基因治疗的策略

开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇基因治疗的策略，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。

第1篇

胶质瘤即神经上皮组织肿瘤，是最常见的颅内肿瘤。目前手术、放疗、化疗等常规治疗效果差，而随着基因技术的不断深入研究，如何能利用基因有效治疗胶质瘤成为研究热点， 其基因治疗的分子策略主要包括细胞周期调节、自杀基因疗法、免疫基因疗法、抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、PKR途径等，靶向基因治疗主要由临床前概念已过渡到临床试验性治疗的靶点选择，主要包括PI3K／AKT／mTOR和Ras／MAPK／CDK／Rb为代表的受体酪氨酸激酶通路。而最有研究前景的是将尚处于研究阶段的基因治疗与传统化疗、放疗的结合［1］。本文就胶质瘤的基因治疗分子策略及靶向治疗进行综述。

1 胶质瘤基因治疗的分子策略

当前胶质瘤基因治疗的分子策略包括以下几点：细胞周期调节基因及凋亡基因；自杀基因；免疫调节基因；抑癌基因；血管生成抑制基因；PKR途径。以上各策略可相互联系，并相互联合。

1.1 细胞周期调节基因及凋亡基因

P53与E2F1作为2种非常重要的抑癌基因， 维持基因组的稳定， 激活细胞凋亡。两者所不同的是P53基因可调节细胞周期，其变异能明显降低恶性脑胶质瘤对化疗的敏感性， P53基因在脑胶质瘤的高突变率为脑胶质瘤的靶向性基因治疗提供了重要的基础［2］。与P53基因不同的是，E2F1是直接调控细胞周期［3］，其不良反应是它对正常细胞的毒性和潜在的致瘤性。

1.2 自杀基因

自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位。自杀基因(suicide gene)疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物，以达到杀死肿瘤细胞为目的。不少学者［4］通过研究发现， 只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀灭，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”。该效应可使仅部分肿瘤细胞转染了自杀基因的整个肿瘤均受到经自杀基因转化了的抗癌“药”的攻击而全部消退。至于旁观者效应发生的机理， 多数研究表明它与细胞间的缝隙连接和免疫效应细胞在肿瘤病灶中的浸润有关。（1）细胞毒性产物通过细胞间的缝隙连接进入邻近细胞。（2）被破坏的细胞释放毒性物质和凋亡小体进入周围微环境， 并被邻近细胞摄取。（3）自杀基因杀死的细胞释放细胞因子， 进一步吸引免疫细胞进入肿瘤， 介导抗肿瘤免疫反应。（4）导致血管内皮细胞死亡， 引起肿瘤细胞缺血坏死。在肿瘤细胞中旁观者效应的物质基础一缝隙连接数量较正常细胞缺乏， 利用环腺昔酸（cAMP）可以诱导缝隙连接形成或导入缝隙连接的亚单位连接素43（connexin 43）的cDNA， 从而大大加强旁观者效应［5］。临床上，意大利的Colombo等［5］用结合的IL2／HSV．tk基因疗法治疗再生的多形恶性胶质细胞瘤，他们向瘤内注射转录病毒载体引导细胞(PVPC)，然后静脉注射GCV，结果显示，实验组的患者的存活率提高。

1.3 免疫调节基因

免疫调节基因主要是通过基因重组技术来增强机体的抗肿瘤免疫功能达到治疗肿瘤的目的，这主要包括3个方面：（1）肿瘤抗原提呈功能的加强，如从临床患者的血液和手术切除标本中获取自身抗原提呈细胞，在体外经GMCSF等细胞因子作用下扩增，体外表达肿瘤抗原的DNA或mRNA，然后回输入患者体内；（2）细胞因子基因转导肿瘤细胞；如将一基因体外转导脑胶质瘤细胞， 体外培养扩增后接种于病人自身皮下， 可发现肿瘤病灶明显缩小， 颅内胶质瘤明显坏死。（3）B7共刺激分子基因导入肿瘤细胞［7］。Mukhecjee等［8］在靶向T11结构的一种蛋白质(aprotein known as T11 target structure，T11 )注射N乙基·N·亚硝基脲（ ENU)诱导的免疫抑制大鼠后，观察外周和神经系统的改变以及脾，脑浸润淋巴细胞的细胞毒性活性变化，用流式细胞仪测定肿瘤细胞和小神经胶质细胞含量，发现T11TS不仅增加了凋亡细胞的数目，同时降低了分裂细胞数目，而脾和脑浸润细胞的细胞毒性也有显著增加。数据证实了TILTS对实验脑肿瘤的特殊细胞凋亡作用。

1.4 抑癌基因治疗

抑癌基因亦称为抗癌基因，是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆出20余种抑癌基因，而D53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，不少研究也证明肿瘤的生成会伴随p53的缺失。Michiue等［8］使用了基因突变的p53蛋白，将羧基末端的多赖氨酸残基用精氨酸取代的产物，转导人胶质瘤细胞，由于存在对Mdm2(鼠双微基因)介导的遍蛋白化耐受性，这种蛋白具有较强的转导调节活性，同时抑制胶质瘤细胞的增殖，表现了其在P53基因治疗方面的应用潜力。

1.5 血管生成抑制基因

固体肿瘤的生长及增殖，需要新生血管提供足够的血运。而胶质瘤自身能产生一些血管生长因子，促进血管内皮细胞的分裂增殖。因此抑制肿瘤血管形成成为冶疗肿瘤的另一策略。早在1971年Fdkamn首先发现肿瘤血管生成因子，并由此提出了对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预，经抗血管生成途径治疗肿瘤的新方法。它的优势是：（1）抗肿瘤血管生成治疗不是直接攻击肿瘤细胞， 不会产生放疗和化疗所造成的肿瘤细胞遗传性状的不稳定和治疗后耐药性。（2）由于肿瘤部位的血管内皮细胞比肿瘤细胞遗传性状稳定， 而正常血管内皮细胞处于不分裂的状态， 故抗肿瘤血管生成治疗对其影响不大。（3）另外由于内皮细胞本身就浸泡在血液中， 药物到达血管比到达肿瘤要容易得多。这说明抗肿瘤血管生成治疗与传统治疗相比有内在的优势， 已成为一种重要辅助治疗方式。胶质瘤作为一种实体瘤， 抗肿瘤血管生成治疗也具有重要价值。

1.6 PKR途径

活化性双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一种生长抑制性蛋白， 通常它能使病毒感染的细胞活化， 并诱导其死亡［10］。

2 靶向性基因治疗研究

临床试验性治疗的靶点选择主要集中在PI3K／AKT／mTOR和Ras／MAPK／CDK／Rb为代表的受体酪氨酸激酶通路，并已开发出一系列靶向小分子药物和单克隆抗体，包括酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂、整合素抑制剂等［11］。

2.1 PβK／AKT／mTOR信号转导通路

EGFR在大多数胶质瘤中过度表达，而在正常脑组织中则低表达。用反义EGFR cDNA转染C6胶质瘤细胞， 观察到内生性的及蛋白水平明显下降， 在荷瘤鼠试验中， 肿瘤的生长明显被抑制［12］。PβK／AKT／mTOR信号转导通路是EGFR下游作用的靶通路之一［13］。PβK／AKT／mTOR信号转导通路靶向治疗方案包括：（1） 以EGFR为抑制靶点，阻断经酪氨酸激酶级联反应介导的信号转导。EGFR小分子抑制剂包括：埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(1apatinib)，可以同时抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的AEE788；EGFR单克隆抗体：西妥昔单抗(cetuximab)为人／鼠嵌合的EGFR IgG抗体，通过在细胞外与EGFR结合，阻断配体如表皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)和转化生长因子一仅(transforming growth factorα ， TGFα)与EGFR结合及经受体酪氨酸激酶介导的信号转导。（2）以m R为抑制靶点：小分子抑制剂包括：雷帕霉素(rapamyein又名西罗莫司，sirolimus)及其衍生物西罗莫司脂化物(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)和Deforolimus(AP23573)等［11］。

罗军.胶质瘤的基因治疗进展 2.2 Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路

Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路也是酪氨酸激酶下游作用的靶通路。Ras蛋白是鸟苷酸结合蛋白家族成员，对三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)具有高度亲和力，并具有同源性GTP酶的活性，有“分子开关”的作用［14］。Ras／MAPK／CDK／Rb信号转导通路靶向治疗方案包括：（1） 以Ras蛋白为靶点，抑制Ras蛋白的法尼基化修饰，阻断Ras蛋白定位于细胞膜内侧。替吡法尼(tipifamib)和洛那法尼(1onafarnib)均是法尼基转移酶抑制剂。（2） 以Raf蛋白为抑制靶点，阻断Ras信号进入MAPK通路。索拉非尼(sorafenib)可以通过抑制Raf及其下游信号通路，直接抑制肿瘤生长；另外，索拉非尼也可抑制VEGFR和血小板源生长因子受体(plateletderived growth factor receptor， PDGFR)，阻断肿瘤新生血管的生成，间接抑制肿瘤生长［11，14］。

参考文献

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第2篇

【关键词】 卵巢癌；基因治疗；综述

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一， 由于其组织学类型较多， 缺乏有效的早期诊断方法， 且手术和放化疗疗效不佳， 卵巢癌患者的5年生存率仍较低， 成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。在对于卵巢癌治疗方法的探索中， 基因治疗令人瞩目， 在动物实验及一些Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床研究中取得了一定疗效， 成为继手术、化疗、放疗之后的一种全新的治疗模式。

1 卵巢癌相关基因

和其他肿瘤一样，卵巢癌的发生是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果。目前已发现K-ras、c-myc、c-erb-B2等癌基因和p53、p16等抑癌基因与卵巢癌密切相关，充分认识卵巢癌特异性基因损害的机制有利于制定合理的基因治疗方案。K-ras 编码蛋白p21 ，通过点突变被激活，使其丧失三磷酸鸟苷酸(GPT)激酶活性，致GTP降解成二磷酸鸟苷酸(GDP)的速度减慢，持续的激活靶分子，使细胞持续增殖，从而导致癌的形成［1］。c-myc编码一种转录因子，与细胞周期由G0期向G1期的转变有关，c-myc的扩增和过度表达，使其丧失了转录控制能力， 以致促使细胞大量增殖［2］。c-erb-B2编码一种细胞表面蛋白，结构与表皮生长因子受体(EGFR)相似，在乳腺癌和卵巢癌的发生中起重要作用［3］。还有一些癌基因如int2、fms、mdd、akt2、c-fos、H-ras、raf-1等，在卵巢癌中偶尔扩增，但并不被认为起重要作用。p53基因是目前研究最深入的抑癌基因，30%～80%的卵巢癌患者存在p53突变。p53其功能好比“分子警察”，监视着细胞基因组的完整性，如果DNA受损，则p53基因通过转录调控机制使细胞分裂停滞于G1期， 以便细胞有足够的时间修复损伤，若修复失败，则启动程序化死亡而引发细胞自尽，即细胞凋亡。此外，p53 蛋白的积累可能加速原发肿瘤的转移和扩散。p53缺陷对化疗的耐受有决定意义［4-5］。多肿瘤抑制基因(MTS1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码蛋白为p16，通过与细胞周期素(cyclinD1)竞争性结合细胞周期素依赖激酶(CDK4)，从而使CDK4失活，阻止细胞由G1期进入S期，进而抑制细胞分裂并阻止其向恶性方向发展［6］。

2 卵巢癌基因治疗机制

肿瘤的发生是多因素、多步骤过程，包括了癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活而导致细胞增殖增强与凋亡受到抑制。卵巢癌的发生亦是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果，如:erbB、c-myc、K-ras等癌基因的突变与扩增和(或)抑癌基因RB、p53、p16 等的功能丧失均可导致肿瘤发生。通过基因治疗即把正常基因或重组治疗基因经分子生物学技术手段转入异常细胞的DNA系统中，以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达，起到治疗作用［7］。目前，卵巢癌基因治疗方案主要有:自杀基因治疗、基因表达封闭、多药耐药基因治疗和联合基因治疗。

3 卵巢癌基因治疗载体

实现肿瘤基因治疗的关键是要使用高效、安全的基因导入系统。常用病毒和非病毒系统作为基因导入载体。病毒载体能有效地将原位基因导入肿瘤细胞中，这种带有抗癌基因并特异性杀伤肿瘤细胞的病毒被称之为基因-病毒系统。体内外实验表明，腺病毒介导的卵巢癌转基因治疗能有效抑制卵巢癌细胞生长，并延长卵巢癌小鼠模型生存期［8］。非病毒的质粒内插入具有治疗作用的目的基因及所有顺式调控元件如启动子、增强子及沉默子序列和转录处理信号时，就可用于哺乳细胞的转染，当含有一个病毒复制子时，即可指导质粒在靶细胞核中扩增。质粒与病毒载体相比，虽然基因转染率较低，但不会整合入宿主的基因组而产生致病的野生型病毒。近年来以质粒为载体的基因治疗多使用阳离子脂质体为导入介质，目前阳离子脂质体介导的转基因治疗卵巢癌已进入Ⅰ期临床试验［9］。基因载体系统增强抗癌能力的方法有:①在载体上携带多种治疗基因联合作用，以提高病毒对癌细胞的杀伤力;②修饰载体的外壳蛋白使其特定地与肿瘤细胞结合，并增加其对肿瘤细胞的亲和力;③调控载体的肿瘤特异性启动子或增强子，使治疗基因的表达限于肿瘤细胞，避免对非肿瘤细胞造成伤害。理想的靶向性基因转移载体一直是学者们努力的方向。

基因重组技术可利用肿瘤细胞表面一些特异性高表达的受体或抗原，编码与这些受体或抗原特异性结合的基因片段插入到病毒外壳糖蛋白(Env)基因中，使该载体表面出现一种嵌合Env，从而提高病毒对宿主细胞的亲和性，同时降低它与非靶细胞结合的机会［10］。结构蛋白VP22是Ⅰ型单纯疱疹病毒的主要壳膜蛋白，有细胞间扩散作用的特性，可改善基因治疗效率。VP22和胸苷激酶(tk)融合基因及丙氧鸟苷自杀基因系统对肿瘤细胞具有特异靶向性生长抑制作用，利用卵巢癌细胞表面高表达的Ⅰ型跨膜粘蛋白MUC1，将抗MUC1单链抗体ScFv与VP22 载体的包膜结构VSVG的转膜区和胞质区部分构建到一起，以此膜结构包装的目的基因VP222tk能靶向性的结合并杀伤表达MUC1的卵巢癌肿瘤细胞［11~13］。

近年来研究发现，柯萨奇腺病毒受体(CAR)在病毒细胞的入口中起决定作用，在腺病毒载体的临床实验中，CAR表达水平上调有利于腺病毒基因系统导入卵巢癌细胞系，并增强表达p53腺病毒的细胞毒作用，该作用是由于CAR是细胞黏附蛋白，并可分裂细胞与细胞间的连接，因而使腺病毒基因系统更易导入癌细胞［14-15］。此外，在卵巢癌细胞系和原发卵巢癌中表达的CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，在CD40腺病毒靶向系统中可增加靶基因融合蛋白的数量并有剂量依赖性，CD40 介导的载体病毒转染可被用于不依赖CAR途径的基因转换，这就解决了CAR表达水平低的肿瘤细胞基因转染问题［16］。

