时间：2022-05-28 03:21:25
摘要：为研究鹅细小病毒（GPV）VP2蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果，本试验对GPV延边分离株的vp2基因进行原核表达，将Western-blot试验鉴定为阳性的表达蛋白进行乳化，免疫BALB/c小鼠，应用ELISA方法监测试验动物的体液免疫水平，以此评价该疫苗的免疫效果。结果表明，在三免后2d，重组蛋白佐剂组检测到的血清OD450nm值达0.687，而生理盐水阴性对照组为0.038，两者差异极显著（P
关键词：鹅细小病毒；基因工程亚单位疫苗；免疫试验
关键词：鹅细小病毒；基因工程亚单位疫苗；免疫试验
中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0171-1
中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0171-1
基金项目：吉林省自然科学基金面上项目（201215230），吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第200902号)。
基金项目：吉林省自然科学基金面上项目（201215230），吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第200902号)。
细小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，发病率和病死率均较高，临床一旦发病，无有效的治疗办法，严重危害本地区养鹅业的健康发展[1]。目前，国内外用于GP的预防主要以传统疫苗为主，基因工程疫苗尚属探索阶段，尚缺乏GPV基因工程疫苗诱导雏鹅细胞免疫和体液免疫的系统研究资料。在GPV的三个结构基因中，Le Gall-Recule等[2]利用杆状病毒表达系统，证明表达的番鸭细小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究拟对GPV的vp2基因进行原核表达，制备基因工程亚单位疫苗，并进行免疫试验分析，为GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
细小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，发病率和病死率均较高，临床一旦发病，无有效的治疗办法，严重危害本地区养鹅业的健康发展[1]。目前，国内外用于GP的预防主要以传统疫苗为主，基因工程疫苗尚属探索阶段，尚缺乏GPV基因工程疫苗诱导雏鹅细胞免疫和体液免疫的系统研究资料。在GPV的三个结构基因中，Le Gall-Recule等[2]利用杆状病毒表达系统，证明表达的番鸭细小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究拟对GPV的vp2基因进行原核表达，制备基因工程亚单位疫苗，并进行免疫试验分析，为GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
1 材料与方法
1 材料与方法
1.1 材料
1.1 材料
BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所；弗氏佐剂购自sigma公司；其他载体与试剂由延边大学预防兽医实验室提供。
BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所；弗氏佐剂购自sigma公司；其他载体与试剂由延边大学预防兽医实验室提供。
1.2 GPV延边株vp2基因工程亚单位疫苗的制备
1.2 GPV延边株vp2基因工程亚单位疫苗的制备
采用常规方法提取GPV延边株的基因组DNA，以特异引物[3]扩增vp2基因片段，构建原核表达载体pET30a-vp2，并在大肠杆菌中诱导表达，将Western-blot鉴定为阳性的蛋白进行亲和层析纯化，纯化后重组蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备GPV的基因工程亚单位疫苗。
采用常规方法提取GPV延边株的基因组DNA，以特异引物[3]扩增vp2基因片段，构建原核表达载体pET30a-vp2，并在大肠杆菌中诱导表达，将Western-blot鉴定为阳性的蛋白进行亲和层析纯化，纯化后重组蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备GPV的基因工程亚单位疫苗。
1.3 vp2基因工程亚单位疫苗的动物免疫试验
1.3 vp2基因工程亚单位疫苗的动物免疫试验
免疫试验共分3组，每组10只BALB/c小鼠，分别为接种VP2重组蛋白组，VP2重组蛋白加佐剂组和生理盐水对照组。在每一次免疫前采血分离血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分别采血分离血清，均存于-20℃备用。
免疫试验共分3组，每组10只BALB/c小鼠，分别为接种VP2重组蛋白组，VP2重组蛋白加佐剂组和生理盐水对照组。在每一次免疫前采血分离血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分别采血分离血清，均存于-20℃备用。
1.4 ELISA监测血清VP2抗体水平
1.4 ELISA监测血清VP2抗体水平
用纯化的VP2重组蛋白为抗原包被反应孔，以小鼠抗GPV阳性血清为一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。
2 结果
2 结果
2.1 GPV vp2基因的原达表达
2.1 GPV vp2基因的原达表达
对pET30a-vp2进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE与Western-blot试验表明，在经考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶上和NC膜上均出现VP2特异性条带（图略），百未诱导的重组菌未出现特异条带。
对pET30a-vp2进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE与Western-blot试验表明，在经考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶上和NC膜上均出现VP2特异性条带（图略），百未诱导的重组菌未出现特异条带。
2.2 GPV重组VP2蛋白的体液免疫水平
2.2 GPV重组VP2蛋白的体液免疫水平
对采集的BALB/c免疫小鼠血清进行ELISA试验检测，每个样品重复检测三次，取平均值计算，详见表1。经统计学分析表明，在三免后第2d，重组蛋白组和重组蛋白佐剂组免疫小鼠血清的OD450nm值均达到最高值，重组蛋白佐剂组与生理盐水阴性对照组间差异极显著（P
对采集的BALB/c免疫小鼠血清进行ELISA试验检测，每个样品重复检测三次，取平均值计算，详见表1。经统计学分析表明，在三免后第2d，重组蛋白组和重组蛋白佐剂组免疫小鼠血清的OD450nm值均达到最高值，重组蛋白佐剂组与生理盐水阴性对照组间差异极显著（P
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗体消长变化（OD450）
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗体消长变化（OD450）
组别 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
组别 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
重组蛋白组 0.039±
重组蛋白组 0.039±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.017
0.017
重组蛋白佐剂组 0.033±
重组蛋白佐剂组 0.033±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.019
0.019
生理盐水组 0.037±
生理盐水组 0.037±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.015
0.015
3 讨论
3 讨论
本研究以GPV的vp2基因为目的基因，以pET30a为表达载体，在体外高效表达了VP2蛋白，经重组蛋白免疫小鼠试验发现，该重组蛋白具有免疫活性，重组蛋白佐剂组与阴性组间血清抗体水平差异极显著，说明vp2基因可以作为基因工程疫苗的候选基因，而重组蛋白佐剂组与重组蛋白组间血清抗体水平差异显著，提示佐剂对基因工程亚单位苗的免疫效果影响较大。由于本研究只是初步的预试验，未进行攻毒试验和鹅体内试验，这将在下一步试验中予以开展。本研究结果为GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
本研究以GPV的vp2基因为目的基因，以pET30a为表达载体，在体外高效表达了VP2蛋白，经重组蛋白免疫小鼠试验发现，该重组蛋白具有免疫活性，重组蛋白佐剂组与阴性组间血清抗体水平差异极显著，说明vp2基因可以作为基因工程疫苗的候选基因，而重组蛋白佐剂组与重组蛋白组间血清抗体水平差异显著，提示佐剂对基因工程亚单位苗的免疫效果影响较大。由于本研究只是初步的预试验，未进行攻毒试验和鹅体内试验，这将在下一步试验中予以开展。本研究结果为GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
参考文献
参考文献
[1] 方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志,1962,8:19-20．
[1] 方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志,1962,8:19-20．
