时间：2023-06-21 08:55:03
1.1 教材内容及地位。
“细胞中的元素和化合物”是第二章“组成细胞的分子”第1节的内容，此部分内容由三部分内容组成：
（1）组成细胞的元素。（生物界与非生物界具有统一性与差异性）
（2）组成细胞的化合物。（无机化合物和有机化合物）
（3）实验：检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质。“第二章 组成细胞的分子”是必修1“分子与细胞”的基础内容，而“细胞中的元素和化合物”又是“组成细胞的分子”的基础。同时，学好“细胞中的元素和化合物”也是学习后面“蛋白质”和“核酸”的必不可少的知识。
1.2 教学目标。
（1）知识目标。
①简述组成细胞的主要元素，说出构成细胞的基本元素是碳。
②了解生物界与非生物界的统一性和差异性。
③初步了解检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的方法及现象。
（2）能力目标。
①培养归纳、分析、比较的能力。
②培养知识迁移能力，综合运用所学知识分析问题和解决问题的能力，以及提高学科之间相互渗透的迁移能力。
（3）情感态度价值观目标。
树立辩证唯物主义世界观，增强对生命的本质的认识，崇尚生命物质和谐之美，珍爱生命。
1.3 教学重、难点分析。
重点：（1）组成细胞的主要要素和化合物。（2）初步了解检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的方法及现象。
分析：确定第1个为重点的原因在于可以使学生树立分子水平上的细胞研究的概念；打好这个基础不仅可以使后面的学习比较容易，还能使学生了解到“生化不分家”的学科联系，有利于培养学生综合素质。确定第2个为重点的原因，实验的预习是做好实验的基础，课堂上的初步学习与课后的自学是预习不可缺少的，为下节实验课程做了奠基。
难点：（1）构成细胞的基本元素是碳。（2）初步了解生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质。
分析：如何让学生很自然地从大量元素的概念过渡到基本元素，对教师的教学来说是一个难点，可以通过举实例来突破；由于面对的是高一新生，初中实验技能，知识储备都有所不同，可以选择照顾绝大多数学生来进行引导，启发学习。
2. 教学方法
自学导思法――教师引导下的学生自主探究。
直观教学法――利用多媒体课件进行教学。
自学导思法有利于学生主动学习，激发学生独立思考和创新意识，充分发挥学生的主体作用。同时还培养了学生之间的团队协作精神。
3. 教学程序
下面通过教学程序来谈谈教法、学法的具体应用。
导入：
前一段时间，老师遇到一难题，因为老师不是本地人，初来时，就出现了“水土不服”的症状，吃药也不管用，大概持续了五六天后才恢复了正常。那有没有同学知道水土不服是怎么回事吗？
学生讨论，教师总结：
我们知道地球上的无机环境，比如水，空气，土壤等等都是由一些元素组成的，水由H、O组成等，那么长期生活在一个地方的人或生物，其体内的元素与当地环境中，尤其是水土中的元素保持着一致性。这叫人和一切生物与当地元素保持平衡。一旦远离故土到异乡去生活，一时适应不了新地方的元素环境，就会出现水土不服。经过一段时间的生活，新地方水土中的元素通过食物链进入人体或生物体内，逐渐改变体内的元素含量，使之再次达到新的平衡，水土不服就会逐渐消失。这就是人们常说的“一方水土养一方人”。
那我们人体及各种生物体内到底都有哪些元素呢？本节课，我们就一起来讨论一下第二章第一节内容“细胞中的元素和化合物”。（可激发学生的学习兴趣）
3.1 组成细胞的元素。
刚才我们说了“一方水土养一方人”，水的元素组成我们知道H和O，接下来，我们就来比较一下地壳以及组成生物体的结构和功能的基本单位细胞的部分元素含量（%）表，16页左上角。
（1）引导学生从“元素种类”和“元素含量”两方面来看。使学生明白组成。
元素的种类基本相同；组成元素的含量相差很大，进而使学生总结出“生物界”与“非生物界”存在“统一性”和“差异性”。教师总结：“统一性”和“差异性”。
（2）教师演示课件。
a.比较不同，引出“鲜重”与“干重”的概念。
b.根据课件引出“大量元素，微量元素，基本元素”的概念，并举例。
c.作出口诀，留1分钟快速记忆。
（3）小检测。
①黄金搭档中Ca、Fe、Zn、Se（硒）中哪些是大量元素，哪些是微量元素。
②东北虎和非洲象相比元素种类大体相同，含量相差较大。
3.2 组成细胞的化合物。
刚才我们学习了，组成细胞的元素，那同学们想一下，我们现在做这样一个实验：按严格的细胞个元素含量，比如取一两公斤的最基本的元素-C，按比例加入大量元素-H、O、N、P、S、Ca、Mg、K，再加入一些微量元素，进行搅拌，那同学们想一想在桶里会有生命体或细胞出现吗？（不会）从而导出“化合物”等概念。