4 卵巢癌的基因治疗策略

4.1 自杀基因治疗 自杀基因治疗卵巢癌是近年来研究的热点，其中有组织特异性启动子OSP-1（ovarian-specific promoter-1）参与调控，使自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（erpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk）与前体药物无环鸟苷（ganciclovir，GCV）结合，HSV-tk/GCV通过转染肿瘤细胞使tk基因在癌变的组织或细胞异地表达，从而使无毒的前体药物GCV转化为有细胞毒性的磷酸化的GCV产物，抑制DNA酶活性，阻止DNA合成，进而杀灭肿瘤细胞。HSV-tk 抗肿瘤效应的另一原理是“旁观者效应(bystander effect）”，即转导细胞对非转导细胞的细胞毒作用。已证实腺病毒介导的HSV-tk基因治疗裸鼠间皮瘤、结直肠癌、卵巢癌实验中可使肿瘤消退［17-18］。体外研究结果显示：与间皮细胞结合的HSV-tk对GCV杀灭肿瘤细胞的作用非常敏感，能增强GCV 的“旁观者效应”，使肿瘤生长受到明显抑制［19］。

4.2 基因表达封闭——RNA干扰（RNAi） RNAi在哺乳类动物细胞中是利用同源双链小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）诱导特异性基因表达抑制，其主要发生于转录后基因水平，所以又称为转录后基因沉默（post transcription gene silencing，PTGS）。双链RNA（double strand RNA，dsRNA）首先被切割为siRNA，siRNA 与一些蛋白形成RNA 引导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC），介导基因表达沉默。由于RNAi的特异性、高效性、方便性，已成为研究基因功能、肿瘤基因治疗的新方法。Wani等［20］利用RNAi技术抑制肝细胞刺激因子-1在卵巢癌透明细胞瘤中的表达，使其mRNA水平分别降低45%，并诱导其细胞凋亡增加。Bignotti等［21］将脂肪酸合酶（fattyacid synthase，FAS）的siRNA转染到培养的卵巢癌SKOV3细胞中，导致FAS基因的表达沉默，与对照组相比，HER2的表达下降60%并诱导细胞凋亡。以上研究结果表明，利用RNAi技术对于治疗和预防卵巢癌具有一定的作用并显示出巨大的发展潜力。

4.3 多药耐药基因治疗 化疗是治疗卵巢癌的常用和有效的手段，但肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性（multidrug resistance，MDR），是造成化疗失败的主要原因。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）在卵巢癌细胞中过表达，与卵巢癌化疗的多药耐药的发生密切相关，而P-gp被MDR基因所编码。研究者利用反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ODNs）抑制MDR基因而降低P-gp的转录，其中双链ODNs比单链ODNs作用更有效，可阻遏卵巢癌细胞A2780中P-gp的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［5，9］。Bcl-2基因在卵巢癌细胞中高表达并参与化学药物耐药的发生，E1A 基因联合反义寡核苷酸Bcl-2（antisense oligonucleotide Bcl-2，Bcl-2-ASO）治疗卵巢癌可明显促进癌细胞凋亡（凋亡能力的提高主要是由于细胞色素C的释放以及Bcl-2-ASO激活caspase-9所致），抑制癌细胞增殖，减少耐药性的发生［15］。

4.4 联合基因治疗 卵巢癌的发生是多种致病因素相互作用的结果，针对一种因素的治疗往往不能使肿瘤的生长受到明显抑制，而各种自杀基因系统发挥作用的机制并不相同。比如CD和HSV-tk融合蛋白的表达可使抑制肿瘤的效应明显增高。自杀基因发挥旁观者效应主要取决于机体自身的免疫力即免疫反应的强弱，自杀基因系统可分别与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF）、白细胞介素2（IL-2）、干扰素（IFN）等免疫细胞因子有效结合，一方面对肿瘤细胞有直接杀伤作用，另一方面又可使机体对肿瘤的免疫应答提高，发挥其旁观者效应从而使肿瘤生长受到抑制。针对卵巢癌的RNAi技术可同时抑制肿瘤发病的几个关键基因，从而抑制肿瘤生长［22］。

5 卵巢癌基因治疗的临床应用

由于实验室的研究结果令人鼓舞，卵巢癌基因治疗的临床试验正在进行中，目前已完成了利用不同的转染途径将目的基因应用于人卵巢癌的分子治疗。Haralambieva等［23］在其Ⅰ期临床试验中，利用逆转录病毒载体转染BRCA1基因对复发性晚期卵巢癌患者进行临床治疗，观察到载体稳定表达，抗体反应很小，肿瘤消退。但在其Ⅱ期临床试验中，在对未广泛转移的早期卵巢癌患者，应用同样的方法，由于载体表达不稳定和很快产生抗体反应，不得不终止治疗。他们认为免疫系统状态在基因治疗的有效性上起到关键作用。Menczer等［24］利用未改进的腺病毒载体介导转染HSV-tk基因于复发性卵巢癌患者，29%的病例有一过性可控制的与载体有关的发热。Psyrri等［25］利用腺病毒载体将野生型p53基因转入复发性卵巢癌患者的腹腔，患者有可接受的毒性，与顺铂结合治疗，可使血CA125下降和症状改善。

6 卵巢癌基因治疗的展望

基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景，无论是在动物试验或前临床试验中，卵巢癌基因治疗的方法、思路正在不断创新与完善。但基因治疗本身还存在着许多问题，如：载体转导的效率低、稳定性不佳及不能有效定位于靶组织或靶器官等。另外，多数肿瘤的形成都不是单一的基因突变，那么以单一突变基因为靶向的治疗很难控制整个肿瘤，所以需要加强多基因为靶向的实验研究。学者们正针对卵巢癌基因治疗中存在的一些问题如载体的改良、目的基因的靶向性等进行更加深入的研究， 相信随着分子生物学理论和技术的发展， 人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元，卵巢癌的基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。

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第3篇

【关键词】超声微泡；双自杀基因慢病毒载体；基因治疗

【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02

目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装

1.1.1目的基因的扩增与TA克隆

提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收

PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序；

1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定

将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度：

病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。

1.2 载药粒微泡的制备于鉴定

1.2.1载药粒微泡的制备

声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。

1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。

采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。

（1）粒径大小比较

载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。

（2）包封率的测定

将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率：

包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100%

（3）载药量的测定

以下式计算载药量：

载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100%

其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。

（4）稳定性测定

4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。

取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8d、10 d经光学显微镜（×400）进行观察其形态变化。第10 d的取该样品由Malvern粒径测量仪检测粒径。4℃冰箱贮存10 d后，RP-HPLC测定载药微泡溶液的包封率。

2 结果

2.1 病毒滴度检测结果：

经荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度，获得病毒滴度为（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。

2.2 载药微泡质量鉴定：

2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的声诺维微泡与空白声诺维微泡粒径的对比观察：

载质粒微泡呈乳白色混悬液，用磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline PBS）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。

镜下比较观察载质粒微泡（图A）与空白微泡（图B）的形态，其形态相近，为近似的圆形微泡。其粒径范围92%在2～5μm之间，平均粒径约2.90μm（图A），粒径大小均相似。

2.2.2 包封率和载药量测定结果

采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量，

得到结果：

包封率为90.6±3.1%。载药量为29.2±0.9%。

2.2.3 稳定性测定：

4℃冰箱贮存10 d后，可见仍为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡粒径大小未见明显变化，微泡形态好，大小均匀，相互之间无明显聚集现象，分层情况基本同前，样品经光镜下观察及Malvern测量仪检测发现，与制备初始相比，平均粒径大小约3.08μm），未见明显变化；RP-HPLC测得包封率：86.1±2.8%，没有出现明显药物渗漏。

3 讨论

基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是近年来新兴的肿瘤基因治疗的研究热点。自杀基因疗法是利用基因工程技术将自杀基因转入肿瘤细胞进行表达，注入体内的无毒或低毒的前药在表达的特异性酶作用下转化成毒性产物，该产物可作为DNA合成的核苷替代物掺入到DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起肿瘤细胞的死亡[6]。

本研究所采用的克隆方法并不是将PCR产物直接与表达载体相连接，而是先将PCR产物TA克隆，构建成重组T质粒后再将目的基因与表达载体酶切连接，主要是考虑到：PCR产物直接进表达载体成功率不高；而先进T载体，再酶切连接表达载体，可减少碱基错配，提高成功率。目前己发现的自杀基因体系已有十多种，本实验选择胞嚓陡脱氨基酶基因（CD）和单纯疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK简称TK）来构建双自杀基因质粒，是因为研究表明[7]，二者作用机制具有很强的互补性，将其连接在一起，构成融合基因，使两个自杀基因体系协同作用，能显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。同时选用肿瘤特异性启动子KDRP，突破对肿瘤细胞类型的依赖性，扩大肿瘤基因治疗谱。运用增强型GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，可直观的检测目的基因的检测和计算病毒滴度。而慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞，容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期地表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒，己成为当前基因治疗中载体研究的热点。

超声微泡造影剂声诺维可作为一种新型基因载体。在一定剂量超声波的辐照下，利用微泡在超声介导下的空化效应介导目的基因的靶向释放和导入。国内外许多学者通过体内外实验证实空化效应是超声介导基因转染的主要机制，微泡造影剂作为外源性空化核被引入体内后大大增加了单位体积内空化核的数量，降低超声波的空化闭值，增强空化效应，从而提高基因转染效率[3-4]，尤其在抗肿瘤治疗、溶栓治疗等方面具有潜在的重要应用价值。经静脉注入载药微泡后，用超声辐照特定部位，含气体的超声造影剂在超声波作用下会不断地产生非对称性收缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡破裂药物被释放到超声所辐照的局部组织中。在这一过程中，微泡作为空化核增强空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁甚至组织间隙，从而发挥定位靶向治疗作用[2]。

而载药微泡的外观、粒径大小、包封率、载药量等是衡量载药脂质微泡质量的最重要指标。我们制作的载双自杀基因慢病毒载体微泡乳化良好，大小均匀，粒径范围92%在2-5μm，与空白微泡相似。微泡内药物的包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%，均达到较理想的水平。此外稳定性也是衡量载药脂质微泡特性的主要指标之一，它能反映脂质微泡溶液包封率随时间变化的情况。脂质微泡作为药物载体稳定性是指被包裹药物在脂质微泡中的滞留性。经由本实验证实，我们制作的载药微泡同时也具有较高的稳定性。

本研究联合了双自杀基因的杀伤效应、KDR启动子的肿瘤特异性、慢病毒载体的高载性和超声微泡靶向的可控释性等多种技术优点，制备出了较为理想的载有靶向基因药物的微泡，期望为进一步临床实施可视状态下的肿瘤的基因治疗提供一种更加安全、高效的策略。

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作者简介：

郝轶，硕士，主治医师，新疆医科大学附属肿瘤医院，830011。

基金项目：

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝轶）

第4篇

【摘要】 [目的]检测自杀基因系统hsv1tk/gcv对鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。[方法]将b16/tk(tk+)细胞和未经修饰的b16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组细胞于96孔板中培养,加入丙氧鸟苷(gcv)至157μmol/l,用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测不同tk+比例的hsv1tk/gcv系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下，以gcv注射液按100 mg·kg-1·d-1进行治疗,检测瘤块体积、质量(湿重),测定抑瘤效应。[结果]tk+比例10%以上,hsv1tk/gcv系统对黑色素瘤b16细胞均有明显杀伤效应,但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看,20%以上tk/gcv治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(p <005),以80%tk/gcv组最显著(p <001);从移植瘤质量看,80%tk/gcv治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(p <001),其他组虽随着tk细胞比例的增高瘤块平均质量下降,但差异无显著性意义。[结论]hsv1tk/gcv系统对鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应均随着b16/tk细胞比例的增高而增强，已建立显示出体外杀伤效应和体内抑瘤活性的小鼠黑色素瘤自杀基因系统。wWw.133229.COm

【关键词】 黑色素瘤;自杀基因系原/治疗应用;基因疗法;细胞培养

恶性黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤,其发病率在世界范围内位居所有恶性肿瘤中第7位。致死率高的主要原因在于黑素瘤细胞本身抗凋亡能力强及生长微环境血供丰富。肿瘤的基因治疗,特别是肿瘤自杀基因治疗已经成为最具应用前景的、崭新的肿瘤综合治疗措施之一。目前已在临床病人及实验动物上广泛应用于肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗,并已观察到较好的效果[1-2]。该方法的一个显著特点是存在旁观者效应(bystander effect), 即加入前体药物后,不仅导入了自杀基因的细胞被杀死,邻近未导入的细胞也可被杀死[3-6],但也存在许多不足,限制其广泛应用的关键之一是不能把目的基因导入每一个待治疗的受体细胞,体内转染率通常只有10%左右。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高自杀基因疗效的重要策略。本实验观察了不同比例b16/tk与b16对体外和体内抑瘤效应的影响,为探讨中医药增强自杀基因疗法疗效的可能性进行前期准备工作。现报道如下。

1材料与方法

11药物及配制丙氧鸟苷(ganciclovir,gcv)为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品,注射用粉针剂(批号：080801 082),015 g/支,临用前采用注射用生理盐水15 ml溶解,浓度为10g/l。

12实验仪器与试剂细胞培养用rpmi1640粉和胰蛋白酶为gibco公司产品,青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品,新生牛血清为奥地利paa公司产品,四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)均为美国sigama公司产品,ix71f22fl/ph型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本olympus),biorad680型全自动酶标仪(日本biorad)等。

13细胞株小鼠黑色素瘤细胞株b16购自中山大学动物中心细胞库。病毒包装细胞pt67购自美国clontech公司,本课题组已构建重组pt67/tk,并将其产生的重组plxsn/tk的逆转录病毒转染到b16细胞内并筛选到稳定整合株,记为b16/tk [7]。

14细胞培养用完全培养基(含rpmi1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100 u/ml青霉素、01 mg/ml链霉素)接种在培养瓶中,置体积分数5%co2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验,接种细胞浓度为1×105/ml。

15动物c57bl/6j小鼠,l8～22 g,雄性,健康,spf级,购自中山大学实验动物中心，合格证号：sqak(粤)2004-0011。

16tk/gcv对小鼠黑色素瘤细胞株b16的体外杀伤效应b16和b16/tk(tk+)按tk+细胞占总细胞数的0、10%、20%、40%、80%、100%混合,以2×104个/ml的密度将细胞接种于96孔板,体积为每孔100 μl,培养24 h后每孔加入终浓度为157 μmol/l的丙氧鸟苷(gcv),加入rpmi1640培养基至每孔总体积为200 μl。每组设6个复孔,培养箱中培养72 h,mtt法检测：加药培养后,吸弃每孔上清,每孔加入无血清rpmi1640细胞培养液90μl和mtt10 μl(500mg/l),置于培养箱内培养4 h后,吸弃全部上清培养液,加入dmso 150μl,震荡10 min,然后用酶标仪在490 nm波长下测定每孔吸光值(d)。

17小鼠移植性黑色素瘤的造模及治疗c57bl/6j雄性小鼠54只,随机分为正常对照组、模型组、0%tk/gcv组、20%tk/gcv组、40%tk/gcv组、80%tk/gcv组6组,每组9只。将b16/tk和野生型b16按tk+细胞占总细胞数的0、20%、40%、80%比例混合,接种前镜下观察黑色素瘤细胞形态。将混合后的小鼠黑色素瘤细胞制备成2×109个/l的细胞悬液,台盼蓝活细胞计数>90%。常规酒精消毒c57bl/6j小鼠右腋下皮肤,按01 ml/只悬液(含2×105 个肿瘤细胞)分别接种小鼠右前肢腋下组织内造模,记为模型组、0%tk/gcv组、20%tk/gcv组、40%tk/gcv组、80%tk/gcv组。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水01 ml/只。正常对照组和模型组第8～15天以蒸馏水腹腔注射02 ml·d-1·只-1，其他各组第8～15天腹腔注射gcv,给药剂量为100 mg·kg-1·d-1。