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[3] 胡晓静,潘杰,陈进喜,等.2株鹅细小病毒主要结构蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,(23):262-265.
[3] 胡晓静,潘杰,陈进喜,等.2株鹅细小病毒主要结构蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,(23):262-265.
作者简介：高旭(1977-)，男，吉林德惠人，博士，副教授，研究方向：动物病毒病分子生物学与免疫学。
关键词：动物；免疫失败；人为因素；预防措施
中图分类号：S851 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）01-0013-01
随着我国畜牧业持续稳定发展，规模化、集约化养殖程度的不断提高，动物疫病发生、传播的风险也在加大，免疫工作尤显重要。笔者在从事畜禽免疫工作中，经常会遇到免疫失败的问题。免疫失败是经疫苗接种过的动物机体不产生相应的免疫应答或显著减弱，并由此造成不能预防相应疫病的现象称为免疫失败。据分析，免疫失败有多方面的原因，如疫苗质量、畜禽健康、操作因素、免疫程序等。其中疫苗保存、稀释、免疫程序等造成的免疫失败应属于人为因素的范畴。在免疫工作中如果控制好这些因素，将会大大提高免疫质量，提高畜禽的抗病能力。本文就动物免疫失败的人为因素进行分析并提出几点预防措施，供参考。
1 免疫失败的临床表现
（1）动物疫苗接种后仍发生相应的疾病。
（2）动物接种后虽不发生相应的疾病，但动物机体抵抗力降低，使其发生混合感染的疾病增多。
（3）群体接种疫苗后虽未发生明显的疾病，但引起群体生产性能降低，如生长缓慢，饲料转化率降低，鸡群产蛋率下降，猪群生长缓慢等问题。
（4）动物预防注射后很快发生相应疾病死亡，或虽不死亡， 也不表现临床症状，但体内检测不到抗体。
（5）隐性感染、持续感染和带毒动物及垂直感染现象。
2 免疫失败的人为因素
2.1 疫苗运输保存不当
运输条件不当。按照要求运输疫苗必须全程冷链。从经销商到畜牧兽医管理部门，再分发到防疫员手中，环节较多，某个环节冷链出了问题，势必影响到疫苗的效价。
保存条件不当。不同的疫苗所需的保存条件不同，如冻干苗一般需在-15℃以下冷冻保存，水苗一般在0～4℃保存，油苗的保存温度一般在3～8℃左右，也就是说，不同的疫苗应分类保存。目前，除大型养殖场条件较好，疫苗能够规范保存。一些边远山区，基层防疫员承担本辖区的疫苗接种工作，农村条件差，停电现象难免发生，疫苗保存也会受到影响，效价不能保证等。
2.2 疫苗过期
疫苗存在有效期，且与保存条件有关，如猪瘟兔化弱毒冻干活疫苗，在-15℃贮存有效期为12个月，0～8℃贮存有效期则为6个月，8～25℃贮存有效期为10 d。使用过程中如果不注意保存条件，疫苗效价降低，也会影响免疫效果。
2.3 操作不当
各种疫苗对所需的稀释液、稀释倍数及稀释的方法都有一定的规定，必须严格按照使用说明书进行操作。疫苗使用要坚持现用现稀释的原则，且稀释后要在2 h内用完。在操作过程中，如果不严格按照说明书稀释，或者稀释后摆放时间过长，致使疫苗失效，也导致免疫失败免疫剂量不准，注射器的定量控制不灵敏，接种时注射剂量过大或过小，均影响免疫效果。
2.4 操作不当
不同疫苗有不同的接种途径。一般疫苗采用皮下或肌肉注射，还有点眼、滴鼻、刺种、气雾、口服等接种途径。如口蹄疫苗需要深部肌肉注射；羊痘苗要在尾根内侧或股炔嗥は伦⑸洌患π鲁且呙缭蚴敌械阊邸⒌伪恰⒁水等；鸡痘苗则采取在鸡翅皮下刺种等方法。在疫苗接种过程中，如果不严格按照说明书操作，势必造成免疫失败甚至对动物健康造成危害。
3 预防措施
3.1 增加基础设施投入
疫苗运输保存是保证疫苗效价的主要因素，关键是要配备冷链设施。各级财政应把基础设施经费纳入预算，加大基层防疫设施建设，县级配备冷藏运输车，乡镇级配置足够的冰箱冰柜等，为疫苗分类运输保存提供保障。
3.2 加强基础防疫员技术培训
基层防疫员面临队伍老化，专业基础薄弱等问题，难免会在免疫接种工作中出现一些操作上的失误。因此，每年要在春、秋两次防疫开展集中培训，现场演示等，对各种疫苗的运输保存分别进行讲解，现场对疫苗使用进行演示，确保每个防疫员能正确操作。
3.3 建立健全考核机制
一、后悔打新冠疫苗具体是怎么回事？
后悔打新冠疫苗是不存在的事情，这都是谣言，是有人恶意散步这种消息在网上，然后搞的老百姓人心惶惶，不敢去接种疫苗。根据，国家卫健委公布的《新冠病毒疫苗接种问答》以及《第一版新冠疫苗接种技术指南》都明确指出打新冠疫苗可以起到免疫作用，但除了一些禁忌症人群以及不满十八周岁的人群不能打之外，都是建议大家去打新冠疫苗的。为什么建议大家去打新冠疫苗，具体有以下三个方面的原因：
1、原因一：中国现在处于关键时刻近日钟南山院士在接受采访时表示：虽然中国疫苗接种绝对数是世界第二，但是按百分比数的话，中国目前只有4%，远低于英美国家。按照现在的情况，中国要是完全开放是非常危险的。因为绝大多数人处于没有免疫状态，也就是一旦接触了病毒的感染马上就得病。
2.原因二：战胜新冠疫情最终要靠疫苗
在第二轮新冠肺炎疫情防控过程中，世界各国都在争时间、抢速度、赶进度。在疫苗接种上，中国不占优势，因为人口基数大，要达到总人口80%的接种率，是非常艰巨的任务。吴尊友呼吁大家积极响应，去接受和接种疫苗。只有每个人都了解接种疫苗的必要性和重要性，我国在第二轮新冠肺炎疫情的防控过程中才不会丢失机会，在全世界抗击新冠肺炎疫情的斗争中，才有可能再次赢得胜利。
3.原因三：接种疫苗帮助建立免疫屏障
上海市新冠肺炎医疗救治专家组组长、复旦大学附属华山医院感染科主任张文宏27日在澳门表示，新冠病毒变异是自然规律，已成为人类的常驻病毒，疫苗成为世界重新开放的唯一渠道。
二、打新冠疫苗有哪些好处？
新冠病毒在将来会成为一种常驻病毒，一直会有。对每一个个体来说，接种疫苗的理由很简单：万一将来感染了，我也没事。我们的灭活疫苗，对避免转成重症的保护率在90%以上，对避免发生死亡的保护率接近100%。所以，接种疫苗从国家层面看是阻断传播，从个人层面看是不要出事。
三、新冠疫苗分几种？
1.第一种：减毒活疫苗
减毒活疫苗是在实验室内对病原体进行减毒处理，减弱甚至去除其致病性，但保留其生长或复制和引起免疫的能力制成的疫苗。常用减毒活疫苗有卡介苗、麻腮风疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗、水痘疫苗等。活疫苗中的病原体在体内可繁殖，免疫效果好，免疫保护时间较长，但对于免疫功能缺陷人群可能存在潜在致病风险。
2.第二种：灭活疫苗
灭活疫苗是先对病原体进行培养，再用物理或化学方法将其灭活制成的疫苗。灭活疫苗也称「死疫苗，不具有致病和繁殖的能力。常见的灭活疫苗有百白破疫苗、乙脑灭活疫苗、甲肝灭活疫苗、流感灭活疫苗等，灭活疫苗要获得较好的免疫效果和持久免疫力通常需要多次接种。灭活疫苗对生物安全等生产条件要求很高，生产成本也较高。
3.第三种：蛋白亚单位疫苗
亚单位疫苗是指提取或者合成病原体外壳的一部分具有特征性的蛋白结构来制成的疫苗，和重组疫苗有部分重合。因为只选取了一部分能引起免疫反应的结构，所以理论上可以减少疫苗引起不良反应的风险，安全性更好。
4.第四种：基因工程疫苗
基因工程疫苗是通过基因工程对抗原基因与其他细胞、病毒、质粒重组或将其作为载体，甚至通过技术平台直接合成基因序列制备的疫苗，包括了病毒载体疫苗、核酸疫苗（DNA 疫苗和 mRNA 疫苗）等。
接待机构投资者调研活动的会议纪要
编号：2020-005
1、 今年以来狂犬疫苗终端显示比较紧缺，其原因是？
答：国内狂犬病疫苗属于刚性疫苗，近两年，受长春长生事件影响及部分狂苗生产企业技改影响，国内人用狂犬病疫苗批签发总量较之前年份减少，2017年度、2018年度及2019年度批签发总量约为7,776.29万剂、6,679.60万剂及5,883.22万剂。同时，人们饲养宠物习惯的逐渐兴起，随着宠物市场规模的扩大、暴露前免疫知识的普及，人用狂犬病疫苗的需求保持增长。
2、 疫苗法落地之后，从公司角度看，研发、生产、销售能各环节的变化是？
答：《疫苗管理法》对疫苗研制和上市许可、疫苗生产和批签发、上市后研究和管理、疫苗流通、预防接种、异常反应监测与补偿、保障措施、监督管理、法律责任等作出了明确规定。从疫苗的研制、生产、流通、接种等各环节都提出了要加强监管，其中，对设备变更、工艺变更、产品质量回顾等规定了详细的管理制度，实行疫苗全程电子追溯制度，疫苗企业应当建立疫苗电子追溯系统，与全国疫苗电子追溯协同平台相衔接，实现生产、流通和预防接种全过程最小包装单位疫苗可追溯、可核查。
3、 今年狂犬疫苗价格有明显提升，明年价格预期如何？提价会是一个常态化？
答：公司有定价机制确定产品的销售价格，公司根据生产成本、工艺难度、产品定位、目标销售区域消费水平、市场竞争情况、运输成本等因素在基准价格基础上先行确定投标价格并经各地区省级疾控中心招投标流程或遴选流程后最终确定。狂犬病疫苗价格上涨主要原因是现在疫苗需配送至接种点，运输成本增加，未来产品价格公司也将根据定价机制确定。
4、 公司销售队伍后续计划？如何看待疫苗的商业化能力？公司后续的销售布局如何？
答：公司销售队伍处于扩充中，公司将通过精细化扩编自有营销团队、建设营销信息化系统、下沉营销渠道、加强终端建设等继续推进营销网络的建设，未来3-5年，公司力争接种网点扩张到3,000家以上，占全国总计3万多家接种网点的比例不低于10%。
5、 狂苗二倍体公司产能扩张计划（除募投外），扩张的难点是？
答：公司现有冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）产能300万支/年，除募投项目外，公司目前正开展病毒性疫苗二车间改造，技改完成后，预计将增加冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）产能200万支/年。
人二倍体细胞对狂犬病病毒的敏感性不强，病毒表达水平较温和，病毒产量相对其他基质培养产量较低；增加生产线需要进行车间技改并通过GMP认证取得生产许可，实施起来需要一定时间。
6、 后续康泰、智飞生物等二倍体狂苗上市后如何看待竞争格局？
