,提高课堂效率。而要做到这一点,充分的课前准备必不可少。笔者认为课前准备的总体思路是:凡是能不在课堂上完成的事情,都不放在课堂上完成。
一、备学生
高三学习过程中,学习的压力很大,学生不可避免地会发生这样和那样的问题。性格外向的学生肯能会主动和老师交流,来解决学习、生活和心态上的问题,但性格内向的学生却不会。这就需要教师细心观察,主动和一些可能存在困难的学生进行探讨、交流和鼓励。对学生取得的进步加以肯定和表扬,对学生存在的困难给以建议和帮助,对学生发生的错误给予善意的批评和指正。情感上的交流,不仅能解决学生的很多问题和困难,还能大大拉近学生和老师的心理距离,使班级出现健康、积极的学习气氛。
笔者此前带的一个高三物理生物班,接手时问题很多,如作业不能及时完成,作业存在一定抄袭现象,课堂上有学生不注意听讲看课外书、玩手机,有的学生严重偏科,语数外在班上名列前茅,而物理和生物远远落后等。接手后,发现有问题及时找学生交流,从高三学习的紧迫感、高校学习生活的美好前景和一定的惩罚等措施,耐心分析讨论问题产生的原因、造成的后果、解决的方法,在班主任和各科任教师的一起努力下,班级学习面貌和风气大为转变,优秀生偏科得到有效改善,学困生的学习动力大大增强,班级各科成绩也显著提高。
二、备知识点
一轮复习,强调知识点的覆盖面要广,学生对知识点的记忆要牢。例:《生物的变异》中,对基因突变的实例、定义、突变原因、发生时期、突变性状能否遗传、突变的类型、特点、意义、诱变育种等知识点,都要复习到,要求学生做好记忆理解。并通过默写、老师抽查、学生相互检查等方式,了解学生对知识点的掌握牢固程度。
二轮复习要深挖,打破书本原有框架的束缚,进行横向和纵向的联系。例:《生物的变异》中,基因突变与生物进化的关系,对种群基因频率的影响,与基因重组和染色体变异的区别,诱变育种与杂交育种、基因工程育种的区别和联系等,都要串联起来,把众多知识点组成网络。《光合作用和呼吸作用》中,笔者结合近几年全国各地高考题,特别是2009年高考生物试题及其命题思路和考查的知识范围、能力要求等可以看出,新陈代谢是复习的重点;关于光合作用和呼吸作用的试题综合性强、灵活性很大、与农业生产联系紧密,是高考命题的重点、热点。因此在2010年的复习备考中,关于本专题的复习,应该从以下几个方面加以训练:第一、夯实基础,突出主干。在复习本节内容时,要对光合作用和呼吸作用的过程有个彻底的全面的掌握,要以光反应和暗反应的物质变化和能力变化为主线,影响光合作用的外界因素、叶绿体中色素的种类及吸收光谱等为主要内容,特别注意光合作用与呼吸作用等的联系。第二、强化高考热点题型的训练,提升解题能力。高考热点题型有:⑴实验设计类题型、⑵曲线图题型、⑶表格类题型等。在平时的训练中,应注重选择一些关于光合作用和呼吸作用方面的典型题目进行训练分析,掌握解题方法、技巧,培养理解能力、获取信息的能力、实验设计的能力和综合应用能力。第三、建构解题模型,精选变式习题。研究高考试题对生物复习具有指导作用,分析2009年高考试题,可以得出解题的思路,平时复习题应以追求质量为先,要在过去的高考试题中去寻找规律,这样才能精选出贴近高考试题的变式习题或模拟题,以提高复习效率。
三轮复习要强调热点和高频考点。例:近来2年江苏高考,对基因工程的考查一直都有,属于高频考点,则在复习中,对基因工程和蛋白质工程的复习更要重视和深化,在训练中作一定的题目量倾斜;现在的世界,环境问题日益突出,基因工程对环境问题的困扰和解决上,都要作正面和反面的分析。这两年,地震灾害非常频繁,对与地震中被困人体的调节过程、人体调节的极限和被困不同阶段人的应对原理,也要有一定的准备和应对。
三、备讲义
讲义是知识体系的载体。讲义应包括知识整理、典型例析、课堂训练、课后作业四个部分。知识整理,主要针对本课要复习的内容,以填空题、问答题的形式呈现,以帮助学生唤醒记忆,并找出记忆的遗漏和模糊的地方,加以巩固。典型例析,以近几年高考原题为例题,剖析题目的题眼、切入点、相关知识、组织答案的过程,力争充分暴露思维过程,让学生有法可依。并设计几条关于该题的变式训练,以加强对此类题目的理解应用。课堂训练,以本课复习内容为主,5条单选、1条多选和1条简答题,在10到15分钟内限时完成,以考查学生能力情况并发现其中的问题。课后作业,以综合题目为主,设计7条单选、2条多选、3条简答题,时间控制在30分钟左右。其目的是保持和加强学生对生物整体知识的敏感性。
四、备课件
高三复习课上使用的课件,不要求如比赛中的课件那样精雕细琢,只要以powerpoint简单写出文字和图形就行,强调的是实用性和快捷性。一般课件以知识整理、典型例析和变式训练为主,笔者准备一节课的课件完成时间在0.5小时左右,主要时间花在设计变式训练上。课件的使用目的是辅助讲义的使用,加强题目的直观性。上课时可以灵活应用,可以多讲,可以选讲,也可以不讲。总之是为课堂需要而服务,而不能因为顺应课件中知识的顺序和内容而改变课堂正常内容和节奏。