18观察项目

181一般状况观察小鼠活动情况、毛发、营养、肿瘤生长及死亡等情况。

182肿瘤体积在肿瘤出现后每天用游标卡尺测定肿块的长径a(cm)及与之垂直的短径b(cm),计算肿瘤体积[8]v(cm3)=05×a×b2,根据测量的肿瘤体积绘制肿瘤生长体积曲线图。

183肿瘤质量实验结束后处死动物,仰面固定,用眼科剪分离剥取肿瘤,万分之一电子天平称质量(湿重),记录结果。计算抑瘤率[9] ：p抑瘤(%)=(m模型组-m治疗组)/ m模型组×100%

19统计学方法采用spss 100统计软件包,组间比较用lsd法。肿瘤质量数据的处理是先进行数据对数转换,随后进行方差分析。

2结果

21gcv体外杀伤效应铺板后倒置显微镜下观察细胞,可见细胞均匀透亮,胞膜完整,胞体呈圆形,悬浮于培养液中;24 h后,细胞呈现贴壁状态,细胞形态为扁平的多角形,胞质均匀,胞膜完整,各组间无明显差异;48 h和72 h后,bl6/tk的给药孔中均见细胞死亡,表现为细胞变圆,大片漂浮,胞膜不完整,并且碎裂成小粒状,tk+细胞比例越高,死亡细胞数越多。野生型b16细胞对照组及给药孔均呈现明显的细胞增殖,gcv对其无明显作用(图1)。mtt检测显示,b16对照组和0%tk/gcv组抑制率差异无显著性意义(p>005)。而b16tk/gcv各组随着tk比例的增加细胞密度逐渐降低、抑制率明显增加,但旁杀伤效应不明显(表 1)。表 1不同tk+细胞比例对tk/gcv系统杀伤b16细胞的影响

22各组小鼠一般状况、成瘤时间及成瘤率正常对照组小鼠体形正常,运动快速有力,反应灵敏,被毛浓密有光泽,黑色,紧贴身体而不粗乱蓬松。其他组小鼠随着肿瘤的增大,逐渐表现为活动迟缓,被毛无光泽,肿瘤越大表现越突出。模型组、0%tk/gcv组、20%tk/gcv组、40%tk/gcv组接种第11天后陆续可触及皮下肿瘤,成瘤率100% ,80%tk/gcv组接种第12天后陆续可触及皮下肿瘤,成瘤率111%。(注：计算成瘤率时在模型组出现首例肿瘤前死亡动物不作为总数计算)

23各组接种后不同时间肿瘤体积及肿瘤生长体积曲线随着治疗的进行,20%以上tk/gcv治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(p <005),以80%tk/gcv组最显著(p<001)(图 2)。

统计方法：t检验;①p<005,②p<001，与模型组比较

图2肿瘤生长体积曲线

figure 2tumor growth curre of different groups

24各组肿瘤质量(湿重)实验结束后处死动物,剥离肿瘤,称质量。表2结果表明药物治疗的各组肿瘤质量均较模型组轻，但只有80%tk/gcv组有明显抑瘤作用(p<001)。　表2各组小鼠肿瘤质量比较

25肿瘤的肉眼观察模型组和b16/gcv组肿瘤大小不一,体积较大,形状不规则,呈黑褐色,多数肿瘤切开时见肿瘤组织坏死;其他各不同比例b16tk组体积较小,形状较规则,肿瘤外周有假包膜形成,以80%tk/gcv组最明显(图 3)。

3讨论

基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中,利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法,是分子生物学技术在医学中的一项重要应用。目前较成熟的肿瘤基因治疗方案有：免疫基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因治疗、肿瘤多药耐药基因治疗、抑制血管生成的基因治疗等[10],其中自杀基因疗法较受关注。hsvtk/gcv治疗系统为其中最常用、最重要的自杀基因系统之一。该系统的作用机制是：将hsvtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因转入肿瘤细胞后让其表达tk(胸苷激酶),然后加入低毒的核苷类似物gcv,gcv被tk催化生成为丙氧鸟苷一磷酸(gcvmp),随后在细胞里原有的鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶作用下生成丙氧鸟苷三磷酸(gcvtp)。gcvtp可竞争性地参与细胞dna的生物合成,导致dna损伤,抑制细胞分裂,引起细胞死亡。tk/gcv自杀基因系统已经被美国fda批准进入ⅲ期临床试验研究,被应用于脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的临床试验阶段。拥有我国自主知识产权的基于tk/gcv系统方案的基因治疗制剂也于2004年7月经国家食品药品监督管理局批准进行了ⅰ期临床试验,并即将开展ⅱ期临床试验[11-12]。

黑色素瘤是起源于神经外胚叶的恶性肿瘤。大多发生在皮肤,如躯干、头颈、手背、下肢等部位,也可发生于皮肤以外的黏膜、脑膜、虹膜、脉络膜、腮腺、呼吸道、胃肠道、阴道、心脏等。黑色素瘤常规治疗方法有：手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗等。由于黑色素瘤的早期转移和对放疗、化疗不敏感,以及免疫治疗的毒副作用等因素,传统治疗方法未能获得满意的疗效[13]。因而,黑色素瘤成为基因治疗研究的主要对象之一[14-16]。

本研究体外实验结果显示,已构建的tk/gcv系统能有效杀伤小鼠黑色素瘤细胞,20% tk+细胞比例可使抑制率达到 211%,但旁杀伤效应不明显。体内抑瘤实验显示,随着tk+细胞比例的增加,抑瘤率也随之升高,80% tk+/gcv组和其他各组比较差异均有显著性意义(p<001)。说明体内需要较高转染率才有明显抑瘤效应,但临床的转染率不可能达到这么高,这也可能是临床上单独应用自杀基因疗法效果不理想的原因。本实验在筛选时由于条件限制没有进行严格的单克隆分选b16/tk,b16/tk细胞群中可能混有少量的野生型细胞,实际tk细胞比例可能会相应低些。进一步的研究将选择20%～40%tk细胞比例,既可观察中医药的增效作用,又模拟了目前临床上较低的体内转染率。本实验为自杀基因与中医药联合疗法的研究提供较为适当的动物实验模型,为今后的研究工作打下基础。

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第5篇

关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；更昔洛韦；旁观者效应

中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2006)02-0052-04

Mechanism research of HSV-TK/GCV system on tumor gene therapy

LI Hui1,2＊, WU Xin-rong2

(1. School of Light Industry and Food Sciences ,South China University of Technology, Guangdonga Guangzhou 510641China; 2. Department of Pharmacy , General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangdong Guangzhou 510010 China)

Abstract: Herpes simplex virus-thymidine kinase gene/ganciclovir system was noticeable in tumor gene therapy. Its bystander effect produces a marked effect in suicide gene therapy on tumor because it can make up the low transfection efficacy of gene carrier. This article reviews the therapy mechanisms and the application tendency of HSV-TK/GCV.

Key words: herpes simplex virus-thymidine kinase gene; ganciclovir; bystander effect

胸苷激酶（TK）基因存在于疱疹病毒、细菌和哺乳动物细胞中，但不同来源的TK基因，其结构及蛋白质产物的相对分子质量、理化性质、生化功能等差异很大。哺乳动物细胞TK底物范围较窄，只有疱疹类病毒的TK可以催化一些核苷类似物磷酸化，发挥对哺乳动物的细胞毒作用。自1986年首次报道单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）可提高抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对肿瘤细胞的杀伤敏感性后，药物敏感基因疗法就成为众多研究者争先探索的焦点。在近10年，学者们将HSV-TK基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞并给予更昔洛韦，体内外试验结果表明，更昔洛韦对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显，此外HSV-TK/GCV系统独特的“旁观者效应”还可以放大治疗效果，吸引了众多肿瘤患者自愿接受试验，大量临床试验资料显示，HSV-TK/GCV将是重要的抗肿瘤治疗方法之一。

1HSV-TK/GCV系统的直接杀伤作用

细胞转染HSV-TK基因后可将无毒性前体药物GCV单磷酸化，继而在细胞的一磷酸鸟苷激酶或细胞内其他激酶的作用下进一步磷酸化为二磷酸化和三磷酸化产物，以此作为dGTP的竞争性抑制物，掺入到合成的DNA中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳等，或通过抑制细胞DNA聚合酶的活性，进一步阻止DNA的合成，导致细胞分裂阻抑或死亡。由于GCV不是哺乳动物细胞胸苷激酶的良好底物，因此对人体是低毒或无毒的。

2旁观者效应及其可能的发生机制

1986年Moolten等[1]首次用HSV-TK基因转导联合GCV治疗肿瘤时就已发现，将HSV-TK+小鼠肉瘤细胞株与HSV-TK－同种细胞以9:1的比例接种培养，给予GCV后，不仅阳性细胞被杀死，而且阴性细胞也极少存活。随后，Culver等[2]将携带HSV-TK基因的逆转录病毒注射入大鼠颅内胶质细胞瘤并接受GCV治疗时也发现了类似现象，且首次提出了“旁观者效应”（bystander effect，BE）这一机制。关于HSV-TK/GCV发生旁观者效应的机制，目前较为认同的主要有缝隙连接、细胞凋亡、机体免疫、肿瘤坏死和介质扩散等学说。

2.1缝隙连接学说

缝隙连接理论由Bi等[3]首先提出并为大多数研究者认同。该理论认为，由于GCV的毒性代谢产物不能通过细胞膜，但可以通过直径约2.0 nm的缝隙连接，因此HSV-TK/GCV系统显然是通过“缝隙连接介导的细胞间通讯”（gap junction mediated intercellular communication，GJIC）功能来实现旁观者效应的。曹剑峰等[4]用特制的滤网将转染和未转染TK基因的细胞隔开共培养，马文斌等[5]将C6/TK+ 细胞在GCV的条件下培养基滤过细胞成分后加入到野生C6细胞中，都未检测到旁观者效应，这充分验证了旁观者效应依赖于细胞间的直接接触而非可溶性因子介导。值得关注的是，Wygoda等[6]发现有GJIC能力的细胞中，不仅能出现旁观者效应，而且旁观细胞对转染有TK基因的细胞也有保护作用，称之为施善效应（good samaritan effect），Wygoda推测通过GJIC排除毒性代谢产物是此现象发生的重要原因。旁观者细胞对转染HSV-TK基因细胞保护作用的发现是GJIC介导毒性代谢产物传递理论的有力支持。

2.2细胞凋亡学说

细胞凋亡学说认为，旁观者效应是由一种“凋谢小体”转移引起的，凋谢小体由TK+细胞传递到TK－细胞，导致后者死亡。这种观点由Freeman等[7]首先提出，他们经流式细胞仪及电镜分析发现HSV-TK+死亡细胞中表现出细胞皱缩，染色质浓聚和凋亡小体形成等程序性死亡特征，且标记的小体出现于旁观细胞，由此推测毒性代谢产物或TK基因表达的产物可通过凋亡小体被旁观细胞吞噬，从而引起肿瘤细胞的继发凋亡。杨学军等[8]经电镜发现许多直径为0.30μm电子密度的囊泡包绕在细胞周围，细胞由于吞噬了毒性囊泡具有了凋亡的特点。何祥梁等 [9]应用电镜、流式细胞仪、细胞凋亡原位检测法发现转染HSV-TK基因A549细胞经GCV作用后出现了明显的凋亡变化，进一步支持了凋亡相关过程的启动势引起了邻近未转染细胞相应的变化，从而可能成为其强大的旁观者效应的一种内在机制这一观点。

2.3机体免疫学说

Ramesh等 [10]用HSV-TK/GCV基因治疗免疫缺陷性荷瘤Balb/c小鼠，发现即使转染率近100%，仍不能有效地抑制肿瘤生长；而对照的免疫正常鼠转染率在50%时，肿瘤抑制率达到100%。因而认为，宿主免疫系统的完整性是自杀基因疗法所必须的。Kianmanesh等 [11]给动物的两个不同部位分别移植HSV-TK+肿瘤细胞和野生型肿瘤细胞，再给予GCV，发现野生型肿瘤也缩退，他们把这种现象称为“距离性旁观者效应”，并认为与体内出现抗肿瘤性免疫反应有关。大量且迅速的坏死细胞刺激免疫细胞（如巨噬细胞，NK细胞，CD4+、CD8 +淋巴细胞）汇集到临死肿瘤部位，并诱导炎性细胞因子释放，炎性反应提供一个危险信号给免疫系统来提高免疫反应和克服免疫耐受状态。此外，大量的细胞坏死提供足够的抗原来激活抗肿瘤免疫反应，因此人为地增强免疫对促进肿瘤彻底清除，延长动物生存期有重要意义。

2.4肿瘤缺血坏死假说

Ram等[12]在9 L胶质瘤基因治疗中发现，由于体外旁观效应没有血管存在，而体内肿瘤分泌血管生长因子，导致肿瘤内血管的内皮细胞有丝分裂活跃，易被携带HSV-TK基因的逆转录病毒载体所转染，经GCV治疗后，肿瘤血管内皮细胞被有效地杀伤，从而抑制了肿瘤血管生长，减少肿瘤的血供，使肿瘤缺血、坏死。

2.5介质扩散假说

在有些双自杀基因情况下，互相不接触的肿瘤细胞也能发生旁观者效应。郭语彬等[13]在研究融合自杀基因（CD-TK）的旁观者效应时将转染肺癌细胞（SPC-A-1/CD-TK）和未转染的肺癌细胞（SPC-A-1）按不同密度培养后，加入前药GCV和5-氟胞嘧啶（5-FC），观察到当细胞密度稀疏时旁观者效应较为明显，原因可能是胞嘧啶脱氨酶（CD）能够催化对细胞无毒的5-FC转化为细胞毒性的5-氟尿嘧啶（5-FU），与GCV的磷酸化产物相比，5-FU的旁观者效应更为明显，且5-FU可以自由穿过细胞膜，通过细胞间介质扩散，造成细胞接种密度较低者的CD-TK和前体药物体系的旁观者效应高于接种细胞密度较高者。