答：自国内首次攻克大体积生物反应器规模化培养、扩增人二倍体细胞技术后，公司在狂犬病疫苗市场的品牌影响、市场渠道、产品口碑、生产工艺技术等方面经多年发展逐步成熟，随着国内民众人均收入的提高及对疫苗品质的重视，高品质高安全性的疫苗需求将扩大，公司将在这个过程中把握机会，扩大市场份额，如果国内其它公司人二倍体细胞狂犬病疫苗产品研发成功并上市销售，虽会对公司构成一定的竞争，但目前国内狂犬病疫苗年使用量巨大，尤其目前国家药监部门对于疫苗的质量及安全性不断加强监管的背景下，人二倍体细胞狂犬病疫苗以其采用人二倍体细胞为细胞基质培养狂犬病病毒等的差异化优势，对Vero细胞狂犬病疫苗形成的补充空间较大。
7、 公司后续研局重点方向？方式自研，合作？
答：公司以创新为导向，遵循“产品升级换代”、“填补国内空白”的研发战略，进行产品创新与新工艺创新。公司研发方式为自主研发与合作研发相结合，基于现有的细胞培养生物反应器技术平台、细胞规模化培养技术及核心生产工艺等，进行吸附破伤风疫苗、人胚肺二倍体细胞建立及应用等项目研发，积极利用外部研发资源，与知名高校及科研机构开展技术交流与合作，如六价诺如病毒疫苗、轮状病毒基因工程疫苗的研制等，研发项目具体情况详见公司定期报告。
1 牛痘的诞生使天花得以完全被消灭
天花曾使欧洲3亿人丧生。人类利用疫苗预防传染病的历史至少可以追溯到公元10世纪宋朝真宗年间，当时我国已有接种人痘预防天花的记载。17世纪末，英国乡村医生爱德华・琴纳发明了接种牛痘预防天花的方法，标志着人类首次通过有意识地预防接种来控制天花的科学实验获得成功。1977年10月，人类在索马里消灭了最后1例天花病例。1980年，世界卫生大会正式宣布在全世界范围内消灭了天花。
2 传统疫苗可有效控制一系列传染病
过去，疫苗被简单地定义为一种可诱导疾病免疫性的灭活或减毒活致病因子。换言之，传统疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗。
2.1 减毒活疫苗
狂犬病虽至今仍保持着人类传染病最高病死率的记录――近乎100％，但它始终没有成为一种导致众多人群死亡的疾病，其中疫苗起了决定性的作用。19世纪中叶，法国科学家巴斯德发明了细菌的纯种培养技术以及减毒疫苗的制备技术，并于1885年首次成功地在人体使用减毒狂犬病疫苗，表明人类可用实验室研制的疫苗来预防传染病，使预防接种进入了新纪元。巴斯德也因总结出免疫接种原理和奠定了疫苗制备的理论基础而被誉为“疫苗之父”。
法国科学家Camette和Guerin在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递230代，获得1株减毒株，制成的疫苗于1927年上市，即卡介苗。实际上，减毒疫苗就是由通过筛选或采用人工定向变异的方法培养出的毒力显著减弱或基本无毒的活的微生物制成的疫苗。减毒活疫苗接种后，在机体内有一定的生长、繁殖能力，可使机体发生类似隐性感染或轻度感染的反应，但却不产生临床症状，免疫效果强而持久，且用量较小，除刺激机体产生细胞免疫和体液免疫外，尚能产生局部免疫保护作用。然而，减毒活疫苗须在低温条件下保存及运输，有效期相对较短，还存在毒力返祖的风险。麻疹疫苗也是典型的减毒疫苗，于1945年后研制成功，由此使得在儿童中死亡率很高的麻疹发病率和死亡人数迅速下降。
2.2 灭活疫苗
灭活疫苗选用免疫原性强的病原微生物经培养、以物理或化学方法将其灭活后，再经纯化制成。19世纪末，疫苗学领域里已有了3种细菌灭活疫苗即伤寒、鼠疫和霍乱灭活疫苗，这使得急性传染病的肆虐范围进一步缩小。上世纪20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗，这是人类首次用化学灭活方法获得疫苗，是疫苗史中的重要进步之一。
3 更有效地控制传染病已成为疫苗发展方向
传统疫苗的使用为人类预防传染病传播作出了重要贡献。但是，疫菌在生产和使用中存在不安全性。而且有的预防效果也不很理想。
随着人类科学技术的发展，越来越多的新技术运用于疫苗领域。Enders等采用病毒体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。20世纪50年代的3价灭活和3价减毒脊髓灰质炎疫苗为在全球消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。科学家们还在鸡胚细胞中培养出减毒的麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗和风疹疫苗，其中在人二倍体细胞中培养出的Wistar RA27／3株风疹疫苗已在世界范围内获得推荐使用。纯化技术也促进了多个侵袭性细菌荚膜多糖疫苗的研制成功，包括脑膜炎球菌、肺炎球菌和第一代B型流感嗜血杆菌等疫苗。同时，病毒蛋白纯化技术亦促进了血源性乙型肝炎病毒疫苗的研制成功。随着乙肝疫苗的普遍接种，我国儿童乙肝病毒携带率已从10％下降到1％。
3.1 裂解灭活疫苗
裂解灭活疫苗是在灭活疫苗的基础上经裂解(用裂解剂将病毒的结构蛋白如基质蛋白等释放出来，并溶解部分表面糖蛋白)和纯化而得的纯化疫苗。这类疫苗既含有内部抗原、也含有外部抗原，可以全面刺激抗体产生，同时由于去除了类脂质等反应原，不良反应大为减少。流感裂解疫苗的免疫效果及安全性已在国内、外的广泛应用中得到了肯定。
流感由流感病毒引起，是一种具有高度传染性的急性发热性呼吸道疾病。流感病毒是有包膜的分节段RNA病毒，分为甲、乙和丙三型，但只有甲型和乙型病毒能在人类中引起严重疾病。甲型流感病毒根据病毒表面抗原血凝素(hemagdutinim，HA)和神经氨酸酶(neuramindase，NA)的不同可进一步分为不同的亚型，至今已发现了16种HA亚型和9种NA亚型。1918-1919年起源于美国的“西班牙流感”，其病毒类型是H1N1；1957-1958年的亚洲流感流行共导致200万人死亡，该流感的病毒类型为H2N2。当1936年Wison Smith和Thomas Franis分别在禽胚中研制成功两种灭活甲型流感疫苗时，或许他们也没有料到这只是拉开了人类通过研制疫苗同流感斗争的序幕。
现有季节性流感疫苗可分为三类：灭活的全病毒疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。我国生产的主要是灭活和裂解疫苗。流感裂解疫苗不仅接种后保护效果好，而且临床不良反应小，适合各年龄段人群接种，疫苗的保护率高达81％～92％。接种流感疫苗是目前人类对付流感最有效的手段。由于接种疫苗后人体内产生的抗体水平会随时间的延续而下降，且流感病毒极易通过抗原漂移和抗原转变而不断进化，致使得以逃脱宿主免疫系统的监视，故即使是曾得过流感或接种过流感疫苗、体内已有抗体的人，其对流感病毒的新型变异株也不一定具有免疫力。因此，每年仍需接种当年的“新版”流感疫苗。
眼前自2009年3月起暴发流行的甲型流感是由人流感、禽流感和猪流感病毒的基因片段经融合而成的新型甲型H1N1流感病毒株，人类对其缺乏免疫力，以致造成一波又一波的暴发。美国在2009年9-11月共批准了5个甲型H1N1流感疫苗，其中包括4个肌肉内注射接种的灭活疫苗和1个经鼻腔给药接种的减毒疫苗；欧盟也在2009年9-10月间批准了3个肌肉内注射接种的灭活疫苗，其中包括1个全病毒灭活疫苗和2个灭活裂解疫苗。我国目前普遍应用的是无佐剂灭活裂解疫苗，接种后的阳转率和保护率均超过85％。裂解疫苗的各组分无感染性，不会引起甲型H1N1流感。甲型H1N1流感疫苗的不良反应同既往的季节性流感疫苗相似，包括：
局部不良反应如疼痛，偶见红、肿、瘙痒；全身不良反应如发热、疲劳、乏力、头痛、头晕和恶心，偶见咽喉疼痛、肌肉疼痛、咳嗽、腹痛、关节疼痛、口干和过敏等。不良反应以轻度为主，主要发生在接种后24 h内。同季节性流感疫苗一样，接种甲型H1N1流感疫苗也可能发生罕见的不良反应，如休克和格林-巴利(Guillain-Barre)综合征等神经系统疾病。
3.2 亚单位疫苗
亚单位疫苗是通过化学分解或有控制性的蛋白水解方法使天然蛋白分解，然后提取细菌或病毒的特殊蛋白结构部分，筛选出具有免疫活性的片段制成的疫苗，亚单位疫苗仅含有几种主要表面蛋白，因而能消除许多与抗原诱发无关的抗体，有效减少疫苗的不良反应。不过，早期研制成功的亚单位疫苗的免疫原性较低，需与佐剂合用才能产生良好的免疫效果。而现代蛋白化学丁艺通过使亚单位疫苗与载体蛋白耦联或结合，可极大地改进部分亚单位疫苗的有效性，如B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B，Hib)荚膜多糖结合疫苗。Hib是儿童呼吸道的主要致病菌，所导致疾病以肺炎为主，2岁以下幼儿的感染率较高。早在上世纪20年代，Pittman就证实Hib多糖荚膜是导致5岁以下婴、幼儿Hib侵袭性感染的基础，并确认了其化学成分为聚核糖磷酸盐(polyfibosylribitol phosphate，PRP)。20世纪70年代研制成第1代PRP多糖非结合型疫苗，但后被证实对＜18月龄幼儿无效，而这一年龄组正是Hib脑膜炎的高危组。1987年，Robbins等将破伤风类毒素蛋白作为载体蛋白，经用化学共价键方法与PRP结合，使T细胞非依靠型多糖抗原PRP转化为T细胞依靠型结合抗原PRP-T，从而在18月龄以下婴、幼儿中产生了持久免疫力。在所有使用Hib结合疫苗的国家中，Hib感染率均显著下降甚至消失。英国的一项研究表明，Hib的发病率甚至在非接种组儿童中也明显下降，即Hib疫苗具有“群体效应”。这一效应是由于疫苗降低了Hib在咽喉部的带菌率，从而降低了该菌的传播所产生的。
3.3 基因工程疫苗
20世纪70年代以后，随着基因工程技术的发展，人们开始利用其来生产疫苗。所谓基因工程疫苗是指，将编码某种病原体抗原(某种蛋白)的基因插入到细菌或真核细胞内染色体的基因组中，利用细菌或细胞生产病原体的抗原(而不是病原体本身)作为疫苗，所以这种疫苗很安全，被称为第二代疫苗。例如，将编码乙肝表面抗原(HBsAg)的基因插入酵母菌基因组中制成的DNA重组乙型肝炎疫苗就属于第二代疫苗，现已全面替代原有的血源性疫苗。目前，我国也已应用基因工程技术成功地研制出脊髓灰质炎、甲型肝炎和乙型肝炎病毒基因工程疫苗。