五、备作业
转移植物基因的两种方法
一种或多种外源性基因是如何转入另一种植物（作物）体内的呢？可以用一种通俗的比喻来解释。
例如，人类社会是由无数个家庭组成的，每个家庭都有固定的家庭成员，除了血缘的紧密纽带关系外，还有经济和其他的关系把家庭成员固定在一起，家庭成员不会轻易分离，同时一个家庭也不会让陌生人进入。一旦有另一名成员进入一个稳定的家庭，除非是特别亲近的亲属关系或收养关系，都会受到这个家庭成员的排斥，不可能被这个家庭接受，所以被称为“第三者”。
一种植物体内的染色体（DNA）中的基因也是固定的，轻易不能分开和分解，一个或几个外源性基因就是第三者，一般是不会被一种受体植物所接受的，如果受体植物发现了外源性基因，就会用自身的武器，如DNA酶来降解（杀灭）外来基因。因此，为了有效转移外源性基因，如将外源性的抗虫基因――苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）转移到棉花中，就得采取两种办法。一种是载体转移（包装法或间接法）；另一种是直接转移，或强行转移。
用载体作为媒介进行基因转移就是将目标基因连接或包裹于某一载体DNA中，载体通常是微生物，然后通过载体感染受体植物，将外源性基因转入植物细胞。直接转移是利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源性基因转入植物细胞。
所以，前一种方法是包装法，也是一种蒙蔽或欺骗方法；后一种方法是强硬的，有一点像陌生人或强盗强行闯入别人的家庭，并登堂入室，占据主要位置，或者说反客为主。
载体转移
载体转移又称为农杆菌载体转移。20世纪70年代末80年代初，研究人员发现，野生型Ri（根诱导）和Ti（瘤诱导）质粒可以转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株，此后，以Ti质粒为载体的植物转基因技术逐渐得到应用。今天，农杆菌介导的转基因法是最主要的一种载体转移方法。利用经过改造的农杆菌Ti和Ri质粒为载体可以高效地转移外源性基因。
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，分为根癌农杆菌和发根农杆菌，它们的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒。根癌农杆菌中的Ti质粒可以转化植物细胞而产生冠梁瘤，发根农杆菌的Ri质粒可以侵染双子叶植物而产生大量的不定根（或称之为毛状根）。
无论是Ti质粒还是Ri质粒，其上有一段转移DNA（T-DNA），农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将转移DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代，这就让农杆菌可以把一种或多种外源性基因转移到某种受体植物中。
最初研究人员发现，当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，因而吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中Ti质粒上的转移DNA转移到受伤的植物细胞（受体细胞），并且整合到受体细胞染色体的DNA中。在自然条件下农杆菌只是感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
因此，如果将一段目标基因（外源性基因）插入到Ti质粒的转移DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目标基因进入受体植物细胞，并将其插入到受体植物细胞的染色体中，使目标基因的遗传特性得以稳定维持和表达。抗虫的Bt基因就是这样被转移到棉花或玉米中的。当然，农杆菌介导法起初只用于双子叶植物的基因转移，但是，近年来随着基因工程技术的发展，农杆菌介导的转基因也在一些单子叶植物，尤其是水稻中得到广泛应用。
利用载体对植物进行外源性基因的具体转移过程如下：
一是获取目标基因，即在目标基因被克隆后，用限制性核酸内切酶切割下目标基因。
二是把目标基因与载体相连（构建载体），即用DNA连接酶将目标基因与载体（大多数选用质粒）连接起来。
三是将目标基因导入载体细胞，即把含目标基因的重组质粒导入农杆菌细胞。
四是对目标基因进行检测与鉴定，用DNA分子杂交技术和抗原-抗体杂交技术进行个体生物学水平鉴定，以确定农杆菌细胞中是否包含目标基因。
五是将成功表达外源性基因的农杆菌细胞导入受体植物（如棉花）内，然后再对受体植物进行目标基因的生物学鉴定，如果受体植物中有目标基因的表达，说明转基因获得成功。