3TK基因应用趋势

TK基因治疗肿瘤的研究领域相当活跃，从细胞水平到动物体内，再到临床试验，且有部分肿瘤，如脑胶质瘤、黑色素瘤等已获准可用该基因进行临床治疗。临床实验的疗效与动物实验的结果差距较大。为了取得理想的治疗效果，不断提出许多改进策略，主要包括：（1）提高缝隙连接的通透性。缝隙连接通道的主要成分是连接蛋白，它的异常与肿瘤发生、发展密切相关。除转导编码缝隙连接蛋白的Cx26、Cx37、Cx43基因外，尚有化学物质可以上调肿瘤细胞GJIC功能，如3',5'-环磷酸腺嘌呤核苷（cAMP）[14]、姜黄水解物[15]、维甲酸[16]等可协同肿瘤化疗的杀伤作用；（2）提高机体的免疫功能。TK基因与肿瘤抗原或免疫基因如IL-2[17]、G-CSF[18]等共同转染，可以产生协同效应，TK基因可以大量杀伤肿瘤细胞减少负荷；此时免疫基因引起的局部微环境免疫增强，而残存瘤组织则由细胞毒性淋巴细胞浸润来杀灭。许多中药亦能有效地改善荷瘤机体的免疫状态，可建立自杀基因疗法联合中药肿瘤基因治疗方案[19]；（3）采用双自杀基因疗法。双自杀基因转染如TK两基因和CD两基因均为自杀基因，两者联合应用可以产生协同作用已有报道[20]，再利用低剂量放疗将有更强的杀伤作用；（4）联合p53基因治疗。许多p53基因突变的肿瘤细胞可以对抗自杀基因转换前药物对癌细胞的杀伤作用，为克服此影响，将HSV-TK自杀基因与野生型p53基因共转染，对肿瘤细胞有更强的杀伤作用[21]；（5）联合抑制凋亡的基因。有学者将抑制凋亡的Bcl-2基因导入TK+细胞，延缓它们由GCV介导的死亡时间，使它通过缝隙连接转运毒性代谢产物的时间延长，增加了旁观者效应的作用时间和能力[22]；（6）改变载体特性。利用有复制能力的病毒作载体，可以使感染细胞内外源基因复制数增加，从而更好地表达外源基因[23]；（7）病毒载体导入方法的改进。利用携带肿瘤特异性调控元件的病毒作为自杀基因的载体，使自杀基因的表达只局限于肿瘤细胞，减少正常细胞的损伤，从而达到靶向基因治疗的目的。Suzuki等[24]将前列腺特异性抗原（PSA）启动子、增强子先用ARF（Partial androgen receptor）处理激活（目的提高PSA的活性），然后构建ARF-PP-HSV-TK/GCV系统，发现它能有效地抑制前列腺癌细胞的生长；（8）应用HSV-TK突变体。Black等[25]用随机序列诱发HSV-TK产生突变，目的是分离出对GCV敏感性增强的HSV-TK突变体。Chu等[26]利用真核起始因子4E（eIF4E）在癌细胞中过度表达的现象，在腺病毒携带的HSV-TK基因的上游接合上5'非翻译区（5'UTR），形成特异性针对eIF4E 的Ad-HSV-UTK，显著提高了乳腺癌小鼠的无病生存时间和总存活数。其它增强旁观者效应的方法还有联合放疗、化疗等。

4结语

近年来，肿瘤基因治疗得到了长足的发展，其中自杀基因/前体药物体系中HSV-TK/GCV系统应用最广泛，研究也较深入，尤其是它所具有的旁观者效应更是多种机制造成的综合效应。在转染自杀基因细胞周围发生的旁观者效应可能是通过缝隙连接和细胞凋亡引起，而远距离旁观者效应则很可能依赖于宿主体内出现的抗肿瘤性免疫反应和肿瘤缺血管的坏死，而利用TK和其他自杀基因的联合疗法中，旁观者效应则更可能依赖于另一基因的介质扩散作用。因此，旁观者效应抑制肿瘤是多种因素共同参与的，在提高转染率有限的情况下，阐明其机理，增强其作用，甚至制备个体化基因修饰的肿瘤细胞，将抗癌局部的“旁观者效应”转化为全身性或区域性治疗，这无疑对加速癌症治疗的发展具有重要意义。

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第6篇

【摘要】 目的 研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中hTERT基因表达的抑制作用，以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用，为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。 方法 体外培养人脑胶质瘤U251细胞株，建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的36只裸鼠随机分为3组（每组12只）。hTERT shRNA组肿瘤体内原位注射hTERT 质粒shRNA（pshRNA）20 μg+脂质体60 μl+PBS；PBS组肿瘤体内原位注射PBS 150 μl；空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒20 μg+脂质体60 μl+PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变，Western blot检测hTERT蛋白的表达，钙依赖性磷脂结合蛋白V+碘化丙啶双染流式细胞仪测凋亡率。结果 成功建立稳定的裸鼠U251细胞皮下移植瘤模型。治疗5周后hTERT shRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显缩小，抑瘤率为58.2%；病理学检查hTERT shRNA组肿瘤生长受到抑制，肿瘤细胞散在稀疏，可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡；Western blot示hTERT shRNA组hTERT蛋白表达受抑制；流式细胞仪检测hTERT shRNA组肿瘤细胞凋亡率明显高于PBS组和空质粒组（P

【关键词】 徐州医学院附属医院神经外科，江苏 徐州 221002

Abstract： Objective To explore the inhibitory effect of silencing human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene′s short hairpin RNAs (shRNAs) on the growth of human glioma in nude mice by RNA interference technique to afford an experimental basis for concerned gene therapy of glioma. Methods Human glioma U251 cells， cultured in vitro， were used to establish models of human glioma by subcutaneous injection into nude mice. The 36 mouse models formed were pided into 3 groups for varied purposes (n=12 each): the hTERT shRNA therapy group was given in situ injection of hTERT shRNAD plamid (pshRNA) 20 μg + lipid 60 μl + PBS; the PBS group， given that of PBS 150 μl; the blank plasmid group， given that of blank plasmid 20 μg + lipid 60 μl + PBS. H-E stained specimens of the xenograft tumor were prepared for pathohistological study after the plasmid therapy， Western blot method was used to determoine the protein level of hTERT， flow cytometry was for assessing the apoptosis of tumor cells. Results Satisfactory subcutaneous xenograft glioma model of nude mice could be constructed within 15 days， with an average size of 132 mm3. Compared with that in the blank plasmid and PBS groups， the tumor growth in the therapy group was evidently depressed down to 58.2%. Through light microscopy， it was found in the hTERT shRNA group that the tumor growth was inhibited obviously， there were relatively few tumor cells， but there were numbers of necrotic and apoptotic tumor cells everywhere. Western blot showed the expression of hTERT protein was restrained. Flow cytometry showed the apoptosis ratio of the tumor was higher in hTERT shRNA group than in the control groups. The differences in these indexes were very significant between the therapy group and the control groups（P

Key words： RNA interference (RNAi); human telomerase reverse transcriptase (hTERT); brain neoplasms; glioma; gene therapy

脑胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35.26%～60.96%，目前尚无根治方法。随着分子生物学的迅速发展，从基因水平揭示肿瘤发生、发展机制，寻找有效的基因治疗策略已成为脑胶质瘤研究的热点。目前，脑胶质瘤的基因治疗主要采用自杀基因、抑癌基因、细胞因子免疫基因、反义基因等方法。近年来RNA干扰（RNAi）现象的发现［1］及应用给脑胶质瘤的基因治疗策略带来强烈影响，选择合适的靶基因是RNAi治疗的关键。鉴于端粒酶在恶性脑胶质瘤中高表达，而端粒酶的激活有永生化细胞和维持端粒长度并阻止恶性细胞死亡的特性，人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达是端粒酶活性表达中的限速步骤［2］。本研究拟在建立裸鼠人脑胶质瘤皮下动物模型的基础上，以hTERT基因为靶基因，通过RNAi技术抑制其在人脑胶质瘤细胞系U251上的表达，从而抑制U251细胞的增殖，促进其凋亡，抑制肿瘤生长，为脑胶质瘤基因治疗的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂 根据hTERT的cDNA序列，构建表达hTERT mRNA特异的短发夹RNA（shRNA）真核表达质粒shRNA（pshRNA，本实验室已前期完成此工作，另文发表）。用QIAGEN Plasmid Maxi Kit 大提质粒（依其操作手册工作）。对获得的质粒hTERT pshRNA用DNA分析仪测光密度值（D值）并定量，再做酶切鉴定及测序。RPMI-1640培养基、SiPORT XP-1脂质体为Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，Annexin V-FITC试剂盒购自上海晶美公司，hTERT 抗体购自Santa Crus公司。

1.2 细胞培养 U251细胞根据Gibco BRL公司的细胞培养手册在无菌层流超净工作台上完成细胞培养和传代后，将U251细胞接种于细胞培养瓶中，培养基为RPMI-1640，加10%胎牛血清，并加入青霉素、链霉素各100 mg/L。培养条件：37℃、5%CO2培养箱，饱和湿度。倒置显微镜下观察，细胞处于80%～90%融合阶段时进行传代培养，一般2～3天传代1次。0.05%胰酶消化，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗除胰酶，取其中1 μl在光镜下用计数玻片计数，调整比率制成所需细胞悬液，以备种植。

1.3 实验动物分组及裸鼠人脑胶质瘤移植瘤模型的制备 4～6周龄雄性裸小鼠（BALB/c nude） 40只，体重18～22 g，购于复旦大学医学院实验动物中心，饲养于SPF级无菌饲养室。收集U251细胞，计数细胞数约5×106 /只（鼠），加入0.3 ml无血清无抗生素RPMI-1640培养液中制成细胞悬液，经微量注射器注入裸鼠左侧背部皮下，每2天观察肿瘤生成情况并用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法参照公式：体积(mm3)＝a×b2 /2，其中a代表肿瘤长径，而b则代表与a最大径垂直的宽度值（短径）。共成功建立皮下肿瘤模型36只，其余4只由于技术和细胞状态原因或其他原因导致肿瘤未生成而从实验中剔除。36只肿瘤模型随机分成3组，每组12只：PBS对照组（简称PBS组，下同），肿瘤体内原位注射PBS 150 μl；脂质体包载的空质粒组（简称空质粒组，下同），肿瘤体内原位注射空质粒20 μg+脂质体60 μl+PBS；hTERT shRNA组，肿瘤体内原位注射hTERT pshRNA 20 μg+脂质体60 μl+PBS。以上各组给药液体总量均为150 μl。

1.4 给药治疗方法 种植U251细胞后，待肿瘤增殖至100～150 mm3大小，采用肿瘤体内原位给药方法：将皮下肿瘤分为4个象限，药物分为4份注射，给药部位波及瘤体周边反应带处。每72 h给药1次，共5次。

1.5 动物移植肿瘤取材和肿瘤标本切片 裸鼠在治疗后第5周末断颈处死，取出肿瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/PBS对照组平均瘤体积）×100%。将新鲜肿瘤标本留作凋亡检测，余放至液氮保存。标本固定后，经石蜡包埋切片，采用常规苏木精-伊红染色，在光镜下观察肿瘤细胞形态、坏死、凋亡等改变。

1.6 hTERT蛋白的Western blot检测 从液氮取出肿瘤标本，切成小块后充分碾碎，均匀浸泡于适量的SDS-loading缓冲液中，置于4℃冷室，裂解30 min。超声仪破碎后，离心。取上清50 μl加上样缓冲液10 μl，95℃煮样8 min。等量蛋白上样于8%SDS-PAGE胶进行垂直电泳。以湿转法电转移至醋酸纤维素膜（NC膜）上，后NC膜经3%牛血清白蛋白室温封闭3 h，加入适当稀释的一抗，4℃过夜。用buffer洗膜3遍，加入相应二抗，37℃反应2 h，洗膜，以氮四唑蓝（NBT）/5-溴-4-氟-3-吲哚磷酸（BCIP）显色，水洗终止反应。结果以图像处理仪分析处理，计算D值。

1.7 细胞凋亡检测 取新鲜肿瘤组织，用剪刀将组织剪成3～4 mm大小的碎块。用Hank液洗涤，加0.25%胰酶孵育肿瘤组织。后加入全培养基于组织中，吹打，用不锈钢的筛网过滤细胞悬液。去离子水按1∶4稀释结合缓冲液，用250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×109个/L。取100 μl的细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 20 mg/L碘化丙啶溶液。混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加400 μl PBS，流式细胞仪分析正常细胞、凋亡细胞、机械损伤细胞和死亡细胞百分率。

1.8 统计学处理 实验数据采用Microsoft Excel及SPSS 11.0统计软件分析，计量数据以x±s表示，采用完全随机设计方差分析法进行统计学分析。检验水准：α=0.05。

2 结 果

2.1 hTERT shRNA对裸鼠U251移植瘤增殖的影响 裸鼠背部皮下注射U251细胞后第8～10天出现可触及且肉眼可见的肿瘤组织。种植U251细胞约15天后，裸鼠移植瘤增殖至（132.5±16.4）mm3。瘤体内原位给药后，hTERT shRNA组肿瘤增殖明显比同期PBS组或空质粒组肿瘤增殖幅度小，空质粒组与PBS组比较差异无显著性（P>0.05）。第5周末hTERT shRNA组肿瘤体积明显小于其他各组，抑瘤率达58.2%。到疗程结束时，荷瘤鼠无一死亡，肿瘤无其他部位转移。见表1。表1 治疗后第5周末不同因素处理后裸鼠肿瘤体积大小及抑瘤率比较

2.2 病理学检查结果 苏木精-伊红染色可见PBS组和空质粒组肿瘤细胞生长良好，肿瘤细胞形状不规则，分布密集，可见病理性核分裂，少见坏死灶，血供较丰富；hTERT shRNA组肿瘤内出现较多片状坏死区，肿瘤细胞稀疏散在（图1～4）。图1 PBS组移植瘤病理切片

2.3 HIF-1α和hTERT 蛋白检测结果 取药物治疗后肿瘤组织作hTERT Western blot检测， PBS组作为对照组，以β-actin作为内对照，与空质粒组和PBS组比较，hTERT shRNA组对移植瘤细胞hTERT蛋白抑制作用较强（P0.05）。见表2。表2 各组移植瘤细胞hTERT蛋白表达

2.4 移植瘤细胞凋亡检测结果 各组均可见Annexin V-FITC单染的凋亡细胞，与PBS组和空质粒组比较，hTERT shRNA组肿瘤细胞凋亡率均明显增高（P0.05）。表3 各组移植瘤细胞凋亡的检测结果

3 讨 论

脑胶质瘤是多基因、多因素参与的神经系统疾病， 其危害性高且不易早期发现，传统治疗方法效果均不理想，基因治疗提供了一条新的思路。寻找这些多因素在脑胶质瘤发生及发展过程中的“共同通道”，并以此为靶点进行有效治疗是当今基因治疗的发展方向。本实验利用RNAi的特性使用hTERT shRNA质粒来达到抑制脑胶质瘤生长的目的。RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护程序，是双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。该过程首先由Rnase Ⅲ样的Dicer酶将双链RNA（dsRNA）加工成小干扰RNA(siRNA)，接着siRNA识别RNA 诱导的沉默复合物并与之结合，降解底物mRNA。这些降解的产物又可以与siRNA的反义链结合，引起新一轮相对应的mRNA降解［3］。RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性和高穿透性等。此外，RNAi尚有激发包括干扰素在内的多种非特异性抗肿瘤反应以及可以传递给子一代等特点［4］。

但是，直接向细胞内导入siRNA存在基因沉默维持时间短、体内运载难和转染效果不稳定等问题，因此限制了该技术的应用。而利用载体介导的RNA技术将有望克服上述困难［5］。鉴于此，本研究通过先在体外构建能表达shRNA的载体，再将载体转移到肿瘤细胞内并在其内转录后生成siRNA。载体能够在肿瘤细胞中长期稳定表达，siRNA亦能够长时间发挥阻断基因的作用。

在前期体外实验中，我们证实RNA干扰能抑制体外培养的U251细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达，从而抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。本实验分别根据hTERT 的cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的shRNA真核表达质粒pshRNA，建立裸鼠皮下人U251脑胶质瘤模型，将pshRNA通过脂质体包裹的方法转染入荷瘤裸鼠瘤体内，观察RNA干扰hTERT基因抑制肿瘤生长的效果。结果证实：给予shRNA质粒后，肿瘤的生长受到明显抑制，治疗结束时hTERT shRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显减小，抑瘤率为58.2%，说明RNAi治疗脑胶质瘤能有效抑制肿瘤增殖。