莱姆病是由博氏疏螺旋体通过蜱咬传染的疾病，属全球性自然免疫源性疾病，已有70多个国家报告该病，且发病区域和发病率呈迅速扩大和上升的趋势，被WHO列为必须加以防治研究的疾病之一。现已发现博氏疏螺旋体外表蛋白OspA具有保护性，但通过培养难以获得足够量的OspA来制成疫苗，故考虑使用重组蛋白合成技术将含有抗原蛋白的基因嵌入一种微生物体内，让后者产生大量抗原蛋白，纯化后制成疫苗。这种微生物可以是大肠杆菌、酵母菌或动物来源的细胞系列。正在研制的莱姆病疫苗采用大肠杆菌生产OspA，人体试验显示可获优异的免疫原性和有效性。
3.4 DNA疫苗
机体对抗原攻击所产生的特异性免疫反应是针对蛋白的，而蛋白是受基因编码的。如果不接种蛋白而直接把其编码信息“告诉”机体，会不会产生免疫反应呢?DNA疫苗技术研究的正是这一类新型疫苗。实际上，DNA被携带在实验室构建的质粒中，质粒是细菌内独立于染色体外的DNA，能在细菌胞浆中独立复制，并具有基因的特性。质粒经各种途径注入体内后，其中含有的DNA能被宿主细胞阅读，并通过宿主细胞蛋白表达系统表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。由于通过PCR反应可产生大量DNA，不同基因的DNA可同时接种，而抗原的持续表达还可免去疫苗加强接种，这些优点激励研究人员积极探索。DNA疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和减毒活疫苗激发机体强免疫反应的性质，同时具有免疫效果持久以及制备简单和价廉等优点，故被称为是第三代疫苗。
1993年，尤尔默(Ulmer)率先将流感病毒高度保守的NP基因插入质粒中，然后注入BALB/C小鼠肌肉中，结果发现可诱导小鼠对流感病毒产生抗体免疫反应和细胞免疫反应。1996年，珀德默(Pertmer)采用基因枪方法将流感病毒DNA疫苗导人小鼠，结果显示其效果比注射法更好。短短数年内，科学家们在小鼠、鸡、猪、猴和黑猩猩等动物中进行了广泛、深入的抗病毒(如HIV、HBV、流感病毒和狂犬病病毒)、抗细菌(如结核分枝杆菌)、抗寄生虫(如疟原虫和血吸虫等)的DNA疫苗的研究，但是研究结果并不尽如人意，这可能与人们对基因免疫的具体机制知之甚少有关。所以，目前对DNA疫苗的研究仍停留在试探性阶段，而未能获得实质性的成果。DNA疫苗前景诱人，但短期内不可能替代传统疫苗，原因包括：1)对基因导入系统、外源基因在体内的表达及调控系统和有效的免疫基因这三个重要技术环节还缺乏有效的解决方法；2)外源基因进入机体后会不会与宿主的基因发生整合，从而产生难以预测的不良后果?另外，进入宿主细胞的DNA的最终去向也不能确定；3)持续的抗原表达所激起的强烈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答可能对机体其它细胞产生杀伤作用或产生免疫耐受现象，最终导致机体的免疫抑制；4)接种DNA后有可能引起机体的免疫功能发生紊乱，产生抗DNA抗体；5)目前进行的实验都是以动物为模型的，应用于人体后是否会出现不良反应.还需经大量及长期的临床考察。
3.5 疫苗给药途径
疫苗的研发进展同样反映在疫苗给药途径方面。人们现已发现，对某些呼吸道、消化道和生殖道感染性疾病的免疫预防，经黏膜给药可能是更有效的给药途径。因此，研制经滴鼻、口服、阴道或直肠栓剂等给药途径的疫苗成为疫苗研发领域的又一热点，具体方法包括采用能感染黏膜内壁细胞的载体、能提高置于黏膜上的抗原免疫应答的佐剂和能黏附于黏膜上的细胞黏膜剂等。
3.6 联合疫苗和治疗性疫苗
至20世纪末，科学家们已研制和推广应用了30多种安全、有效的疫苗，使人类消灭了天花、制伏了霍乱，有效控制了百日咳、白喉、破伤风、乙型脑炎和脊髓灰质炎等多种严重传染病。由于某些人群(如幼儿)需在某个特定时期先后接种多种疫苗，故为方便计划免疫，人们又开始研制了联合疫苗。目前，三联疫苗(如百白破疫苗)已得到广泛使用，六联疫苗也已经问世，七联和八联疫苗正在研制中。除预防性疫苗外，科学家们近年来还在研制治疗性疫苗，如乙肝病毒和幽门螺杆菌的治疗性疫苗等，以期通过免疫接种疫苗产生抗体等免疫应答来攻击已致病的病原体。
【关键词】 接种；认知；因素分析，统计学；儿童，学龄前
【中图分类号】 R 186 R 179 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000-9817(2008)05-0427-02
为了解济宁市学龄前儿童计划免疫的实施情况，探讨影响该人群免疫接种及时性的主要因素，为今后疾病控制措施的制定提供相应的依据，笔者于2007年1-6月对济宁市6所托幼机构儿童的疫苗及时接种率及其影响因素进行了调查。现将结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 对象 采取整群抽样方法，对济宁市6所托幼机构2 076名学龄前儿童进行调查。其中男童1 104名（53.2%），女童972名（46.8%）；常住儿童1 903名（91.7%），流动儿童173名（8.3%）。
1.2 方法 采用问卷式调查，收集调查对象疫苗的免疫接种情况、家庭基本状况、家长对计划免疫接种的认识情况、影响儿童及时接种的原因和获取免疫接种相关知识的途径等5个方面的资料。
1.3 及时接种率的判定 按山东省规定的免疫起始月龄和接种时间间隔实施接种为及时，即卡介苗（BCG）在出生后1个月内完成，乙型肝炎疫苗3剂（HepB）在6个月内完成，脊髓灰质炎糖丸3剂（OPV）在出生后5个月内完成，百白破三联制剂3剂（DPT）在出生后6个月内完成，麻疹疫苗（MV）在出生后9个月内完成；乙脑、流脑、流腮、风疹、甲肝、水痘在出生后24个月内完成为及时。
1.4 统计学分析 所有数据应用Excel输入整理，应用SPSS 11.0 软件进行统计分析。采用χ2检验和Logistic回归分析。
2 结果
2.1 疫苗及时接种情况 济宁市常住儿童除卡介苗外，其他基础疫苗、季节性疫苗和自费疫苗及时接种率均高于流动儿童，差异均有统计学意义（P值均＜0.01），见表1。
2.2 儿童家长预防免疫相关知识获得途径及知晓率 在获得预防免疫知识的途径中，72.8%的家长是通过接种场所张贴的宣传资料获取，13.2%的是通过亲朋好友及邻居同事等介绍获取，4.5%的是通过报纸杂志获取，3.3%的是通过广播、电视获取。家长对儿童预防免疫知识的平均知晓率为46.1%，其中对疫苗可以预防疾病的知晓率为92.2%，1岁内必须接种的5种疫苗的知晓率为43.6%，知道“脊髓灰质炎强化接种日”的占26.7%，知道何为计划免疫的为50.6%。
2.3 影响及时接种率的因素 以5种基础疫苗的及时接种为应变量（及时=0，不及时=1），将儿童性别、父亲和母亲的文化程度、职业、家庭平均月收入、居住地、对接种疫苗的态度和相关知识的知晓率等纳入方程，进行Logistic回归分析，结果发现，居住地更换（χ2=8.036，P=0.005，OR=9.061）、接种次数多（χ2=31.972，P
3 讨论
学龄前儿童正处于生长发育和各器官系统逐步完善的阶段，抵抗疾病的能力较弱，容易感染各种疾病。托幼机构是幼儿相对集中的场所，幼儿群体如缺乏有效的免疫应答能力，一旦有传染源进入，就很容易引起传染性疾病的爆发流行。计划免疫是控制和消灭相应疾病的最有效、最方便、最经济的手段。对疫苗接种效果的评价可从接种率、接种覆盖率、抗体滴度等方面进行。抗体滴度可以准确反映机体接种疫苗后的效果，但在人群中开展检测工作需要强大的资金作为保证，而且要采集血样，儿童和儿童监护人都难以接受，配合程度较差。疫苗的全程、及时接种是保证机体产生高抗体滴度的前提，接种及时率的提高可使接种对象在短期内产生更持久的免疫能力，使易感人群获得高滴度的抗体保护率，避免因接种失败进行重复和强化接种所造成的人力、物力及财力上的巨大浪费，而且能更好地应对传染性疾病的爆发流行。因此，从成本-效益比值和人群的配合程度上来看，疫苗的及时接种率是评价疫苗接种效果最经济、最直接的指标之一。
2000-2006年岁儿童BCG，DPT，OPV，MV“四苗”接种报告率均保持在97.4%以上［1］。笔者调查显示，济宁市学龄前儿童疫苗及时接种率均明显低于我国疫苗免疫报告接种率，尤其是卡介苗，及时接种率只有9.7%。目前，计划免疫提供的卡介苗为多人份装，在儿童出生密度不高的地区，24 h内接种会导致疫苗的大量浪费，接种门诊则普遍采取集中接种的方式，以降低耗损；另外，当地的风俗习惯(儿童满月前不易出门)也可能是导致卡介苗的及时接种率明显低于其他疫苗的主要原因。因此，计免接种门诊应主动开展工作，加强与医院妇产科的联系，加大宣教工作的力度，提高儿童家长对健康行为的认识。
调查显示，基础疫苗及时接种率高于季节性疫苗，季节性疫苗高于自费疫苗，单剂疫苗高于多剂疫苗。提示接种门诊应结合所辖地区儿童接种的实际情况，增加疫苗常规运转频率。另外，相关部门要加强联合疫苗的研发工作，减少接种次数，以提高及时接种率。
流动儿童的计划免疫管理越来越受到普遍关注［2］。调查结果显示，流动儿童疫苗及时接种率均低于常住儿童，与国内相关报道［3］一致，这可能与流动儿童来源广泛、构成复杂、流动快、家长文化水平低、缺乏计划免疫知识，以及缺少完整、确切的流动人口的管理机制和计划免疫办法有关。流动儿童作为潜在传染源，疫苗接种不及时或漏种都可能会造成疾病的传播，应引起相关部门的重视。
本次研究将可能影响儿童免疫接种及时性的17项因素纳入Logistic回归分析，结果显示，儿童性别、家庭月收入、父亲职业、家庭子女数等因素对接种及时率无影响，与相关研究［4］有所不同。母亲作为家庭照顾儿童的主要成员，其文化层次决定了其掌握计划免疫相关知识的知晓程度，决定了整个家庭对儿童免疫接种的关注程度；知识掌握的程度可以促进行为的改变，父母掌握计划免疫相关知识的水平越高，儿童及时接种率也就越高。本次调查显示，济宁市儿童家长对计划免疫相关知识的平均知晓率只有46.1%，因此，多渠道、多途径、多方位开展宣传教育，调动家长的积极性和主动性，也是提高儿童及时接种率的有效措施。
4 参考文献
［1］ 中华人民共和国卫生部.2007年中国卫生统计提要.［EB/OL］.［2007-06-01］.moh.省略/newshtml/19165.htm.
［2］ 余晓琼，路秀平，武滨.流动儿童的计划免疫管理.中国计划免疫，2005，11(1):73-76.
［3］ 郭飚，曹雷，曹玲生，等. 世界银行贷款疾病预防项目计划免疫子项目：实施不同阶段疫苗接种率及影响因素调查分析. 中国计划免疫，2005，11（5）：392-397.