目前，利用农杆菌载体进行外源性基因的转移是采用得最多的植物转基因方法。当然，除了Ti质粒和Ri质粒为载体的基因转移外，还可以用脂质体为载体进行基因转移。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，因此可将目标基因包装在脂质体内以避免受体植物细胞中的DNA酶将目标基因降解，从而保证目标基因转入到受体植物的细胞中。
所以，无论是利用农杆菌载体进行转基因，还是利用脂质体为载体进行转基因，都是通过包装的方法进行基因的转移，也能避免受体植物中的DNA酶排斥外源性基因。
直接转移
把外源性基因直接转移到另一种植物中也是一种强行转移。这正如陌生人要进入一户人家，没有钥匙进不了门，没有经过主人允许和开门也进不了门。但是，还有一种方法能进门，即强行入门，强行的方法就包括，撬掉门锁、敲碎窗户以及翻墙进入等。外源性基因的直接转移就是如此。
直接转移一种外源性基因到受体植物中也有多种方法，包括电穿孔法、基因枪法和微注射法（子房注射法）等。
1.电穿孔法
电穿孔法指的是，细胞在外加高压电脉冲电场的作用下，细胞膜表面产生疏水或亲水的105～115微米微小通道，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。在此期间生物大分子如基因片段可通过这种微小的通道进入细胞，因此能把外源性基因转入受体植物体内。
现在，这种方法已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物的基因转移，同时也应用于动物的基因转移。早在1995年，美国农业部研究所就用这种方法把两种着色剂――锥虫蓝和荧光素二乙酸盐直接转入到大豆、紫花苜蓿、烟草3种植物的细胞中，并获得高水平的基因表达。到了20世纪80年代末，研究人员也用电穿孔法将新霉素磷酸转移酶基因转入玉米自交系的原生质体，从而生成植株。此后，抗草甘膦除草剂的转基因大豆、棉花、玉米和油菜等也相继问世并获得广泛种植，方法也是采用电穿孔法。
现在，抗草甘膦除草剂的转基因作物已成为全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦杀死杂草的原理在于竞争性抑制植物叶绿体或者质体中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），这种酶是多种植物和杂草所共同拥有的。通过转基因的方法，让受体作物如棉花、玉米、大豆产生更多的EPSPS，就能抵抗草甘膦，从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。有了这样的转基因棉花、玉米和大豆，农民就不必使用多种除草剂，只需使用草甘膦一种除草剂就能杀死多种杂草。
2.基因枪法
基因枪法又称粒子轰击技术，是用粒子枪把表面吸附有外源性基因的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于根癌农杆菌仅对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物不敏感，从而限制了根癌农杆菌Ti质粒介导法（农杆菌载体）转移基因。但基因枪法不受宿主限制，宿主既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，它们也即受体植物。
基因枪法可控度高，同时不需要去除受体植物细胞的细胞壁，被转化的细胞或组织容易再生成植株。基因枪轰击过程中可根据需要将射弹射入特定层次（位置）的细胞，有利于提高转化效率。基因枪法操作简单、迅速，但费用较高。基因枪法主要用于转移植物基因，也可用于对动物、微生物等的基因转移。
现在利用基因枪法转基因技术获得的转基因园艺植物较少，只有杨树、云杉等，而获得的转基因水稻、玉米、烟草、大豆、木薯等作物较多。基因枪法现在还存在转化效率低、外源性基因向植物中插入不够精确和稳定性不高等缺点。
3.子房注射法
子房注射法也称微注射法。子房是被子植物生长种子的器官，位于花的雌蕊下面，一般略为膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以发育为种子。子房由子房壁和胚珠组成。当传粉受精后，子房发育成果实。子房壁最后发育成果皮，包裹种子，有的种类形成果肉，如桃、苹果等。
子房注射法就是使用微注射针或显微注射仪将外源性基因注入处于减数分裂期的受体植物的子房中，借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力，外源性基因可进入受精的卵细胞中，借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象，外源性基因被随机整合到受体作物的染色体上。
20世纪90年代，一些Bt转基因玉米就是用子房注射法进行转基因的，这种转基因玉米可以抗御玉米螟的啃食。目前，子房注射法成功用于玉米、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种。