通过肿瘤的病理学检查及凋亡检测，发现给予hTERT shRNA质粒的裸鼠肿瘤组织出现肿瘤细胞稀疏散在，出现多发大片坏死灶，而空质粒组和PBS组肿瘤细胞生长密集，细胞核分裂多见，坏死区少见。hTERT shRNA组凋亡率为（12.32±1.43）％，而空质粒组和PBS组凋亡率分别为（4.32±0.58）％、（2.28±0.26）％，差异显著。产生这种作用的机制可能是：pshRNA表达了特异性shRNA，从而选择性降解了hTERT mRNA，导致hTERT蛋白合成减少，引起端粒酶活性下降。端粒酶活性下降后，端粒较短的癌细胞因端粒未得到及时的补充，细胞增殖能力下降，从而发生凋亡及死亡。这与Western blot证实的shRNA质粒表达可下调hTERT蛋白水平的结果相一致。

总之，这次shRNA干扰治疗实验取得初步成效，为以后临床RNAi治疗脑胶质瘤提供一定实验依据。随着对RNAi作用机制以及脑胶质瘤分子遗传学研究的深入，针对脑胶质瘤中不同靶基因的RNAi治疗将会有更广阔的应用前景。

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第7篇

[关键词] 鼻咽癌；治疗；研究进展

[中图分类号] R739.6 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）06（b）-013-02

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方各省份地区常见的恶性肿瘤。在医学与科技齐进的现代社会，其发病率却一直居高不下。本文通过检索近几年关于鼻咽癌治疗的文献资料，旨在对对鼻咽癌的临床特点、治疗方法、预后等研究进展进行总结，并对鼻咽癌治疗的创新疗法加以分析。

1 放疗

放射治疗是无远处转移鼻咽癌首选和主要的治疗方法。目前鼻咽癌放疗5年生存率为50%～60%，治疗后局部复发率为30%[1]。周祖金等[2]用X刀放疗计划系统，治疗20例鼻咽癌患者，应用10 mV-X射线照射，总剂量DT25 Gy，1～2个中心，边缘参考剂量80%～90%，每次5 Gy，隔1次。肿瘤完全消退55%，部分消退25%，缩小15%，不能评价为5%。朱大高等[3]常规放射治疗（CRT）128例，调强适形放射治疗（IMRT）36例。CRT组和IMRT组5年生存率分别为70.5%和51.3%（χ2=1.46，P>0.05）。张瑜等[4]研究显示调强组与常规组照射野急性皮肤反应发生率、急性口干发生率的差异有统计学意义，而急性口腔黏膜反应发生率、骨髓抑制发生率的差异无统计学意义。刘源等[5]以IMRT治疗148例鼻咽癌患者，Ⅰ-Ⅱ级张口困难发生率4.73%，未观察到Ⅲ级和Ⅳ级颞颌关节损伤。黄晓东等[6]的试验中，137例鼻咽癌患者分为单纯放疗组和联合治疗组（增加尼妥珠单抗每周100 mg）。在放疗结束、放疗后5周和放疗后l7周，联合放疗组的完全缓解率分别为65.6%、87.5%和90.6%，而单纯放疗组分别为27.3%、42.4%和51.5%（P

2 化疗

化疗可抑制照射野以外的肿瘤病灶尤其是微小转移灶肿瘤细胞生长，与放疗还具有协同治疗作用。化疗的运用策略包括诱导化疗、同时期放化疗、辅助化疗及这几种方法的综合运用[9]。何振宇等[10]研究显示局部晚期鼻咽癌同期化疗时，顺铂加甘氨双唑钠的同期化疗更能提高肿瘤局部缓解率。樊锐太等[11]研究中晚期鼻咽癌放疗同期DF化疗方案同样表现出好的临床疗效。陈建祥等[12]研究表明同期放化疗联合新辅助化疗能抑制或延缓肿瘤复发和远处转移。胡巧英等[13]研究指出同期放化疗联合辅助化疗治Ⅲ期、Ⅳ期鼻咽癌能提高总生存率、无瘤生存率。周广信等[14]应用放疗联合化疗治疗鼻咽癌47例，结果鼻咽原发灶及颈部淋巴结转移灶完全消失率分别为93.6%、85.1%。

3 手术

鼻咽癌的临床手术治疗应用已有较长时期，疗效较为显著，鼻咽癌5年局部和区域控制率已经达到81.7%～85.0%，5年生存率为75%[15]。

鼻咽癌颈部残留或复发手术适应证为[16]：①原发病灶已控制；②根治性放疗后3个月颈部淋巴结残留者；③放疗后颈部淋巴结复发且有病理证实者；④颈总动脉未有侵犯；⑤无远处转移；⑥无手术禁忌证。郭筠芳等[17]研究指出原发于鼻咽顶前壁的巨大I期鼻咽癌首选手术治疗，近期疗效好，可以避免放疗副反应。武林旺等[18]应用超级伽玛刀治疗鼻咽癌患者57例，结果治疗有效率达94.73%。

4 中医药治疗

中医药治疗鼻咽癌的机制包括诱导癌细胞凋亡、抑制细胞增殖、诱导癌细胞分化和调节细胞内信号转导等，诱导细胞凋亡仍是大多数中药抗鼻咽癌的共同途径[19]。都基亮等[20]研究指出对鼻咽癌的治疗，在放射治疗的基础上加上中药治疗可以明显的提高临床疗效和患者的生存率。刘瑛等[21]研究指出何首乌提取物大黄素治疗鼻咽癌具有放射增敏作用。刘姬艳等[22]用放射自显影、液闪和蛋白质免疫印迹法检测发现土贝母苷甲能快速激活CNE-2Z细胞丝裂原活化蛋白激酶，认为这可能是其诱导鼻咽癌细胞凋亡的途径之一。

5 基因治疗

基因技术治疗鼻咽癌包括有自杀基因治疗、反义基因治疗、免疫基因治疗、基因置换治疗等几种方法。刘海等[23]在p53基因体外转染鼻咽癌细胞株的实验观察中发现，p53能明显抑制鼻咽癌细胞株的体外生长，抑制率为67.7%，且实验组的鼻咽癌细胞中凋亡细胞占47.8%。

6 小结

目前鼻咽癌治疗多以放疗和化疗为主，辅以手术和其他疗法。但缺乏统一的治疗方案。因此，探求规范统一的治疗方案是当前鼻咽癌临床的首要任务，以最佳的治疗手段应用于临床。

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第8篇

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由内源性或外源性双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）所诱发，高度特异性降解细胞内同源mRNA，使基因沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，故又称为转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）［1］。RNAi是生物体在进化过程中抵御病毒入侵，抑制由转座子移动或重复序列的积累引起的基因组不稳定的保护机制，另外还是基因表达调控的一条重要途径。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）是指干涉RNAi过程中在细胞内产生的长约21～23核苷酸（nt）的小双链RNA分子，是RNAi发挥功能的重要中间效能分子。RNAi自从1998年发现以来，就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地，迄今已成为基因研究中不可或缺的工具之一，并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟，已开始应用于疾病防治等多个方面。本文就其机制，主要特征，以及在消化系肿瘤中的研究作一简单综述。

1 作用机制及主要特征

1.1 作用机制

RNAi在哺乳动物细胞中有两种作用机制：一种是大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）产生的广泛的、非特异性效应。其机制可能是激活了细胞内的蛋白激酶R和RNA酶L，从而导致了非特异性的细胞凋亡。另一种是21～23 nt的短双链RNA（siRNA）产生的相对具体的、特异性效应。目前，RNAi在抗病毒及肿瘤中的研究主要集中在siRNA产生的特异性效应，故下面主要介绍siRNA的作用机制。

siRNA的作用机制目前尚未完全阐明，但已基本达成共识，即①dsRNA在细胞内与DICER酶（一种RNAaseIII家族异性识别dsRNA的酶）结合，随即被分割成21～23个核苷酸的短链dsRNA，在这个过程中需要ATP的参与。②分割下来的短链dsRNA即为siRNA，它是RNAi的起始诱导物，与DICER酶形成RNA引导的沉默复合体（RISC），此时RISC无活性，随后，siRNA经历一个依赖ATP的解双链过程激活RISC［2］。③siRNA特异性地识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，RISC中的DICER酶将mRNA切割成21～23个核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，导致不能进行翻译过程，从而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表达。④新产生的dsRNA（siRNA）可继续形成RISC复合物进入新一轮RNAi的循环，产生正反馈效应。这一过程需在RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的条件下进行。除上述机制外，转基因真核生物dsRNA 还可引起相应基因的甲基化，促使异常RNA产生，最终导致基因沉默［3，4］。

1.2 主要特征

1.2.1 高度特异性 RNAi严格遵循碱基配对原则，只降解与之同源的基因的RNA，达到阻止基因表达的目的。

1.2.2 高效性 相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，在哺乳动物中虽没发现扩增效应，但在细胞实验中只需摩尔级浓度的 siRNA 即可有效抑制目标基因的表达。

1.2.3 可传递性和可遗传性 RNAi抑制基因表达的效应可跨越细胞的界限，甚至可以传播至整个有机体及子代细胞。

1.2.4 浓度、时间双重依赖性 在一定时间内RNAi的效应强度随siRNA的浓度增高而增强，或浓度一定的情况下，随着时间延长，siRNA在细胞内发生正反馈效应，导致浓度增高，使RNAi效应增强。

1.2.5 ATP依赖性 目前研究发现RNAi中至少有2个步骤消耗ATP［5］：DICER酶切割dsRNA成为siRNA并使其5′端磷酸化或胞内磷酸化酶使导入的siRNA 5′端磷酸化而使其成为有活性的siRNA的过程；RISC活化即siRNA解双链的过程。

2 RNAi在消化系肿瘤治疗中的应用

肿瘤的发生、发展与原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的异常表达等均有密切的关系。因此我们可以针对这些因素，利用RNAi相关技术在不影响正常基因功能的条件下抑制突变基因表达或基因的表达过量，从而达到基因治疗的目的。另外，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，当单一癌基因的阻断不能完全抑制或逆转时，可以设计一种针对同一家族多个基因的保守序列的siRNA分子，便可以同时抑制这一家族的多个基因表达，且抑制效果互不干扰。

2.1 原癌基因

原癌基因是细胞基因组内正常的组成成分，自然状态下无致癌作用，其主要作用是通过编码生长因子等调节正常细胞的生长、分化。原癌基因激活是肿瘤发生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成为目前研究肿瘤治疗的热点之一。

2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人类肿瘤中呈活化状态最普遍的原癌基因，有数据显示此基因的突变现象存在于30%～50%的肿瘤组织中，在胰腺癌中可高达85%。Brummelkamp等［6］建立了突变体的表达系统即pSUPERKrasv12，转染人胰腺癌CAPAN1细胞系后，观察到pSUPERKrasv12能显著降低Krasv12的mRNA表达水平。构建突变体Krasv12的siRNA病毒载体转染CAPAN1细胞亦能抑制细胞克隆生长，并阻止裸鼠肿瘤的形成；而对照组细胞生长良好并产生克隆，体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤，因此证明了该siRNA具有明显的特异性和抑制肿瘤生长的作用。 同时，他们采用反转录病毒载体RNA系统在体外也成功地抑制了ras基因的表达。

2.1.2 Fos基因 Fos基因是一个重要的促进肿瘤细胞转移的基因，其产物Fos蛋白与肿瘤细胞的运动有关。Fra1蛋白是Fos蛋白家族的成员之一，主要在大肠癌Hct116细胞株和BE细胞株中表达。用siRNA 转染fosL基因，然后再转染到BE细胞中，发现Fra1蛋白对细胞的增殖没什么影响，却极大地降低了BE细胞的运动能力，大约降低为原来的1/10［7］。

2.2 抑癌基因

由于抑癌基因在细胞增殖调控中起重要作用，因此也成为基因治疗的重要目标之一。p53基因是最早利用RNAi技术研究的基因之一，人体内大约50%肿瘤的发生是p53基因突变的结果。p53基因能够抑制DNA合成及诱导DNA修复来抑制细胞生长，使细胞停滞在G1期。突变型p53失去对细胞增殖的负调控作用，导致细胞增殖失控发生癌变。Martinez等［8］的报道中，将H1299细胞转染野生型p53和突变型p53的RNA表达型质粒，结果，野生型siRNA明显抑制野生型p53蛋白的表达，对突变型几乎无效；而突变型siRNA显著抑制突变型p53蛋白表达，野生型基因则不受影响。由此证明，RNA序列能特异性地分别抑制这两个基因的表达，并且对突变型p53的抑制可在一定程度上恢复野生型基因的表达和功能。这就为选择性和个体化治疗肿瘤提供了可能。

2.3 细胞凋亡相关基因

细胞增殖和凋亡之间的动态平衡对于机体的生长发育有着举足轻重的影响。凋亡过程的失调可能导致肿瘤的发生。有研究表明［9］，将表达有绿色荧光蛋白(GFP)的BclXLsiRNA转染人胃癌细胞株MGC803，用RTPCR和免疫荧光法检测BclXL的表达，48 h后发现，与siRNA阴性组相比，实验组GFP明显减少，BclXL蛋白和BclXL mRNA表达减少到基准水平以下，并有自发的细胞凋亡现象，凋亡率达21.17%。这就说明BclXL特异性siRNA能够抑制凋亡抑制基因BclXL的表达，从而诱导胃癌细胞株MGC803凋亡。

2.4 其他相关基因

2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等肿瘤的发病中起到重要作用，尤其见于弥散型胃癌。有研究表明将核仁蛋白NoL8特异性siRNA转染3种弥漫型胃癌细胞ST4，MKN45，TMK1，可以有效地降低该基因的表达，并能诱导这些细胞发生凋亡。因此，可以考虑把Her2作为胃癌基因治疗的又一新的靶点［10］。

2.4.2 β连环蛋白和APC基因 β连环蛋白和APC基因是WNT信号传导途径的关键成分。这些基因的突变可引起β连环蛋白表达水平增加，导致细胞过度增生，促进结肠息肉和结肠癌的发生。Verma等［11］构建了β连环蛋白的多个靶区域，使得蛋白表达量降低90%。有学者进一步用转染β连环蛋白siRNA 的结肠癌HCT116细胞注射裸鼠，发现有50%的老鼠存活超过70 d，而对照组则全部死亡。

2.4.3 血管内皮细胞生长因子（VEGF） VEGF是体内一种重要的促血管生成因子，在恶性肿瘤的发生、发展及预后过程中均有着极其重要的作用。Zhang等［12］设计了针对鼠VEGF各亚型的siRNA，以DNA为模板在细胞内诱导小片段双链RNA的形成，干扰结果均特异性抑制相应VEGF的表达。同时，Takei等［13］设计了针对人VEGF的siRNA，采用体外合成法得到相应的siRNA，将其注入到荷瘤鼠模型的肿块中。结果肿瘤组织中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明显低于对照组，肿瘤体积亦明显小于对照组。徐文华等［14］设计两组针对VEGFmRNA 的siRNA，用脂质体转染人胃腺癌细胞系SGC7901，观察其细胞周期的变化。发现G0/G1期细胞增多， S期细胞减少，细胞周期阻滞于G0/G1期;并能诱导细胞凋亡产生凋亡小体。这些结果无疑将给肿瘤的基因治疗提供了新的思考方向。