各位老师、各位领导：
大家下午好！
我叫荣俊，是生命科学学院的一名普通教师。今天有机会站在这里，主要是与大家进行交流，分享一下从事科研工作的体会。
今年1月10日，我在北京参加了2013年度国家科学技术奖励大会，我参与的一个项目获得了国家技术发明二等奖。
这个项目名称叫《传染性法氏囊病的防控新技术构建及其应用》，是由浙江大学、长江大学、北京市农林科学院、青岛易邦生物工程有限公司共同完成的。长江大学是第二完成单位。作为主要完成人，我排名第三，动物科学学院的程太平副教授排名第六。
算起来，进行这个项目的研究，前前后后已有20多年。项目组在“863”“科技支撑”“973” 等计划项目的持续资助下，构建了传染性法氏囊病病毒（IBDV）反向遗传学技术平台，揭示了传染性法氏囊病病毒的基因重配和复制的机制，发展了具有国际领先水平的安全的传染性法氏囊病新型疫苗、检测技术体系，尤其是发明的基因工程亚单位疫苗在养鸡生产上的广泛应用，为减少疫病发生、消除传染性法氏囊病病毒变异、净化鸡场的传染性法氏囊病作出了重大贡献。
作为成果第三完成人，我主持了鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的研究，组织实施了传染性法氏囊病毒VP2 基因改造、基因表达、表达产物纯化、油乳剂疫苗生产工艺研究，动物实验研究，获得了国家授权发明专利、农业部签发了国家II类新兽药注册证书和准予生产产品批准文号、获得国家重点新产品证书1 个。
尤其值得欣慰的是，我的发明专利技术在青岛易邦生物工程有限公司得到了具体实施和应用，作为国家重点新产品，该疫苗已连续生产5年并在全国除香港和澳门所有省、市、自治区推广使用，实现销售收入4.776 亿元，新增利税收2.134亿元。目前本成果产品的国内市场份额达到70%以上。
回顾我的科研历程，我觉得，有几点感受较深的体会，在此与大家分享。
第一，科研成果的获得是大量时间和精力投入的结果。
记得党委书记朱业宏来看我时我曾经说过一句话，我绝对不是长江大学做科研中最聪明的和最有水平的，但我肯定是最勤奋的。以这次获奖项目的研究过程为例：传染性法氏囊病基因工程疫苗的研究，1999年立项，2000年经费到账后进行理论研究和前期准备。从2001年到项目通过鉴定这4年时间里，我的工作时间是每年360天。没有节假日和星期天，每年春节后一般都是初二或初三去实验室工作。经常是我到实验室了，管门房的工人还没有起来开门。
第二，不要抱怨自己所在单位的条件不好，充分利用现有试验设备和试验条件你一定会获得成功。将普通设备用好也是一种创新。
我们有很多新教师和老教师习惯报怨单位没有好的研究条件，其实好多人都没有真正了解自己试验室有些什么东西，能做什么。其实这是一种缺乏进取心、自我解压的心理表现。其实在我的研究早期是没有什么试验设备的。当时有不少同事挖苦我要在湖北农学院研究基因工程疫苗，认为这是不可能的事。我们做基因工程疫苗抗原蛋白的表达必须做western blot，而我们实验室没有转膜电泳槽，我就根据在武汉大学用过的仪器构造和原理，拆下报废电泳槽上的铂金丝自己制作了一个转膜电泳槽，用我自制的设备做的实验非常成功。用这个设备做的western blot 照片在2篇SCI论文（3.0以上）中应用。
在青岛易邦公司做工艺时，要增加一步去内毒素的工艺，公司的员工要去买冷冻离心机，每台需大约45万元。我帮他们设计了一个可放置5个5升分液漏斗可移动操作台，可以在冷库和操作间移动。每个台架加分液漏斗可相当两台离心机。而每个台架的造价不到1000元。易邦的老总感叹道，现在年轻的研究人员只知道现代化的设备，对那些管用又便宜的玻璃仪器一无所知。像这样的例子在我的科研实践中还有不少。
第三，国家的需求社会的需求是科研选题的最重要标准。
上世纪末和本世纪初正是我国动物疫苗生产由传统疫苗向现代新型疫苗转型的初期。人类医药中乙型肝炎病毒基因工程亚单位疫苗成功研制和应用，产生了巨大的社会效益和经济效益。在兽医中还没有一个叫得响的产品，与我们前后同时进入新药申报的基因工程疫苗有：复旦大学的猪口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗，西南农大的猪伪狂犬病基因缺失疫苗。这两个疫苗因为免疫效果不佳没有能推广开。其中复旦大学的疫苗转让给内蒙古金宇集团后基本没有生产。从特定疫苗生产的专业角度更是急需的产品。我们的产品是在产业转型的关键时期推出的，是国家和社会急需的东西。2011年春天，我到荆门十里铺去买鸡做实验，我特地问了一下养鸡户，你们免疫传染性法氏囊病用什么疫苗，他们告诉我他们附近的养殖户都用青岛易邦的疫苗，效果非常好，免疫后基本上都可以不患法氏囊病。他们不知道我是该疫苗的发明者。听到这样的评价我真正有了成就感。
第四，千万不要迷信文献资料和专家权威。
从1990年起就有国外的论文报道用原核生物表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白做疫苗是行不通的。我们的研究真真切切的让这种不可能变为了可能。在我们进行新药申报的过程中也曾有国内的顶级专家提出质疑，其理由就是两个：一是国外权威杂志的论文和结论；二是他们自己做过没有成功。所以专家权威不可全信。
华中农大的陈焕春院士知道我们这个产品后，对他们试验室的博士们发出感慨道，荣老师在长江大学做的产品卖到易邦去了（因为易邦公司在国内是排第二的兽药企业）。所以作为长江大学人要有我们的自信。
第五，成功的最关键时刻是咬紧牙再坚持一会。
在该项目的研究中有两次令人崩溃的时候。第一次是获取目的基因，由于病理样本中病毒数太少，加上当时缺乏经验，实验基本上是按书本来做。当时相同的工作反复做了10个月。反转录，PCR，电泳，转化，鉴定。每星期重复2-3次，最后终于取得了正确的基因。第二次是在青岛易邦做工艺时，遇上了副反应的问题。这种问题在试验室比较不明显，在免疫的局部出现核桃大小的结蒂组织增生。那时是三个星期一个轮回，制苗，免疫，剖检。反复改进工艺和疫苗配比，经过11个月完成了工业生产工艺流程。
说完这些科研体会，我还想说一下感恩，做人必须常怀感恩之心。说实话，我真心感谢原农学院和现在的长江大学，为我提供了展示自己的舞台。
感谢原湖北农学院为我提供了当时院内最高的资助，8万元。正是湖北省科技厅的2万元加上湖北农学院的8万元使我能够完成该项目。我现在是不差钱，但在当时这点钱是甘露。
感谢易邦公司的老总，杜元钊总经理，在两次巨额赔款后仍然对该产品充满信心。2次赔了300多万。
感谢生科院给了我相对比较宽松的环境和条件。
感谢动科院在我离开学院后还能为我敞开试验室。
感谢朱业宏书记亲临看望，使我这个一线的科研人员深切地体会到了组织的关怀和温暖。
家长们都知道孩子进行疫苗接种非常重要，可是疫苗有哪些种类？什么是减毒活疫苗？计划外的疫苗要不要接种？如何正确认识接种后的疫苗反应？疫苗接种有什么禁忌症？对此，我们要科普一下。
儿童疫苗接种程序中包含减毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。减毒活疫苗，顾名思义是将某种病原（细菌或病毒）传代培养，将其致病毒力减到很低的程度，只刺激免疫反应，不会使人发病；灭活疫苗就是用甲醛等将病原杀死，但是仍保留其抗原性，但绝对没有致病力；基因工程疫苗是利用基因工程技术提取病原体的抗原成分制成疫苗，根本不是病原本身。
那么具体的疫苗有哪些种？接种程序中减毒活疫苗有：卡介苗、口服脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗、麻风腮疫苗、水痘疫苗、流行性脑膜炎球菌疫苗、轮状病毒疫苗。灭活疫苗有：百白破疫苗、B型流感嗜血杆菌疫苗（HIB）、注射脊髓灰质炎疫苗、肺炎球菌疫苗。基因工程疫苗有乙肝疫苗和甲肝疫苗。计划外疫苗要不要接种呢？社区疫苗接种中心能够提供的自费疫苗有很多种，要根据儿童自身健康情况加以选择。但是在欧美等发达国家和一些国际医疗中心，已经普遍开始建议家长为宝宝接种HIB疫苗、肺炎球菌疫苗、轮状病毒疫苗、水痘疫苗等。
HIB疫苗是小儿肺炎、小儿脑膜炎的克星，该疫苗已被世界上20多个国家列入常规计划免疫接种范围。由于中国国内普遍存在抗生素滥用的现象，使得细菌对抗生素的耐药性上升，感染后比较难诊治。所以，5岁以下，尤其是两个月到两岁的婴幼儿应在医生监督下接种。
常见的接种反应有发热，局部注射部位红肿热痛，皮疹，精神不振，嗜睡，食欲减退，呕吐，腹泻等。上述不良反应常发生在疫苗接种后头两天，持续1～2天后发热及其他症状将相继消失。
值得注意的是，社区接种的脊髓灰质炎疫苗，也就是我们常说的糖丸，是减毒活疫苗。有的家长在孩子服用糖丸后喂温热水，会影响体内抗体的产生，极个别情况下还会出现口服糖丸后感染小儿麻痹症的病例。国际上推荐使用的是灭活的脊髓灰质炎疫苗，是注射剂型，接种后绝对不会感染小儿麻痹症，安全性更高。
正在发热，特别是高热或伴有明显的全身不适的急性症状时，应暂缓接种疫苗，以免接种后加剧发热性疾病。带儿童接种疫苗前，家长需要观察儿童的健康状况。
如果儿童身体不适或与平时表现异常，如突然食欲不佳、咳嗽、异常的哭闹，家长应推迟疫苗接种时间。除了接种疫苗前须先就诊，家长还须主动与护士一同检查疫苗的包装是否完整，核对疫苗的名称、生产厂家、生产日期、保质期，在确保以上信息正确无误的情况下再接种疫苗，保障孩子的安全。
器官有性别
最新的研究表明，我们的身体除了性器官，其他的器官也存在着性别的差异。我们的器官可能是“男性”或“女性”的，这可能意味着女性和男性在疾病治疗的过程中需要区别对待。这个研究还可以解释为什么有些癌症多见于女性，而其他则多见于男性。这项研究发表在《Nature》杂志上，由英国伦敦国王学院临床医学中心（CSC）的科学家在果蝇中进行研究。
CSC团队检查了果蝇肠道干细胞。他们使用的遗传学工具，使他们能够打开或者关闭这些细胞中的某些基因。这允许他们改造这些干细胞变得更“雌性化”或者更“雄性化”。然后他们试图扩增这些细胞。他们发现，“雌性化”的细胞能更好地增殖。
这种增强的能力似乎允许雌蝇在繁殖期间肠道的增长。先前的研究已经表明，后，雌蝇肠道尺寸重新调整，和改变代谢来维持再生产。在目前的研究中，研究小组发现，“雌性化”的肠道干细胞的影响是可逆的。取出雌果蝇肠道干细胞并将其“雄性化”改造，三周后发现，这些细胞出现“雄性化”的倾向，细胞会变小。
该小组还发现，雌性肠道更容易出现肿瘤。他们对此的解释是，因为在雌性中肠道需要在繁殖期有一定的可塑性，这也导致了其更容易遭受癌细胞侵袭。据了解，脊椎动物的性腺或性器官保留相当的可塑性：成年卵巢和的细胞在小鼠体内可以转分化为其相反性别的细胞，而只需要单一的基因变化。所以性腺细胞必须在胚胎出生后不断强化自己的性别特征。