2.4.4 TGFβ1 TGFβ1是一种多功能生长调节因子，与多种肿瘤的转移关系密切。它可使胃癌细胞表达的黏附分子如CD44表达增多；抑制腹腔内淋巴细胞活性使其无法有效杀伤腹腔内游离癌细胞以及血管生成，同时可使间皮细胞变形，腹膜纤维化等。吴涛等［15］利用载体介导的RNAi技术干扰TGFβ1，发现TGFβ1蛋白在人胃癌细胞株SGC7901中下降约65.8%，腹膜间皮细胞TGFβ1蛋白下降约61.8%。这一结果有力证明了siRNA能抑制TFBβ1在人胃癌细胞株SGC7901和腹膜间皮细胞中的表达，为今后胃癌腹膜转移靶向治疗奠定了坚实的基础。

2.4.5 埃兹蛋白(Ezrin) Ezrin作为ERM （ezrin radixin moesin)蛋白家族的成员，是一种细胞膜与细胞骨架的连接蛋白，其主要功能是参与细胞的生长和信号转导，接受胞外信号，使骨架蛋白重新排布，并增加细胞运动能力。近来发现， Ezrin的表达与大多数肿瘤转移相关，如Ezrin表达水平与黑素瘤的分级［16］和乳腺癌的发生转移［17］均呈正相关。颜歌等［18］采用小干扰RNA 方法抑制肠癌细胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表达，发现Ezrin mRNA和蛋白表达水平均显著下调，肿瘤细胞的运动侵袭能力下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少。这预示Ezrin蛋白有可能成为抑制肠癌发展、转移的新靶点。

2.4.6 多药耐药（multidrugresistance，MDR） MDR一直是肿瘤治疗的棘手问题之一。研究证实抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相关， Guo等［19］应用siRNA敲除Runx3基因后发现癌细胞对多种化疗药物耐药，将携带Runx3的真核生物表达载体转染人类胃癌耐药细胞系SGC7901，体外药敏性分析显示SGC7901 对各种化疗药物敏感。进一步分析显示Runx3可以抑制MDR1和MDR相关蛋白1 (MRP1)启动子的活性， Runx3的高表达可能通过下调MDR1，MRP1，Bcl2的表达，进而使胃癌细胞对化疗敏感。另外，其中的MDR1基因的过度表达及其基因产物P糖蛋白增加是导致MDR的重要原因之一，Nieth等［20］设计了特异的siRNA分别处理胰腺癌EPG85257RDB细胞和胃癌EPG85181RDB细胞来抑制MDR1的表达。结果发现这两种细胞的MDR1的mRNA和蛋白表达量可降低90%以上，癌细胞对柔红霉素的耐药作用分别降低了89%和58%。这也提示我们，siRNA介导RNAi技术为克服肿瘤耐药问题可能提供新的策略。

2.4.7 保罗样激酶1（Pololike kinase 1， Plk1） Plk1是丝氨酸-苏氨酸激酶之一，参与了有丝分裂的不同阶段。Jang等［21］检测发现280例胃癌患者中Plk1表达率高达95％（268/280），用RNAi的方法阻断Plk1表达后，癌细胞的生长明显受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，细胞周期调节蛋白B的表达增加，胃癌细胞堆积于G2/M期，有丝分裂纺锤体形态异常，染色体分离延迟，胞质分裂延迟或者停止，增殖减慢［22，23］。另外，Plk1基因的缺失亦伴随癌细胞凋亡的增加，提示Plk1可能成为胃癌基因治疗的理想靶点。

3 问题与展望

RNAi这一方兴未艾的新技术，为肿瘤及其他疾病的基因治疗提供了新的途径。但是仍有许多问题亟待解决：①如何在体内实现靶基因RNA转移到所有肿瘤细胞并稳定持久地抑制癌基因表达；②如何确定21～23 nt左右的核甘酸序列作为siRNA模板的选择原则；③如何提高载体系统的效率等等。总之，RNAi技术作为一种研究的新工具，治疗的新手段，随着对其机制的不断认识和技术的改进，必将在消化系肿瘤的研究及治疗中担任不可替代的角色，同时也预示着后基因组时代里一个崭新的RNA时代的到来。

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第9篇

关键词 受体介导；基因转移

受体介导的基因转移是将目的基因与配体连接，通过配体与细胞表面的特异性受体结合，以受体介导的内吞作用将目的基因转入细胞。配体与受体的特异性结合以及受体介导的内吞作用是一种生理过程，因此受体介导的基因转移有靶向、有效和安全、无毒的特点，这使它和其它基因转移技术相比具有独特的优势，尤其是用于体内基因转移。

1 方法和原理

配体与目的基因的连接，一般是通过多聚赖氨酸等多聚阳离子。配体与这些多聚阳离子的连接，是通过加入化学物质，形成共价的化学结合，然后与含目的基因的质粒以适当的比例在室温下混合。带负电荷的质粒DNA与多聚阳离子形成牢固、稳定的非共价电性结合。这种结合方式决定了DNA的表达不受影响。结合后的DNA缩合成致密的杆状或球状，外周覆盖着多聚阳离子和配体，此配体-多聚阳离子-DNA复合物呈可溶性，直径约100nm[1]，通过受体介导的内吞作用进入细胞后形成囊泡状的核内体。最终部分核内体与溶酶体融合，DNA被溶酶体酶降解，部分核内体膜破裂后DNA进入细胞质，再进入细胞核内进行基因表达。也有将配体嵌入包裹目的基因的磷脂双层中[2]，或将目的基因与含配体的融合蛋白连接[3]进行受体介导的靶向性基因转移。

2 受体介导的基因转移类型

2.1 脱唾液酸糖蛋白受体介导的基因转移

脱唾液酸糖蛋白受体是肝细胞表面独有的受体。Wu等以此受体介导，将HBV病毒的反义DNA转入体外培养已感染HBV病毒的人肝癌HepG2细胞，可使HBV病毒复制明显受到抑制，24h后HBV表面抗原及HBV的DNA均较无配体对照组下降约80%，而且6d内无明显上升[4]。用于体内，Wu等给小鼠静脉注射细菌的氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）与脱唾液酸糖蛋白复合物，10min后处死动物，发现32P标记的DNA85%分布在肝脏，5%在血中，并在肝组织检测到酶活性。而单独注射CAT的对照组仅17%在肝脏，46%停留在血中，肝组织未检互酶活性[5]。以此受体介导将低密度脂蛋白受体基因转入缺乏此基因的免疫体内，使高脂血症得到部分纠正[6]。说明脱唾液酸糖蛋白受体介导的体内基因转移具有很高的靶向性和有效性，提示多种与肝脏酶缺陷有关的遗传性疾病有望通过此受体介导达到基因治疗的目的。

2.2 甘露糖受体介导的基因转移

甘露糖受体存在于巨噬细胞表面，此受体介导，将肿瘤坏死因子（TNF-α）反义RNA转入体外与二氧化硅共孵育的巨噬细胞，可阻止巨噬细胞在二氧化硅诱导下分泌TNF多的作用，TNF分泌量仅为无配体对照组的1/5[7]。给小鼠静脉注射含荧光素酶基因的质粒与甘露糖化多聚赖氨酸复合物，在脾、肝、肺均检测到酶活性。其中以脾脏组织酶活性最高[8]，这和巨噬细胞最富集于脾脏相一致，说明甘露糖受体在体内基因转移中也具有器官靶向性。

2.3 胰岛素受体介导的基因转移

胰岛素受体存在于多种组织细胞表面，因此在体内基因转移中往往缺乏专一的器官靶向性。Sobolver等成功地进行了胰岛素受体介导的小鼠和羊乳腺上皮细胞体外基因转移后。采用局部途径给药的方法，经小鼠和羊乳腺导管注射荧光素酶基因与胰岛素复合物，在乳腺组织中检测到酶活性，将人β-乳清蛋白基因与荧光素酶基因连接后以同样方法体内应用，在乳液中也检测到酶活性[9]，说明受体介导的体内基因转移不但能够合成细胞内蛋白，而且还能合成分泌型蛋白。

其他学者还进行了转铁蛋白受体[10]、成纤维生长因子受体[11]、叶酸受体[2]、c-kit[12]受体以及单克隆抗体为配体[1]的受体介导的体外基因转移。

3 提高体外基因转染效率的策略

受体介导的基因转移中，不同细胞、不同受体转移率亦不同。与细胞表面 受体密度、配体与受体的亲和力等因素有关。由于在部分外源基因进入细胞后容易被溶酶体酶降解，因此一般来说受体介导的基因转移效率较低，但是通过采取措施可获得较理想的效果：加入双岐性分子氯奎，利用氯奎的弱碱性阻止核内体的酸化，进而阻止其与溶酶体融合。DNA被溶酶体酶降解几率减少，进入核内的量增加，使基因表达增强。在受体介导的体外基因转移中，加入100μmol/L氯奎，能使转染率由0.1%提高到1%[1]。

加入膜不稳定剂，促进核内体膜破裂使目的基因进入细胞质，进而进入核内进行基因表达：①加入复制缺陷腺病毒或将复制缺陷腺病毒与目的的基因配体复合物连接，利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用，可使基因转染率提高至近100%。所加病毒数量相同时，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因配体复合物效率更高[13]。用脂补骨素或紫外线照射灭活腺病毒核酸，但保留病毒衣壳蛋白功能，能提高基因转移率并可避免病毒核酸进入细胞的危险性[11]。②加入具有膜不稳定作用的肽类或蛋白，如流感病毒HA基因产物融基因肽[14]、短杆菌肽S[15]、白喉毒素及假单胞菌毒素A的跨膜区[3，16]，可使转染效率提高到10%以上，比加入复制缺陷腺病毒提高到100%低许多，但对细胞没有毒性。

4 提高体内基因转移效率的策略

外源基因在体内表达量有限和表达时间短暂是目前基因治疗中急待解决的问题之一，目前的研究包括：根据部分肝切除可刺激肝脏再生，促进肝细胞分裂和DNA合成，从而延长外源基因在体内表达时间的设想，Wu等给小鼠静脉注射外源基因与脱唾液酸糖蛋白复合物，20min后行2/3肝切除术，结果外源基因4h剩余为20%，24h为9%，7d为7%，而对照组4h为8%～12%，24 h为2%～4%，7d时已检测不到外源基因[17]；给小鼠静脉注射人血清白蛋白基因，20min后行2/3肝切除术，2周后小鼠血中人血清白蛋白达34 μg/ml，而且这一水平稳定表达4周[18]。研究发现，部分肝切除延长外源基因表达时间实际上主要是通过破坏细胞的微管系统，阻止核内体与溶酶体融合，使外源基因被溶酶体酶降解减少，从而在体内的表达时间延长。

Chowclhury等利用秋水仙碱破坏细胞微管系统的作用，给小鼠静脉注射秋水仙碱0.75mg/kg，30min后再注射外源基因与配体复合物，也同样达到了延长外源基因在体内表达时间的效果[19]。

也可利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用提高基因转染率，进而增加外源基因表达量，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因与配体复合物进行体内基因转移，检测到外源基因量比不加腺病毒组高10倍[10]。

5 独特优势与应用前景

目前的基因转移技术中，显微注射法需每个细胞操作，而磷酸钙共沉淀法、电穿孔法对细胞损害较大，这3种方法均不能在体内应用。病毒介导的基因转移效率较高，但存在病毒复制、癌基因激活风险以及携带外源基因片段长度受限的不足；脂质体介导的基因转移无明显的毒副作用，但静脉注射时易被肝、脾等网状内皮系统吞噬。这两种基因转移技术虽已用于临床，但因缺乏器官细胞靶向性，均需借助手术操作。而受体介导的基因转移安全、无毒，具有靶向性，操作简便，可类似药物体内注射，并且可以携带长达48kb的基因片段[11]，因此具有独特的优势。上述提高受体介导基因转移率和延长基因表达时间的改进措施并非都适用于体内或临床应用，但达到的效果使受体介导的基因转移呈现乐观的应用前景，如果能用一些对人体无害或有益的方法来替代上述措施，寻找到更多的象脱唾液酸糖蛋白受体具有专一性的细胞表面受体，相信受体介导的基因转移不久将能成为基因治疗中理想的基因转移技术。

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17 Chowclhury NR et al.J Biol Chem,1993;268(15):11265

第10篇

【摘要】恶性脑肿瘤 (主要为神经胶瘤) 占颅内肿瘤的40 %～50 %。手术,放疗和化疗是其传统的治疗手段，随着分子生物学和基因工程技术的发展，出现了一系列治疗恶性脑肿瘤的新方法。本文主要阐述基因治疗，诱导分化治疗，抗血管生成治疗，免疫治疗，肿瘤细胞靶向治疗等新方法。

【关键词】恶性脑肿瘤治疗方法

The treatment of m alignant brain tumors

Li Shan

【Abstract】M alignant brain tumors (mainly glioma) brain tumors account for 40% to 50%. Surgery, radiotherapy and chemotherapy is the conventional treatment, as molecular biology and genetic engineering technology, a series of new treatment method for m alignant brain tumors. This article focuses on gene therapy, differentiation therapy, anti-angiogenesis therapy, immunotherapy, targeted therapy of cancer cells and other new methods.