这是第一次证明了性腺外成年细胞被证明有着性别可塑性。在这个研究过程中，研究小组发现这种性别转换背后潜在的重要的新机制，他们认为人体内也有着更多的器官存在着性别差异。
进一步的研究需要将果蝇中的研究成果转化为人类的研究。如果干细胞持有这种内在的具有两性发育的潜能，这表明了大多数器官或者组织都会有性别的“标记”，即存在性别差异，因此未来的治疗可能要针对性别给出不同的解决方案。
石墨烯电极有助修复感知功能
英国剑桥大学的一项研究成果显示，研究人员成功将石墨烯电极植入小鼠脑部，并直接与神经元连接，这项技术未来可用于修复截肢、瘫痪甚至帕金森氏症患者的感知功能，协助他们更好地康复。
石墨烯是从石墨材料中剥离出来、由碳原子组成的二维晶体，厚度与一层原子差不多。这种材料无论是弹性、强韧度以及拉伸性能方面都远远优于钢材等材料，被誉为“新材料之王”。
剑桥大学研究人员与意大利和西班牙的同行利用小鼠脑部细胞培养物进行相关实验后发现，利用石墨烯材料制造的电极能安全地与脑部神经元连接，且连接后这些神经元可正常传递电波信号，不会产生不良反应。
这些与神经元直接连接的电极能把脑电波信号传递给外界，让外界更清晰地了解脑部活动并修复感知功能。例如，机械臂如果能接收脑电波信号，就会按照截肢患者的想法去抓取物体；通过对这些脑电波信号的干预也会有助于帕金森氏症患者更好地控制病情。但此前使用其他材料制作的电极效果并不理想，信号传递很不稳定。
据介绍，石墨烯的导电性能非常优异，测试中这一材料制作的电极实现了稳定的脑电波信号传递，神经元的一些特性也没有因为与电极连接发生改变。
疫苗注射是防制和消灭畜禽疫病的有效措施，但在疫苗的注射中笔者认为还存在很多问题，不按操作规程进行预防注射的现象颇为普遍。很大程度上影响着防疫质量，因此，本人就此谈些看法，供防疫人员在工作中引起重视和注意。
1存在问题
1.1消毒不严格按规定畜禽注射部位必须选用3%～5%的碘酒或75%的酒精进行涂擦，注射后再涂以碘酒，这样才能达到消毒的目的。但在实际注射中防疫人员常抱着侥幸心理，认为不消毒也不一定出事，或是入针前消毒，出针后不消毒。针具的消毒更是不彻底，在使用前用开水烫洗针具，或是用酒精棉球涂擦代替高温消毒，换洗针头直接用手去换造成污染。在注射时一针多用，不换针头，有时只用酒精棉球擦一下就连续注射。由于消毒不严格造成注射发炎，局部化脓感染，还往往造成交叉感染，传播扩大了疫情。
1.2注射剂量不准确多种疫苗注射都有严格的剂量规定，多了，一则造成浪费，二则可以产生免疫麻痹，不但起不到免疫效果，甚至致病；少了，不能引起机体产生免疫力。在实际工作中，我们常发现很多防疫员不按说明稀释疫苗，用量或多或少，疫苗多了多注射，少了少注射，随心所欲。造成疫苗浪费的现象时有发生。
1.3疫苗保管不妥目前注射疫苗多用于冻干苗，保存条件比较严格，所需温度越低有效期越长。而基层兽医站条件差，无冷藏设备。即使配置了冰箱、冰柜，因长久失修，也不能很好的利用。将疫苗搁在室内长达数日至数月，还有的将稀释的疫苗装在口袋或是长时间暴露在阳光下，这样导致疫苗的效果降低，质量难以保证，达不到防疫的目的。出现这些现象的原因一是防疫人员得不到很好的培训，缺乏基本的兽医防疫知识；二是缺乏必要的器械，不少防疫员仅用一两个注射器和少量的注射针头；三是得不到行政方面的支持；四是群众配合不够。
2建议
2.1实行技术承包责任制防疫注射政策、技术性强，涉及面广，地方各级人民政府要对本地动物防疫工作负主要责任，列入工作日程抓紧抓好。县、乡两级专业技术人员应深入基层检查指导或承包防疫工作，改变只注重防疫而忽视防疫质量的状况。制定防疫目标责任书，兑现奖惩措施，保证注射质量。
2.2健全防疫队伍要从大中专院校的畜牧兽医专业毕业生和社会从事疫病防治工作多年的技术人员中通过考核，择优录取。一部分懂防疫知识，掌握技术操作规程，热爱兽医防治工作的人员要到基层，并给予一定的报酬或补贴，只有这样才能有效控制和消灭疫病。
2.3增加经费，健全防疫设备动物防疫经费要列入财政预算，保证基本设施投入，按时供给，专款专用，县级畜牧兽医部门应配备疫苗贮存柜，保证常年供给疫苗，随取随用，决不是一次性将疫苗下发到基层。基层单位也要配备冰箱及冰柜，防疫人员配备保温瓶或保温箱，做到低温送取疫苗。注射器、针头、镊子等要严格消毒，保证一畜一针头，防疫器械应由乡镇兽医站统一管理、使用，健立登记、领取制度。
关键词：教材开发；职业教育；疫苗生产
全国职业教育大会中提出：职业教育要提高人才培养质量，推进学历证书与职业资格证书“双证书”制度。职业教育要推动课程内容与职业标准对接，教学过程与生产过程对接，培养高层次应用技术型人才。专业课程的设置要能够满足“双证书”制度，适应社会经济发展的需要，适应学生可持续发展的需要。而专业课程教材则是完成此目标的重要载体和主要体现。疫苗生产技术是疫苗制品工必备的技能，是药品生产技术专业选修方向之一。因此开发一本能够适合“双证书”制度，教学过程与生产过程相衔接的《疫苗生产技术》教材是药品生产技术专业课程体系建设内容之一。
一目前我国《疫苗生产技术》教材开发现状
目前，高等本科院校中疫苗学教材主要是东南大学出版的《疫苗工程学》，是疫苗学系统的理论性教学教材；国内高职高专“十二五”规划教材中没有《疫苗生产技术》教材，只有少教材在个别章节中涉及到疫苗生产技术内容。在中国图书网上能够检索到的“疫苗”相关图书约有40本，多关于疫苗研发与科普的相关内容。
二《疫苗生产技术》教材开发的相关理论选择
针对生物药品生产现状，技术更新快，企业生产柔性大，要求毕业学生就是个“多面手”，即能具备完成几项工作任务的能力，而非某一专项。因此，基于工作过程的教材开发方案比DACUM课程开发理论更能适合《疫苗生产技术》课程教材开发。基于工作过程的课程开发理论是20世纪90年代，德国职教界提出的基于工作过程的课程开发方案。该方案认为，课程开发流程应包括：①召开实践专家研讨会。②对典型工作任务进行排序。③分析典型工作任务。④按照项目教学法，对课程进行具体设计。该课程开发流程注意到了学生的可持续发展，以企业生产专家的成长经历为蓝本，去研究如何更好培养学生的知识能力和专业技能。该方案体现了对工作过程的整体知识和技能的培训，注重学生理论知识的储备。因此，依据该方案开发课程教材，能够较好体现现代职业教育理念。
三《疫苗生产技术》教材开发过程
（一）教材开发的指导思想
教材开发应依据基于工作过程的课程开发理论，体现现代职业教育要保障学生可持续发展的需求。内容选择应注重疫苗制品工的工种职业标准在教材中的体现，保障学生在本课程学习后能够通过疫苗制品工考核，体现现代职业教育倡导的“双证书”制度。教材内容呈现上应以项目任务教学模式为佳，从典型工作任务中开发项目教学内容，体现教学过程与生产过程相对接的理念。
（二）通过校企合作模式开发《疫苗生产技术》教材
1.校企合作模式的建立
选择本地几家重点疫苗生产企业，与企业中的技术主管和生产线上的技术能手共同组建教材开发小组。通过研讨会的形式找到技术专家成长经历，确立细菌类疫苗、病毒类疫苗和新型疫苗生产过程中的典型工作任务。通过讨论，得出学生的职业生涯发展历程和典型工作任务分别是：（1）学生职业发展：学生准员工员工企业技术骨干行业专家型人才。在此过程中，疫苗生产的基础理论越扎实的员生发展越快，企业生产岗位的实践操作是不可逾越的必经阶段。（2）典型工作任务包括：菌体培养、细胞培养、病毒培养、疫苗纯化技术、疫苗配制技术、疫苗生产过程中的检测技术。
2.深入企业调研疫苗生产各岗位能力要求
要有效保障教材理论内容的实用性，就必需深入疫苗生产企业去挖掘生产岗位上所隐藏的知识、能力与素质的要求。根据企业调研结果，同时参照疫苗生产工工种职业标准，归纳提练出学生应具备的知识、能力与素质要求：法规、规程；基础专业知识；无菌意识、质量意识、保密意识；生产上的规范操作、记录等；现场的工艺管理、问题的处理；合作、创新、改革、领导能力。
3.教材内容的选取与序化
（1）教材内容选取，作为专业方向课程，此课程之前学生学习过基础平台课程，培养了学生一定的法规基础、无菌意识等知识能力与素质。本课程的专业能力培养应在此基础上，联系前面的讨论与调研结果，与企业生产专家共同选择在疫苗生产中实际应用到的知识，突出疫苗生产特点能力的培养内容。教材设计的教学内容分为三个方面：①校内理论教学：依据调研结果选取免疫、疫苗概述、疫苗生产一般工艺等基础理论教学；②校内实践教学：依据疫苗生产企业的疫苗生产种类，选取有代表性疫苗生产工艺进行模拟实践训练。③校外实习培训：有机会应该让学生到实际疫苗生产企业进行顶岗实践培训，以培养学生实际动手能力和解决实际问题能力。（2）教材内容的序化，依据理论指导实践原则与学生学习习惯，教材首先通过基础理论教学让学生认识疫苗；再根据企业专家研讨得出的典型工作任务依次安排菌体培养技术、细胞培养技术、病毒培养技术、疫苗纯化技术、疫苗配制工艺各项学习内容，在这些内容中穿插生产过程的检测技术；最后模拟各类疫苗生产工艺，开发出综合实训内容。
（三）教材的呈现形式
根据以上所选取的教学内容与序化安排，与企业专家共同设计项目教学，在考虑到学生原有的知识与技能基础上，让一个个独立的项目能够在老师稍加指点的情况下学生即可分组共同完成。每个项目教学内容包括以下几个方面：知识与技能准备（老师需要指点学生的理论教学部分）；项目实施（学生依据自己所掌握知识、技能与同组同学合作完成任务）；项目评价（根据各组学生完成过程与结果，分过程评价与结果评价，及时反馈以提升教学质量）。
四课程教材开发反思
《疫苗生产技术》教材开发过程中遵循了以下三点原则：
（一）理论必需够用原则
理论体现实用性，即满足工作岗位知识需要，学即可用，在工作过程中学习理论；其次，理论能够保障学生的发展性，即能够满足学生的后续适应工作过程中的新技术发展，以及学生继续学习的需要。
（二）能够体现“双证书”制度原则
教材内容与疫苗制品工种的技能要求密切相联，确保学生学习完成本门课程能够顺利通过疫苗制品工种考核。同时学生毕业即可上岗，体现实践指导性。
（三）教材体例与生产过程相对接原则
开发项目教学模式，教材编写以项目任务为基本教学单元。现代职业教育要以促进就业为导向，遵循职业教育规律和技术技能人才成长规律，主动适应经济社会发展，特别是技术进步和生产方式变革以及社会公共服务的需要，适应各地、各行业对技术技能人才培养的需要，适应学生全面可持续发展的需要。职业教育要为地域经济发展服务，因此在课程教材开发时，也要考虑地区的疫苗生产企业特色。
参考文献
[1]赵希彥.香港理工大学职教课程开发方法及启示[J].辽宁农业职业技术学院学报，2010，12(2):53-54.
[2]张炎荣.职业教育课程开发方法应用研究[J].机械职业教育，2014(3):7-9.