【Keyword】M alignant brain tumor；Treatment；measure

一 恶性脑肿瘤的流行病趋势

恶性脑肿瘤 (主要为神经胶瘤) 占颅内肿瘤的40 %～50 %，但恶性脑肿瘤的发病率国内尚没有准确的流行病学资料，全国第三次死因回顾抽样调查显示，抽样地区恶性脑肿瘤位居恶性肿瘤的第七位，占恶性肿瘤死亡率的2．3％。近20 年来 , 胶质瘤患者的中位生存期无明显改善, 以各种疗法均难以达到根治程度, 几乎毫无例外地迟早要复发。这已成为神经科学最富挑战性而又亟待解决的一个难题。

二 恶性脑肿瘤的治疗原则

手术应尽可能保全重要神经功能的前提下，最大限度地手术切除肿瘤，同时又最大限度的保全神经功能，解除颅内高压为随后的治疗创造时机，手术后应尽快在24小时一72小时之内复查头部MRI评价肿瘤切除程度，拟定下一步治疗；如肿瘤位于重要脑功能区，手术极度困难而风险又极大者，应尽可能进行立体定向活组织检查术。对每位患者依据肿瘤的病理分类和分级，以及肿瘤的分子生物学特征和患者的免疫状态，再辅以放疗+化疗。最近, 肿瘤生物学和分子医学的飞速发展不仅使我们对肿瘤发生机制有了更深入的了解, 而且也为我们提供了肿瘤治疗的新策略和有效手段。

三 恶性脑肿瘤治疗方法

(一) 传统治疗

1手术治疗：目的在于明确诊断，改善症状，减轻瘤负荷，为进一步治疗创造条件。目前多数学者认为，广泛切除肿瘤依然是最有效的治疗方法。随着显微手术的开展及激光、超声吸引、各种手术导向系统等设备的改进，以往认为不能手术的部位如第三脑室、松果体区和脑干肿瘤也可以手术切除。如肿瘤不能广泛切除可在残腔放置放射性物质（磷32）作内照射治疗，为以后局部化疗及生物治疗作准备。

2 放射治疗：是恶性脑瘤重要的辅助疗法之一，特别是下丘脑、脑干等重要功能区肿瘤放疗更具优越性。一般术后1～2周即可开始。近年来放疗的进展主要包括照射剂量、照射视野、时间间隔、放疗装置的改进及放射增敏剂的应用。恶性脑瘤内泛氧细胞可抗拒射线，多数胶质瘤对射线不敏感，治疗剂量往往接近正常脑组织的最大耐受量，故影响疗效。

3化学治疗：肿瘤细胞增殖时间及增殖各期所需时间均不相同，化疗药物作用方式各异。G0期细胞虽不参与增殖，但具有增殖力，需要时即可转化为增殖群。如手术切除肿瘤后虽可使症状缓解，但残存的瘤细胞从过密状态解脱，对G0期细胞起“募集”作用，促使其向增殖期转化。故化疗不仅要控制和杀灭增殖期细胞，更要控制和杀灭G0期细胞。化疗药物分细胞周期特异性（CCS）和非特异性（CCNS）二类。多数学者主张联合化疗。即先选择对增殖期细胞和G0期细胞均有杀伤作用的CCNS类（如烷化剂）以影响其DNA合成，然后改用CCS类抗代谢药物以影响其RNA合成；或先用某种药物使瘤细胞分裂终止于某期，再用对该期敏感的药物治疗。

(二) 脑肿瘤治疗新技术

1 基因治疗 ：应用自杀基因治疗恶性脑肿瘤已进入临床实验阶段，例如转导单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因, 它能使非细胞毒性核苷酸类似物磷酸化 , 抑制分裂细胞的DNA 合成。插入基因的重组逆转录病毒载体只整合至分裂相肿瘤细胞的染色体，而不感染正常静止细胞 , 这有助于从分子水平把增殖的肿瘤细胞与静止的正常细胞加以区分选择。但是I 期临床结果显示其抗肿瘤活性有限，这提示现有基因转染系统的转染效率还并不理想。基因治疗从理论和技术上都还有待于进一步改进和完善。

2 诱导分化治疗：近期研究表明,引起细胞分化阻抑的特异性基因改变在一定条件下是可逆的。作为肿瘤治疗的一个新策略,诱导分化治疗强调逆转肿瘤细胞恶性表型，使其趋于成熟分化，而一般不引起肿瘤细胞的杀伤, 从而克服了以往传统疗法在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织细胞的损伤。目前用于胶质瘤研究的分化诱导剂主要有: (1) 极性化合物 , 如六亚甲基双乙酰胺、二甲基甲酰胺; (2) 维A 类化合物 , 如全反式维A酸（ATRA)；(3) 芳香脂肪酸，如苯乙酸、苯丁酸等; (4) 环腺苷酸衍生物。其中维A 类化合物和芳香脂肪酸已进入临床实验 , I 期实验证实 ATRA 和苯乙酸能使部分高度恶性的胶质瘤患者得到改善，但Ⅱ期临床结果却不如预期的理想，力求寻找更为高效、低毒、使用方便的分化诱导剂是目前一个迫切需要解决的问题。诱导分化有可能成为补充和改进脑肿瘤常规治疗、提高脑肿瘤疗效的一个重要手段。

3 抗血管生成治疗

随着对肿瘤生长依赖于血管生成认识的深入，促成了指向肿瘤血管系统的新的肿瘤治疗方法――抗血管生成治疗。与传统肿瘤治疗相比,其靶向并不是直接指向肿瘤细胞，而是指向血管内皮细胞;通过对抗肿瘤血管生成，切断肿瘤的供养，从而遏制肿瘤的生长和转移。

Folkman等提出,血管生成是由血管生成因子和抑制因子间的动态平衡调控的。减少抑制因子和 (或) 生VEGF/ FGF 等生成因子使此平衡改变，并激活“血管性开关”导致血管生成，是肿瘤生长和转移的重要环节。抗血管生成治疗特别适合于依赖血管生成的多种脑肿瘤的治疗, 从理论上讲,如果能应用抗血管生成药物控制肿瘤发展、减少肿瘤血供 , 并将其缩小至数mm 大小, 就可能通过手术全切, 甚至可以用立体定向、内窥镜以及射频、刀等手段达到微侵袭切除病灶, 这也将为放化疗提供契机和时机。抗血管生成治疗脑肿瘤的尝试虽然刚刚开始, 但其前景给人以充分的想象空间。

4 免疫治疗

最新证据表明, 脑的免疫豁免是不完全的, 小胶质细胞能递诱呈抗原和诱发免疫反应脑肿瘤免疫治疗主要基于以下两个策略:(1) 诱导系统抗肿瘤反应, 携免疫效应至脑. (2) 诱导原发脑免疫反应。其方法包括:接种肿瘤抗原肽瘤苗; 接种带有肿瘤抗原肽的树突状细胞; 以及通过基因转染使肿瘤细胞丧失分泌免疫抑制分子的特性等。

5 肿瘤细胞靶向治疗

细胞的增殖分化有赖于细胞有序的周期活动, 以细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶及其抑制物为基础的细胞周期检测点对细胞周期事件有序进行起着关键作用检测点控制的异常, 导致基因组的变异和不正确复制, 与肿瘤的发生发展密切相关。

无限制分裂是肿瘤细胞的一个标志。端粒酶是一种延长端粒DNA 的核糖白酶复合物, 它的活化可能是导致永生化细胞和肿瘤无限制生长的关键因素。

另一个策略是靶向胶质瘤表面分子。不同于胶质瘤细胞表达高水平转铁蛋白受体, 此受体仅在正常脑组织的毛细血管管腔表面表达。

最近日本东京女子医科大学和东京大学的研究人员利用一种名为“5-氨基乙酰丙酸”的光敏剂，使癌变组织发光。这种新方法精准度很高，可以去除同正常组织交界的癌变部分，这是普通手术难以达到的。同时，激光照射不产生热量，对正常组织几乎没有影响。

恶性脑肿瘤的综合治疗将不再只是传统的手术、放疗和细胞毒化疗，正在飞速发展的分子生物学和基因工程技术给我们提供了解决这一难题的有力武器, 相信恶性脑肿瘤治疗的突破已为期不远, 我们正拭目以待。

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第11篇

[关键词]基因编辑技术； CRISPR/CAS9； ZFNs； TALENs

基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定DN段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了生物的基因组，使研究人员可以在极短时间内模拟自然界漫长时间的基因演变，甚至能够完成自然进化中无法完成的基因组改变。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，研制如改良水稻等粮食作物；在医疗领域，该技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机制和探究基因功能，以及改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。

锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因编辑技术。这3种技术皆是通过在特定的靶向序列处引入双链断裂缺口（doublestrand break，DSB），继而通过NHEJ途径（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途径这2种细胞内DNA修复机制完成修复。NHEJ途径（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途径在提供外源DNA模板的条件下使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加[1]。由此可见，这3种基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。

11ZFNs每个锌指核酸酶单体都是由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）与非特异核酸酶结合的人工合成酶。此酶的N端部分是能识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分则由非特异性切割结构域Fok I以及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段组成[23]。ZFN的特异性取决于ZFP，因此筛选高质量的ZFP是获得高效、特异性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6个锌指组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基。ZFP一旦与基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会形成二聚体发挥内切酶活性，产生DNA双链断裂的缺口，继而通过细胞内修复机制对断裂部位的基因进行修饰[811]（图1）。ZFN的基因打靶效率一般能够达到30%，可以做到针对特定序列设计ZFN来实现对靶基因的修饰。然而ZFN识别结构域存在的上下文依赖效应大大降低了ZFN设计和筛选效率。目前尚不能针对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也不能在每一个功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。在ZFN的筛选和设计方面存在较大的技术困难之外，其制备价格也比较昂贵。此外，ZFN的脱靶切割也往往会导致细胞毒性。综上这些因素使得ZFN在基因治疗领域的应用有一定的局限性。

12TALENsTALEN是植物病原菌黄单胞杆菌Xanthomonas sp.产生的TALE蛋白的中央区域结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的一类重组核酸酶。TALE蛋白的中央区域结构域是该蛋白识别特异DNA序列的结构域。它包含了155～195个蛋白单元模块，每个模块单元有34个氨基酸残基，其中除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是保守的。因此，这第12和13位氨基酸被称作重复可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues，RVDs） 位点[12]，是靶向识别的关键。由于TALE存在多种变体，所以可以构建出靶向基因组中预设DNA靶位点的多种TALEN。相比ZFN技术，TALEN使用了TALE蛋白的中央区域结构域代替ZFP作为人工核酸酶的识别结构域，更好地解决了DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白中央区域结构域对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定：组氨酸天冬氨酸特异识别碱基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺异亮氨酸识别碱基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸识别碱基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺识别碱基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺赖氨酸识别碱基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺丝氨酸可以识别A，T，G，C 中的任一种NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（图2）。这种与DNA碱基一一对应的方式在设计上相对于ZFN要简单得多。然而，在实际构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程也比较繁杂，通常需要大量的测序工作。这使得该技术的使用成本较高，对于普通实验室的可操作性较低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效导入细胞方面也限制了它的应用。

13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统[15]，由成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR与Cas蛋白组成，能特异性识别外源病毒或质粒的核酸物质，并对其进行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通过转录生成一段非码RNA，即CRISPR前体

的靶标可设计为针对一个基因，也为针对多个基因，都能达到有效的特异性位点编辑的效果。CRISPR/Cas9系统已被公认为是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第3代“基因组定点编辑技术”。ZNFs和TALENs作用时均是采用蛋白质对DNA序列的识别，而CRISPR/Cas9对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程。该识别方式使得CRISPR/Cas9与前二者相比更为精准，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通过导入质粒进行表达，因此也省去了耗时耗力的蛋白质工程过程。同时，研究人员可以通过生物信息学分析，设计出针对绝大多数基因的特异性靶标识别crRNA。因此，与前2代技术相比，CRISPR/Cas9成本低、制作简便、快捷高效、脱靶率低的优点使其迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，逐渐成为当今分子生物学领域最炙手可热的技术之一。然而CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不完美之处：Cas9 蛋白对于目标序列的识别除了依靠crRNA序列的匹配之外，目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序（PAM），因此Cas9 蛋白对于设定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能会随机产生细胞毒性的问题。

14 NgAgoCRISPR是以RNA为向导寻找靶向序列，而NgAgo则是以DNA来担任向导。韩春雨等的工作显示，NgAgo可结合24个碱基的gDNA，比CRISPR结合19个碱基的gRNA要长5个碱基，因此理论上精确性要高1 024倍，脱靶率也较低。然而，不同于CRISPR/Cas9技术大量运用已获得了实践验证，NgAgo的作用效果还有待于今后工作的检验。

2基因编码技术的应用

21在基因治疗中的应用随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因突变、缺失或表达异常有关，由此基因治疗技术顺势而生。基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因或有治疗作用的基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通过细胞内基因修饰来治疗疾病。近两三年来，基因编码技术作为该策略的新生力量开始活跃在基因治疗的舞台上，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩。

癌症治疗方面：2015年11月英国伦敦大奥蒙德街医院（Great Ormond Street Hospital）的医生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的疗法，成功地治愈了一名患有“无法治愈的”白血病的1岁女孩“莱拉”（Layla）。其治疗方案是利用TALEN蛋白对异体T细胞进行基因编辑，去除内源性TCR（提高肿瘤杀伤特异性）及CD52（避免药物alemtuzumab的干扰），并命名为antiCD19 CART细胞，再将这些经过设计的“人工培育的免疫细胞”输入患者体内去捕捉和杀伤肿瘤细胞。经过1个月的治疗，这名女孩目前摆脱了癌症，身体状况很不错，成为世界上首次用基因编辑治愈的白血病女孩[18]。此外，科学家们在过去的几十年中已经确定了许多肿瘤治疗中相关的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因组修饰类、基因抗药性基因。近2年，研究者们已经开始利用基因编码技术对上述基因开展了大规模的基因编辑修饰研究，预计今后几年内会出现多项癌症治疗方面的重大突破。

遗传性疾病治疗方面：2015年底《Nature》杂志发表的对2016年热点研究领域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美国加利福尼亚州里士满Sangamo生物科学公司将计划开展利用ZFN纠正导致血友病基因缺陷的人体试验，并对其研究成果表示非常期待。另外该公司还与马萨诸塞州剑桥市的Biogen公司合作开始了另一项试验，尝试通过该技术提高β地中海贫血患者体内一种血液球蛋白的功能[19]。已有研究证实人β珠蛋白（HBB）基因的突变可能导致地中海贫血症。我国中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，修改了人类胚胎HBB基因的DNA，为治疗地中海贫血症提供了可能。该研究中一共使用了86个胚胎，48 h后有71个胚胎存活，其中在54个接受了基因测试的胚胎中仅有28个胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遗传物质。该研究是史上第一例利用基因编辑技术改造人类胚胎细胞的案例。尽管该研究使用的胚胎均为无法发育成婴儿、不能正常出生的胚胎，该成果的伦理问题在西方仍引发巨大争议，由此《Nature》的记者和编辑们最终将黄军就选入了年度十大人物之列[20]。多种肌肉营养障碍症（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表达dystrophin蛋白的基因发生移码突变，导致不能形成有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin所引发的一种遗传性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技术成功修复了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南医学中心的Chengzu Long，杜克大学的Charles Gersbach，哈佛大学Amy Wagers 与MIT张锋合作研究组这3个独立的研究组又分别完成了小鼠成年体的基因修复。其中Chengzu Long研究组的研究方案为利用腺病毒将gRNA以及CRISPR/Cas9导入肌肉细胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能够产生较短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

逆转录病毒相关传染病的治疗方面：HIV病毒的基因会整合到病人的基因组上。利用抗逆转录病毒药物治疗仅能抑制HIV病毒的复制但对整合在细胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用药物这些病毒余孽就会起死回生，开始产生艾滋病原体。因此只有清除整合在宿主靶细胞上的HIV病毒基因才能实现根治艾滋病的梦想。2013 年，朱焕章等设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并证实该ZFN能特异性靶向HIV感染及潜伏细胞系上的HIV1前病毒LTR，且介导了HIV1整合基因的高效切除，亩获得了显著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技术使带有HIV病毒的T细胞失去活性，同时病毒复制在受感染细胞中降低了90%。这一治疗方案预计在两三年后开展临床试验。

22在新方法学及动物模型制备上的应用当前，各类基因敲除（knockout）和基因嵌入/置换（knockin）基因工程动物及细胞系已经成为现代医学认识疾病发生发展规律、研究疾病预防和治疗的重要实验工具和手段。传统的基因工程动物制备工艺――基因打靶技术是基于胚胎干细胞的一种同源重组技术。利用该技术制备基因修饰动物周期较长且存在生殖系统传递失败的风险。新型的基因编码技术系统可在小鼠受精卵中直接进行基因组编辑，因而快速、高效、低成本、无物种限制地一步生成基因工程动物。复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径[24]。Park 等[25]使用TALEN 技术将诱导的多能干细胞中含有F8 基因的140 kb染色体片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通过TALEN基因编辑工具将其之前倒置的染色体片段再重新恢复到正常。实验结果表明TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，又可以介导疾病的再次纠正。军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将有丝分裂降解结构域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到进基因组表达框上游，以期周期性持续降解细胞内CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，从而获得CTCF蛋白特异性降解细胞系，为后续研究CTCF功能奠定基础[26]。

此外，随着现代生物技术的不断发展和完善，基因编辑技术已经变为科研人员的新宠，越来越多的科学家运用其与其他技术相结合进行各种学术研究。第三军医大学西南医院和重庆大学的研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复方法，用GFP标记HCC细胞中的内源多功能性因子Nanog，证明雄激素/雄激素受体轴可以通过直接结合其启动子，增加Nanog的表达，并促进HCC细胞的干性和肿瘤发生[27]，从而初步阐明了肝癌发生的性别差异的机制。CRISPR/Cas9技术的成熟使得利用多重sgRNA载体高效、高通量编辑细胞内基因成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。IAA2（indole acetic acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员。由于没有该基因的失去功能型突变体，其功能和作用机制的研究受到了阻碍。研究人员在GoldenGate克隆技术的基础上，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变，所得到的突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

23其他应用前景目前，世界各地的实验室已将基因编辑技术应用于生物学研究的各个领域。

预防疟疾：利用CRISPR/Cas9对蚊子的基因进行改造，使其携带一种抗疟疾的基因，从而对疟原虫产生抑制，进而遏制疟疾的传播[29]。另一种改造为导入不孕基因，使疟蚊灭绝[30]。

器官移植：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这为糖尿病人提供更为理想的临床异种胰岛移植供体。另外，有研究改造了猪肺基因以利于用于人体肺移植，以及去除了猪器官上的内源性逆转录病毒（PERV）以防止移植器官带来的病毒感染[31]。

生物制药：北京蛋白质组研究中心张普民教授及其研究团队利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行了基因编辑，在猪白蛋白的基因区域插入了人白蛋白的编码DNA，使猪只产生人白蛋白而不产生猪白蛋白[32]。

农业育种改良：利用CRISPR/Cas9技术几年内可实现至少50～100年才能完成的育种改良工作。圣保罗Recombinetics公司利用该技术培育出不会长角的牛，从而使牛无须经历被切去牛角的痛苦过程。目前该公司正致力于培育永远不需要被的猪。

灭绝物种复活：加州大学圣克鲁斯分校Ben Novak将灭绝的候鸽的博物馆标本DNA与现存鸽子进行序列比对，并尝试对现存鸽子进行基因改造，使这些鸽子变得更接近灭绝的候鸽。

3基因编码技术的争议与思考

基因编辑技术可谓当今生命科学界炙手可热的前沿科技。顾名思义，该技术能够对最基本的遗传单位――基因直接进行设计和修改，其意义和价值可想而知。这使得各大公司迅速加入到基因编辑的产业之中。2015年8月，比尔及梅林达・盖茨基金会和谷歌风投基金投资Editas医药公司1.2亿美元；2015年10月杜邦与Caribou生物科学公司达成了合作协议，使用CrisprCas9技术来改进农作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中国基因编辑技术产业已走在世界的前列：在CRISPR技术数上中国仅次于美国，位居世界第2；目前50多家中国研究机构已提交了基因编辑专利；劲嘉股份与黄军就团队合作开展CRISPR技术治疗地中海贫血在临床应用方面的研究。中泰证券的分析师认为未来5年仅地中海贫血基因治疗的国内潜在市场空间超过500亿元。与此同时，随着基因编码技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统相对前两代技术效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，构建周期缩短至原来的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脱靶率依据最新技术已降低至目前检测技术检测不到的水平。脱靶率、效率、便携性及成本的极大改善，使得该技术更平民化，技术门槛越来越低。它已成为许多车库生物学家/草根生物学家以及生物黑客的新宠。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。

但任何事物都有其双面性，基因编辑技术产业虽然能够造福于人类，然而上面所述的巨大的经济利益驱动以及越来越低的技术门槛，再加上人类对自身健康改良的迫切心态极可能导致对该技术的滥用，进而对人类和地球环境形成威胁，甚至造成意想不到的生态灾难。在美国国家情报总监詹姆斯・克拉珀的威胁评估报告中，“基因编辑”已经被列入“大规模毁灭性武器和武器的扩散”威胁名单，与核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，关于该技术运用的争议从其诞生之日就已出现，并呈愈演愈烈之势。现有争议最集中之处为关于人类胚胎改造的伦理学争议。史上第一、二例基因编辑技术改造人类胚胎细胞的研究皆出现在中国。2015年4月，中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，为治疗地中海贫血症修改了人类胚胎基因组[33]。2016年4月29日广州医科大学范勇团队，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎[34]。尽管这2例基因编辑研究都使用的是人类三核受精卵（不能正常发育的受精卵），但在国际上仍引起了广泛的关注和全球科学家激烈的讨论。讨论的焦点不在于文章的学术价值，而在于改造人类胚胎细胞的伦理问题。由于基因编译技术引发的伦理问题迫在眉睫，2015年12月1日，由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科W院和英国皇家学会联合组织召集的人类基因组编辑国际峰会在华盛顿召开。会议重点了解各方对基因编辑技术的伦理问题的态度和想法。美国再生医学联盟主席兰菲尔（Edward Lanphier）等在《Nature》杂志上发表评论文章称，希望研究人员暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑，否则可能对后代产生无法预测的后果[35]。然而，人类胚胎改造的研究终究为大势所趋。2016年2月1日，英国政府批准了伦敦弗朗西斯・克里克研究所 Kathy Niakan研究员对人类胚胎进行编辑的请求。这项研究成为世界首例获国家监管机构批准的人类胚胎编辑研究。

综上所述，日渐成熟的基因编辑技术已经成为了强力的生物、医学工具，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面带了巨大的突破，可以快速构建实验新方法和动物模型，推动科研的发展，并在器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活和中药现代化等方面具有广阔的应用前景。其价值甚至引起了普通民众的广泛关注。人类畅想将来它不仅可去除遗传缺陷、治疗疾病，还可导入长寿、健康、强力的基因，甚至制造完美人类。当然，任何事物都是一把双刃剑，在乐观畅想基因编辑技术可使人类变得更加完美的同时，也不要忘记滥用技术可能带来的潜在风险和生态灾难。建立针对基因编辑技术安全有效的检测手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使这项技术更好地应用和造福人类。

4基因编辑在中药发展中的潜在前景

如何让传统中药跟上生命科学现代化的步伐，使传统中医药走出国门，让世界接受中草药，是当今中医药工作者面临的难题。长期以来，由于中医药与现代医学、生命科学之间缺乏有效沟通的桥梁，有逐渐被边缘化的趋势。中药基因组计划将现代生命科学的最新技术和研究成果应用于中药研究，有望彻底改变中药研究手段和方法的落后局面，架起传统中医药学与现代生命科学之间沟通的桥梁。中国中医科学院中药研究所陈士林团队在著名植物学杂志《Molecular Plant》发表丹参全基因组[36]，标志着作为常用中药丹参的遗传密码被破译，为揭示丹参主要药理活性成分丹参酮和丹参酚酸生物合成及其调控的分子机制，促进丹参优良品种选育提供了重要的遗传背景基础。该工作构建了世界上首个药用植物基因组框架图，标志着我国中药研究进入了基因组学时代。目前已有多个中草药如印度大麻、赤灵芝、牛耳草、铁皮石斛等完成了基因组测序。中草药基因组研究的飞速发展为基因编辑技术在中草药研究中的应用带来了极佳的时机和广阔的前景。今后研究者们可以以丹参研究为模板，借鉴国外的植物基因组研究计划的经验，对中草药在结构基因组学、功能基因组学和生物信息学等方向展开研究。在此基础上，利用基因编辑技术开展中药药效成分、药材的生长及抗性相关基因的研究和改造工作，结合先进的育种方法，筛选出既保持“道地血统”，又优质、高产、抗病的中药材优良品种。该工作既有利于实现中药标准化生产，使中药质量可控，又有利于解决当前中药材资源面临的“断粮”困境。

中药药材是现代药物研发最大的遗传信息资源之一。我国在该方面具有得天独厚的优势。《本草纲目》中记载了1 892种药用植物，1995年出版的《中华本草》收集了8 000多种药用植物，而且其中不乏很多名贵，稀缺的药材如人参，虫草等。另有统计表明，我国中草药已有12 000多种。基因编辑技术的成熟也为开发这个药物基因资源带来了良机。基因编辑技术在中药资源的引入和应用，将会为解决这一问题带来新的前景。通过基因编辑技术可以快速获得药材靶基因的突变或是导入异源基因，从而快速鉴定出该基因产物与药理活性成分的相关性和重要性，发掘出新的或更高效的药物相关基因，并可更清晰地阐明药理活性成分生物合成及其调控的分子机制。

尽管将基因编码技术引入中药研究能为传统中草药带来新发展和突破，但与当今各个领域广泛应用基因编码技术相比，其在中药研究中的应用还处于起步阶段，还有许多基础工作有待完善。比如这一技术的应用必须以完善的中药基因资源为基础，如果没有对中药特别是具有丰富药理药效学和临床应用价值的名贵中药的基因资源的研究与开发，基因技术体系的应用必然大打折扣。此外，也不能盲目的为了中药的基因而基因，浪费大量的人力物力资源，应有的放矢的将目标集中在既具有重要临床应用价值的名贵或濒临灭绝的中药基因资源的研究与应用上，为中药现代化搭建良好的基础技术平台，让现代基因技术更好的为传统中药的发展服务。

[致x]李连达院士对本文的选题、框架设计等给予了诸多宝贵意见。

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第12篇

Combination therapy of pancreatic cancer with tumor necrosis factor alpha gene and5-Fluorouracil

【Abstract】 Objective to investigate the synergistic antitumor effects of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) gene and 5-Fluorouracil (5-FU) therapy in pancreatic cancer.Methods retroviral vector MoMLV was used to introduce human TNF-a gene into human pancreatic carcinoma cell line PC-3. The G418-resistant colonies were isolated and cloned. Expression of TNF-a gene was evaluated by RT-PCR. The activity of tNFa expressed by transducted pancreatic cancer cell strain was measured by rat fibrosarcoma cell L929 which was processed by Actinomycin D. Finally the synergistic antitumor effects of TNF-a gene and 5-FU were observed.Results rT-PCR analysis indicated t hat the integration and expression of TNF-a gene was seen only in the transducted cells. Using a bioassay method， different gene transducted PC-3 cells can secrete different amount of TNF-a.Growth of the cells transfected with TNF-α gene was inhibited. A combination of TNF-α and 5-FU could increase the inhibitory effects on pancreatic carcinoma.Conclusion combination therapy with TNF-a gene and 5-FU has synergism to inhibit pancreatic cancer cell proliferation， which can decrease the dose of 5-FU， and has potential value to clinical treatment of pancreatic cancer.

【Key words】 Human tumor necrosis factor; gene moddification; Human pancreatic carcinoma; 5-Fluorouracil

我们采用逆转录病毒介导肿瘤坏死因子(TNF)-α基因修饰人胰腺癌细胞后联用氟尿嘧啶(5-FU)，旨在为胰腺癌基因治疗提供新的应用策略。材料和方法

1.基因转染：逆转录病毒载体人工包装TNF-α质粒(PLhTNF-α sN)含有内切酶EcoRI和BamHI位点。外源性基因猴病毒40(SV40)为启动因子，NeoR基因为标志基因，TNF-α为目标基因。质粒经大肠杆菌扩增，氯化铯(CsCl)超离心法纯化，采用磷酸钙共沉淀法转染包装细胞系PA317，收集含有TNF-α基因复制缺陷型逆转录病毒上清液转染PC-3胰腺癌细胞(购自北京协和医院)，用氨基糖甙类新霉素衍生物Geneticin(G418)筛选有抗性的细胞克隆。随机挑选细胞克隆1号和4号转染胰腺癌细胞，进行后续试验。

2.TNF-α活性蛋白表达检测：细胞接种量1×105个，在含5 ml培养液的培养瓶中生长5 d，使用Medgenix TNF-α ELISA kit (Medgenix diagnostic公司)，检测细胞培养上清液中TNF-α含量。利用TNF-α对放射菌素D处理后的小鼠成纤维肉瘤细胞L929的溶解作用，检测TNF-α的生物活性。

3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提细胞总RNA(试剂购自Gibco公司)。以下游引物合成cDNA(试剂盒购自Gibco公司)，再以其为模板，进行PCR，若阳性表达者预期可扩增出712 bp长度的片段。选用快速RT-PCR (Promega)。质量分数为1.5%琼脂凝胶电泳检测反应产物，扩增人TNF-α基因引 物为，上游引物：5′-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG，下游引物3′-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC。

4.TNF-α基因转染胰腺癌细胞的5-FU治疗：TNF-α基因转染胰腺癌细胞后给予5-FU治疗的疗效分析，以未转染的胰腺癌细胞为对照。5-FU治疗剂量为15 mg/L或30 mg/L。

5.细胞体外扩增情况的观察：胰腺癌细胞和TNF-α转染的胰腺癌细胞以1×108个/L分别接种于各15瓶培养瓶中，各组分别加5-FU30 mg/L或15 mg/L。每天取3瓶制成细胞悬液。质量分数为0.2%台盼蓝染色，连续观察5 d，绘制成生长曲线。

6.统计学处理：数据以均数±标准差(±s)表示，χ2检验。

结

果

1.转染TNF-α基因的细胞克隆的建立和表达：培养瓶中未转染TNF-α基因的细胞，经过G418筛选14 d被杀死，转导TNF-α基因的细胞在含有0.3 g/L G418的培养瓶中扩增形成稳定的克隆。PC-3-TNF-α的细胞培养5 d后，未转染的TNF-α胰腺癌细胞培养上清中TNF-α活性仅为10×103 u/L，而转染细胞的上清中TNF-α活性为25×104 U/L，是对照组的25倍。

2.外源基因检测：未转染TNF-α基因的胰腺癌细胞中无明显TNF-α的mRNA，而转染后的胰腺癌克隆细胞中，电泳中有TNF-α mRNA的特异性条带波，证实外源性TNF-α经逆转录病毒载体转染，已有mRNA的表达。

3.TNF-α的活性测定：PC-3/TNF-α的上清对L929细胞裂解70%，标准TNF-α的裂解率为90%， pC-3上清对L929细胞似乎无裂解作用。

4.5-FU和TNF-α转基因对胰腺癌细胞的生长抑制分析：PC-3细胞在低浓度的5-FU(15 mg/L)中生长较单纯转TNF-α的PC-3细胞(P＜0.05)或单用5-FU的PC-3细胞生长缓慢(P＜0.01)，但在高浓度的5-FU(30 mg/L)中，早期生长抑制不明显，而后期有明显的生长抑制(图1)。

讨

论

最近研究表明，胰腺癌的生物学行为与细胞因子参与有关，利用逆转录病毒载体将TNF-α基因转入人胰腺癌细胞，使其分泌有生物活性的TNF-α，期望对胰腺癌细胞产生抑制作用［1，2］。本研究结果显示，人胰腺癌细胞能被TNF-α基因转染，RT-PCR结果表明目的基因均有转录行为发生，且TNF-α基因转染的胰腺癌细胞增殖能力降低。我们认为TNF-α对转染的胰腺癌细胞有直接的抗增殖作用，即产生异化作用，通过转基因的方法，将外源性基因TNF-α转入胰腺癌细胞后利用胰腺癌细胞本身生长无序性和失控状态，表达出对自身有毒性作用的TNF-α导致胰腺癌细胞的逐渐死亡。

5-FU的单药治疗被视作为晚期胰腺癌的标准治疗，其有效率为20%，而其化疗药物的毒副作用制约了该药的大剂量应用。我们的研究结果表明，TNF-α转基因治疗和5-FU联合应用对胰腺癌增殖的抑制有协同作用，并可以减少5-FU的药量，提高该药的疗效，这对胰腺癌的综合治疗有潜在的临床应用前景，值得深入研究。

参考文献