[3]郭丽春，黄金波.基于工作过程开发的探索与实践[J].办公自动化，2010(11):53-54.
[4]赖敏，陈俊秀.基于学习领域的课程开发探索与实践[J].新课程研究，2013(5):58-59.
[5]张伟.高职院校工学结合课程的教材建设探索[J].亚太教育，2016(4):154-154.
[6]汪倩，齐凤.提高毕业生就业能力，建设高职院校特色教材[J].当代教育实践与教学研究，2016(1):155.
[7]胡桂香.制药工程专业课程体系建设与实践[J].科技创新导报，2011(27):163-163.
[8]刘勇.几种典型中职课程开发方法的比较研究[J].天津职业大学学报，2012(1):51-54.
2.哈尔滨工程大学哈尔滨工程大学船舶工程学院多体船技术国防重点学科实验室，哈尔滨150001；
3.东北农业大学国家乳业工程技术研究中心国家乳品中心，哈尔滨150030）
摘要：疫苗学是一门集微生物、传染病、免疫学、流行病学、生物化学、分子生物学为一体的多学科交叉综合学科，因此，疫苗学涉及的知识面广、涵盖的知识量大、需要掌握的知识点繁多， “一支粉笔、一块黑板、一本教科书”的传统教学方式很难达到教学目的和效果。利用多媒体技术节约了传统的板书时间，可进行高密度的知识传授、大信息量的优化处理， 大大提高课堂效率，使学生在有限的时间内获取大量的知识， 解决课时不足的问题
关键词：疫苗学课程；学科内容；计算机辅助教学
中图分类号：G622.421 文献标志码：A文章编号：1673－291X（2011）23－0277－02
疫苗是一类应用最广的生物制品，是人类预防疫病的重要武器。从防患于未然的角度，疫苗免除了众多传染病对人和动物生命群体的威胁。
疫苗学是一门研究疫苗的基本理论和研制开发技术的学科。其内容主要包括以下几个部分：疫苗的作用机制；疫苗的分类和主要品种介绍；疫苗的研究开发策略和程序；疫苗的生产工艺和质量控制；疫苗的流通与使用；疫苗的政策法规以及市场发展趋势分析。
随着科学技术的发展，疫苗一方面已经从传统减毒或灭活疫苗发展到基因重组疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗；另一方面，随着人们对医疗水平要求的不断提高，疫苗已从传统的预防性疫苗发展到治疗自身免疫病和肿瘤等疾病的治疗性疫苗，甚至是干预人类生殖过程的避孕疫苗。此外，随着人类基因组计划的完成与多种病原微生物基因组的阐明，人类已进入后基因组或蛋白组时代，尤其是反向疫苗学的兴起，使得疫苗的研发与生物信息学密切相关[1]。
因此，现代疫苗学的学科内容较以往更为丰富并且学科结构也发生了变化。疫苗学教学也面临着多学科交叉信息量大、新理论不断涌现以及教学内容与生物信息技术联系紧密等方面的问题，传统的教学手段和方式已经很难达到教学目的并满足学生的要求。
计算机辅助教学（Computer Aided Instruction ，简称CAI）是在计算机辅助下进行的各种教学活动，综合应用多媒体、超文本、人工智能和知识库等计算机技术，克服了传统教学方式上单一、片面的缺点。它的使用能有效地缩短学习时间、提高教学质量和教学效率，实现最优化的教学目标。
将计算机辅助教学应用于疫苗学教学当中，因其具有信息量大、内容形象直观、感染力强的优点，使得教学过程更加高效和生动，收到了良好的教学效果。
一、计算机辅助教学在疫苗学教学中的优势
1.利用CAI可以有效地加大教学密度，提高单位教学时间的知识含量
疫苗学是一门集微生物、传染病、免疫学、流行病学、生物化学、分子生物学为一体的多学科交叉综合学科，因此，疫苗学涉及的知识面广、涵盖的知识量大、需要掌握的知识点繁多， “一支粉笔、一块黑板、一本教科书”的传统教学方式很难达到教学目的和效果。
利用多媒体技术节约了传统的板书时间，可进行高密度的知识传授，大信息量的优化处理， 大大提高课堂效率，使学生在有限的时间内获取大量的知识， 解决课时不足的问题，使教师在完成教学大纲所要求内容的同时，还有能讲授本领域的最新进展，拓宽学生的视野。但同时也应该注意如果每次教学活动的信息量过大往往也会引起副作用，即造成学生感知、注意、 记忆、 思维等认知过程的疲劳，使学生的注意力分散，降低学生的认知欲求。因此还需要及时掌握学生的课堂学习情况， 合理把握教学密度，适时控制教学进程[1]。
2.CAI文、 图、 声、 像并茂，形象直观，有利于丰富教学内容、突破教学的难点
一般《疫苗学》的教材多以文字材料为主，单调乏味而且比较抽象，不利于学生理解和记忆。利用计算机多媒体技术无论是文字材料还是声音材料、 图像材料，都可以进行有机结合，制作出精美的多媒体课件，这样制作出来的多媒体教学以丰富的色彩和良好的视觉效果改变了过去传统教学的沉闷气氛， 教学内容图、 文、 声、 像并茂，更能激发学生对讲授内容的兴趣， 还可以增加学生的感性认识， 便于学生从整体上把握知识的系统性， 使感性认识上升到理性认识。
在讲述疫苗抗原纯化工艺内容时涉及到一些膜分离及层析技术，学生普遍反映难以理解和记忆。但将膜分离过程及各种层析技术的原理制作成FLASH动画，将静态的原理转换成动态的演示过程，就会使抽象的知识形象化，寓教于乐，有利于培养和激发学生的学习兴趣，帮助学生理解重点和难点，增进学生运用知识点的能力[2]。如：在讲解疫苗纯化过程中，膜分离技术中的筒式过滤除菌时，将筒式滤器的装置图采用幻灯片展示，并详细地介绍滤膜的检查、 使用注意点， 使学生对疫苗制剂的除菌过滤过程有了感性认识。又如：在讲解基因工程疫苗发酵液纯化时，以往学生对分子层析技术的理解存在一定的困难，但利用FLASH动画模拟了该层析过程，学生在观看模拟动画后普遍对该层析技术的原理和实际应用的掌握更加迅速牢固。
3.利用计算机多媒体系统在情景模拟上的优势，引入疫苗工程的相应软件系统模拟生产过程，打破实训基地教学资源的局限
疫苗学教学中，常涉及到一些疫苗制造设备的使用以及疫苗制造工艺的设计。以往主要是联系疫苗制造企业，让学生进行参观实习，但由于很多企业的生产车间是密闭洁净环境，为了保证药品的质量对于进入人员有严格的限制，使得学生无法近距离观察或者亲自动手实践。
而对于学校在教学经费有限难于建成GMP级别中试规模教学车间时，利用计算机的情景模拟功能将疫苗生产工艺中涉及到的仪器设备的链接、原料投放步骤、质检步骤等等加以模拟重现。尤其对于疫苗生产设备利用计算机三维模拟软件进行讲解，更有利于学生对仪器设备的工作原理以及内部构造有清晰的认识，既弥补了无法近距离观察和操作仪器的缺憾，同时也可避免传统参观实习中无法对设备内部结构进行认识的不足[3]。
现代疫苗制造设备都是集约化数字控制，通过在实践教学环节中将一些工厂中正在使用的控制软件界面与相应的仪器模拟程序结合，就可以模拟实际的工厂生产操作环境，使学生不用出校门就能感受到现在化疫苗制造车间的生产环境，有效地缩短了学生毕业后走上新岗位的适应期。
4．充分利用互联网资源构建《疫苗学》的教学平台
利用互联网有效地整合一些与教学相关的资源留给学生课余进行深入的学习，是一行之有效的弥补课时不足的措施。同时该教学平台的资源，也可作为对学生创新能力的培养的一种手段。
《疫苗学》其中很重要的部分就是对抗原的研究，主要研究内容是B细胞表位、Th表位、Tc表位的预测与评估。目前有很多白质抗原性分析软件，可以帮助学生进行疫苗抗原的设计和筛选，如：InsightII、OMIGA、UWGCG、ANTHEPROT、AMPHI、Tepitope、TSites、EpiMer、EpiMatrix等。
数据库是高校师生教学及科研中进行信息检索的重要工具，为高校教学和科研活动的开展起到积极的文献保障作用。目前，互联网拥有的收费数据库和免费的数据为《疫苗学》提供了丰富的教学资源。通过教学平台中所涵盖的致病微生物毒力基因数据库及免疫原数据库如：EMBL Database、ImMunoGeneTics、GenBank、HIV Database、KABAT、中国微生物资源数据库群等。
二、疫苗学课多媒体件制作注意事项
1．要注意信息的取舍，避免“大而全”
幻灯片的制作要符合教学对象和教学活动实际需求，对于所选择的内容要看是否需要， 信息量过大过全，往往分散了学生的学习精力，妨碍了其对基础理论、基础知识和基本技能的掌握。同时，单位时间内课堂信息量过大、教学密度过大，使学生在听课时思维处于过度紧张状态，没有足够的时间理解、消化、吸收，没有时间记笔记，以致失去学习的兴趣。
2．要注意多媒体课件的形式，避免过于花哨
多媒体集声、像、动画于一体， 有丰富多彩的视听效果，可以增强教学的直观性和生动性。但在课堂设计和运用时，不要片面地追求花哨的视听效果， 不可一味追求表面上的效果，能用的素材都恨不得一下全部展示出来。如果课件充斥着花哨的背景、新颖的按钮、不恰当的背景音乐，教学时学生的注意力就容易被吸引到画面上，而对课件展示的重要知识却毫不在意，偏离了课堂教学的主航道。
三、教学活动中应用疫苗学多媒体课件注意事项
1．幻灯片的播放与板书的有机结合
多媒体技术也对教学产生了积极的效应，对于提高教学质量、提高教学效率，创设教学情景和优化教学环境起到了非常重要的作用，在很大程度上改变了传统教学中教和学的方式。课堂需要通过多媒体引入课外学习资源，引导学生入情入境地体验、亲历学习过程，但同时也离不开教师形象直观的板书[4]。
在具体的教学活动中必须将二者有机的结合起来，发挥二者的优势。过分依赖多媒体也会导致教学手段的单一。
例如：在教学活动中，板书更有利于学生理清知识结构，好的板书设计可从教学内容中选出关键性的词语，展示知识见的内在逻辑。由此，学生能提纲挈领地掌握知识。教师在分析知识点时，可以随着讲解的进度把知识结构的布局标在黑板上，使学生对整个知识系统的脉络有一个整体的把握。另外，以板书形式呈现的内容具有持久性的特点，可以较长时间保留在黑板上，对于接下去的教学环节也有铺垫作用。此外，书写板书也利于师生间的交流，不仅教师的手写字会让学生倍感亲切，教师的书写态度也能对学生起到潜移默化的作用。板书的内容可以随着课堂活动的展开而随意增加，因此，它比多媒体更适合于课堂提问和讨论等环节。在课堂上，学生会提很多问题，也会有很多精彩的发言。这些发言和问题完全可以记录到黑板上，然后再逐一讨论，这比播放事先准备的课件更具有针对性，更能收到良好的效果。
2．强化教师在教学活动的主导地位
教师在课堂中的主导地位是多媒体所无法取代的，但如果教师一味地依赖多媒体，只是在讲台上摆弄多媒体课件而不深入讲解，也没重难点的板书，“只见机器不见人”，学生眼睛始终盯着屏幕，这是一种繁琐的单调。
“教师在大部分时间内，往往是手握鼠标，面对机器，形同屏幕解说员”，全然忘记了学生这个主体。这样的教学表面看似热闹，实则学生面对屏幕心静如水，收获寥寥，降低了学习效果。有时候或许课堂气氛热热闹闹，学生也很活跃，而老师忽视了教学密度，课后学生的脑子里也还是空荡荡的。任何情况下，教师都应该是课堂的主导者，所以老师的作用不能等同于放映员，多媒体教学也不能陷入华而不实的境地。
3．突出教学主体，把握好运用多媒体的时机
学生不是器皿等待被填满，而是燃料等待被点燃。在教学活动中，要时刻牢记学生的主体地位；在课堂教学中， 学生也是知识处理的参与者和加工者。课堂上的教学活动都应服务于学生这一主体， 不能一味地进行知识的灌输，而是要多给学生提供讨论和训练的机会，培养学生主动学习的意识。例如：在疫苗抗原设计的环节，学生进行上机操作，确保每个同学都能应用相应的软件对疫苗抗原进行分析和筛选。同时由此及彼，通过布置课后作业，让学生深入了解疫苗设计的基本程序。通过建立网上互动平台的疫苗学课程论坛，活跃学生的思维，及时了解学生在学习中遇到的各种问题，把握学生的个性化需求。
此外，还要把握运用多媒体的最佳时机。在课堂教学中， 当学生处于学习欲望最强烈、最需要帮助的时候， 运用多媒体对学生进行启发和点拨， 会取得令人满意的效果。例如：当讲解疫苗的分类时，通过多媒体表格列举各类疫苗的抗原制备方法、免疫效力、生产成本，可使学生对不同种类的疫苗的特点有一个横向的比较，留下较为清晰的印象。
参考文献：
[1] 陆芳，卢会志.学生认知活动规律在多媒体教学中的应用[J].泰安教育学院学报岱宗学刊，2010，（2）：64-65.
[2] 何书英.将计算机辅助教学应用于生物制药工艺学课程[J].药学教育.2005，21（1）：49-50.
关键词：甲型肝炎；甲型肝炎病毒；疫苗；免疫效果
甲型肝炎（简称甲肝）是由甲肝病毒（HAV）引起的一种以肝脏损害为主的全身性传染病，临床上主要表现为急性起病，有乏力，食欲减退，肝功能异常等症状，部分病例出现黄疸。甲型肝炎的传甲染性强，主要经粪-口途径传播，发病率高，迄今仍是全世界普遍的公共卫生问题，全球年发患者数约140万，实际病例则是报告数的3～10倍[1]。我国是甲肝的高发流行区，随着甲肝疫苗的使用，甲型肝炎在我国的流行已得到有效的控制。本文就甲肝病毒及甲肝疫苗的使用现状及研究进展进行综述。
1甲肝病毒（HAV）
甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinstone等应用免疫电镜方法在急性肝炎患者的粪便中发现的。1991年国际病毒分类委员会将HAV重新分类为RNA病毒科的一个新属：肝病毒属， 又称为嗜肝RNA病毒属（Hepar naviruses）。
1992年，美国Robertson等提出了HAV基因分型的概念。他们将全世界的HAV分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ7个基因型，其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅶ型来自人类，而基因Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型来自猿猴。2002年，Pérez-Sautu 等[2]对种系研究进一步优化，将全世界HAV 基因型重新划分为6个基因型，将先前的Ⅶ型命名为ⅡB亚型。Ⅰ～Ⅲ型属于人源基因型，另三个属于猴源基因型（Ⅳ～Ⅵ）。其中基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均又划分为A、B 两个亚型。
分子流行病学研究显示，基因Ⅰ型是流行最广泛的人源基因型，其中基因ⅠA型比基因ⅠB型分布更为广泛。美国、巴西、欧洲、中国及日本等均以基因ⅠA型流行为主[3]。IB亚型来自北非、澳大利亚、欧洲和日本等毒株。基因IIIA亚型来自印度、尼泊尔、马来西亚，IIIB亚型主要来自日本、丹麦等国[4]，而基因Ⅱ型则很少报道。此外，HAV基因Ⅲ型在俄罗斯、印度、韩国等国家的流行病例近年来呈上升趋势，以至代替基因Ⅰ型成为主要的流行株[5]。
基因分型还证明了HAV各基因型间在VP1/PX区核苷酸异源性为15～25%，人类HAV各基因型之间核苷酸异源性为15～25%。尽管各型HAV之间存在不同的基因变异，但HAV只有1个血清型，这为发展疫苗预防甲肝提供了理论依据。
2甲肝疫苗的使用现状及免疫效果
我国政府十分重视对甲肝的控制和预防，自1979年细胞培养甲肝获得成功后， 疫苗的研制随即开始。我国首创研制的甲肝减毒活疫苗，经过多年应用证明疫苗是安全的，并对降低甲肝发病率起到了一定的作用。研制的冻干甲肝减毒活疫苗，弥补了液体减毒活疫苗的不足，并且其具有稳定性良好，效期长，冷藏条件要求不高等优势[6]。
2.1减毒活疫苗的使用现状及免疫效果 我国甲肝减毒活疫苗的减毒株有H2和L-A-1。1988年毛江森领导的科研组最早取得了具有国际领先水平的科技成果H2减毒株，1992年起甲肝减毒活疫苗在国内推广应用。以后胡孟冬等又研究成功了L-A-1株。甲肝减毒活疫苗是用遗传稳定，对人安全的疫苗株接种于人二倍体细胞后，经培养收获病毒液并加适宜保护剂后制成。
国内使用的甲肝减毒活疫苗有两种剂型：液体剂型和冻干剂型。通过对两种剂型的对比发现，冻干剂型比液体剂型的甲肝减毒活疫苗便于运输保存，接种1针冻干型的抗体转阳率在80%以上，最差的效果也在75%以上[8]。通过对冻干型甲肝减毒活疫苗的接种测试发现，在局部或者是全身反应的观察上来看，甲肝减毒活疫苗的安全性与稳定性很好，并且不会对接种者造成其他的肝损伤[9]。缺点是热稳定性差，在4℃保存3个月疫苗免疫性呈明显下降，只能保存1～2个月。目前对国产甲肝减毒活疫苗生产的抗体维持时间仍然在进一步观察研究。
2.2灭活疫苗的使用现状及免疫效果 甲肝灭活疫苗是1991年由Smith-Kline公司在比利时研究成功， 并在欧洲使用。甲肝灭活疫苗是对甲肝病毒进行一定的处理，使病毒完全丧失活性，从而得到被杀死的病原微生物，进而制成甲肝灭活疫苗。
甲肝灭活疫苗最大的优点是耐热力强（4℃贮存，有效期为2年），抗体维持时间长。缺点是价格昂贵。通过在美国甲肝高地方性流行的社区进行接种实验后发现，接种1针甲肝灭活疫苗的保护率为百分之百，接种2针或者2针以上者，免疫8年后，99%～100%接种者任具有保护水平的抗体。抗体衰退的动态模型提示，保护的持续期限至少可达20年，甚至可能达终生。
3甲肝疫苗的研究进展
随着近年来分子生物学和免疫学的进展，基因工程技术已在新型疫苗的研究中得到广泛应用。大致有以下几种方法：合成多肽、由原核或真核细胞表达的HAV 蛋白中获得亚单位疫苗、活疫苗载体或合成病毒疫苗、表达的病毒空颗粒。其中基于病毒空颗粒的基因工程疫苗是最理想的制备疫苗的方式。因为病毒空颗粒的结构与野生型病毒相同或相似，可含有与野生型病毒相同或相似的抗原决定簇。近年来发现，多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统中都能够有效地实现自我组装，形成的病毒空颗粒具有高度的免疫原性[10]。从发展的眼光看，分子生物学技术是研制甲肝疫苗最有希望的方法。从现实角度看这些方法受制约于高度依赖某种病毒的特性以及大规模生产的可能性。
4展望
甲型肝炎是全球范围严重的公共卫生问题。尽管目前已有安全有效的疫苗可供预防，但是仍然有相当一部分比例的甲型肝炎患者未得到有效的预防和治疗。目前的研究表明，我国目前使用的甲肝减毒疫苗和甲肝灭活疫苗的安全性和免疫原性均良好，其中灭活疫苗的保护性免疫反应维持时间较长，安全性较减毒疫苗可靠，可是制作费用一直居高不下，这个直接影响了灭活疫苗的推广应用，而减毒疫苗的价格较灭活疫苗低。基于病毒空颗粒相关技术的新型HAV 疫苗，则具有广阔的应用开发前景。
参考文献：
[1]凌志强.甲型肝炎的流行病学和免疫预防[J].国外医学流行病学传染病学分册，1999，26（2）：65-68.
[2]Pérez-Sautu U， Costafreda MI， Lite J， et al. Molecular epidemiology of hepatitis A virus infections in Catalonia，Spain，2005-2009： Circulation of newly emerging strains[J].J Clin Virol，2011，52（2）：98-102.
[3]Toyoda H， Kumada T， Kiriyama S， et al. Clinical and Molecular characteristics of hepatitis A virus infections during the years 1992-2003 in Ogaki，a centrally located city of Japan[J].J Clin Virol，2009，44（2）：145-148.
[4]陈勇，甲型肝炎病毒基因分型研究进展[J].国外医学流行病学传染病学分册，1998，25（3）：99-101.
[5]Kulkarni MA， Walimbe AM， Cherian S， et al. Full length Genomes of genotype ⅢA Hepatitis A virus strains（1995-2008） from India and estimates of the evolutionary rates and ages[J].Infect Genet Evol，2009，9（6）：1287-1294.
[6]黄贵彪，万宗举，李荣成，等.国产冻干甲型肝炎减毒活疫苗的安全性与免疫原性观察[J].中华流行病学杂志，2003，24（4）：328-3291.
[7]刘怀风，张新江，张建立，等.甲型肝炎减毒活疫苗与灭活疫苗不同免疫程序免疫后7年血清学效果观察[J].中国疫苗和免疫，2009，15（4）：300-303.
[8]张淑雅，毛江森，黄海鹰，等.甲型肝炎减毒活疫苗（H2减毒株）在人体接种的安全性观察[J].中华医学杂志，2008，67（16）：687-689.