接下来，我们就来学习一下，组成细胞的化合物。
设计讨论：
①3分钟讨论17页“思考与讨论”请同学代表作答。（小组讨论，询视学情）
②无机化合物。
a.水，分两部分讲解 a1 液态水（举例）a2 结合水（举例）一旦失水30%有生命危险。
b.无机盐，主要阐述其功能。
③ 有机化合物 a.糖类 b.脂肪 c.蛋白质：细胞中含量最多的有机化合物，组成生命体的重要物质，既是生命活动的实施者有时调解者。（举例）
d.核酸：DNA/RNA
3.3 布置实验任务。
18页-19页实验，教师出示总结的三句口诀，请同学们认真预习实验后，说出其含义，鼓励学生自己再总结更好的口诀。（3分钟记忆）
4. 练习与评价
本节内容为2课时内容，此节为第1课时，第2课时为实验课时，为了避免同学不预习实验，留下“三句口诀”让学生翻译，只有认真研读了实验，才能作答；亦可作为进实验室的口诀，不会背者不得进实验室，学生们渴望做实验，充分调动了学生的积极性，使学生感到学习“易”、“趣”、“活”。
另外《名师一号》上的习题也难度适宜，题量适中，也可作为课后作业，学生通过练习对所学知识巩固提高。
5. 教学反思
进行这样的教学设计的理论依据：
锌硒对人体有重要的生理作用，许多专家和学者通过不同的研究方法从其生化、生理、临床作用及机理的等方面展开了大量的研究，取得了一定的进展，为锌硒的研究提供了大量依据。本文介绍了微量元素硒锌与人体健康的现状及其临床价值和应用前景。
1锌、硒的抗氧化作用
硒在机体内主要以结合蛋白（硒蛋白）的形式发挥作用。目前已发现的人硒蛋白有二十多种，只有硫氧蛋白还原酶和脱碘酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的生理功能研究得比较清楚，其它部分的硒蛋白发现得比较晚，它们的功能正处于研究中。硒以GSH-Px的形式在体内发挥抗氧化作用，其过程为：GSH-Px催化还原型谷胱甘肽成为氧化型，与此同时把有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化物，进而保护组织细胞，尤其是生物膜免受过氧化氢的损害。据报道：维生素E在体内的主要作用也是抗氧化作用，是防止生物膜中磷脂被过氧化的第一道防线。然而，即使供给充足的维生素E，仍有一些过氧化物在胞液中产生，这些过氧化物的清除是由GSH-Px完成的。有许多文献报道：维生素E与硒在抗氧化作用上是协同互补的[1-2]。近年来研究发现：直接影响GSH-Px活力发挥的是活性中心含量的高低。GSH-Px含量低是因重金属干扰了硒的代谢，使GSH-Px失活导致其与蛋白质的巯基结合，比如与生物体内谷胱甘肽过氧化物酶的结合，形成不可逆复合物，干扰酶的活性及其抗氧化功能；或者与细胞膜表面酶的巯基结合，改变其结构和功能，形成了自由基[3]。元素硒是维持体内GSH活性的重要因素，对金属汞的毒性有抑制作用[4]。元素锌作为体内重要的必需微量元素，有明显的抗氧化作用。锌通过金属硫蛋白（MT）发挥抗氧化作用，这是抗氧化的另一个主要途径。金属硫蛋白是一种低分子量能与重金属结合的蛋白质，由于巯基含量丰富，同时与二价汞有极大的亲和力，锌作为金属硫蛋白基因表达的有效促进因子[5]，促进金属硫蛋白的生成。MT对蓄积在体内的汞能够起缓冲作用。MT能够抵御重金属的毒性作用，在保证金属元素的稳态以及清除自由基等方面发挥重要的作用[6]。锌的生物学功能很广泛，锌是含铜与锌超氧化物岐化物（CuZn–SOD）重要的活化因子，CuZn-SOD作为体内重要O2-的自由基清除剂，CuZn-SOD能够歧化汞在体内产生的超氧化物阴离子自由基O2-成为氧化氢和氧，从而减少其对细胞膜的损伤，拮抗其在体内的毒性效应[7-8]。有研究发现：锌能够诱发位于细胞质膜上的转砷蛋白，使砷在机体内的含量明显降低，硒通过谷胱甘肽（GSH）的中介作用与砷形成复合物，降低游离砷的浓度，抵制砷的毒性作用。砷、硒都可与巯基或甲基结合，硒和锌的加入能干扰砷与巯基及甲基的结合，进而使其的毒性降低。砷能够导致脂质过氧化[9]，锌为SOD酶的重要组成部分，而硒为谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，锌和硒的摄入能使该酶活性增强，拮抗重金属的氧化损伤作用。
2锌硒的抗肿瘤作用
大量的实验发现，硒具有显著的抗肿瘤功效。大量的流行病学的资料表明：膳食、地质环境决定了人群血硒含量与肿瘤的发生率及死亡率呈负相关性。因机体的免疫与肿瘤的发生、发展关系密切，所以我们可认为硒的抗肿瘤作用是通过调节和增强机体免疫来实现的。事实上许多研究证实了补硒能维持或提高实验动物的免疫能功能[10]。元素硒可以增强巨噬细胞对巨噬细胞活化因子的反应性，降低巨噬细胞对淋巴细胞的抑制作用；可以增强T淋巴细胞对有丝分裂原或同种抗原刺激的增殖反应；也可以增强自然杀伤细胞的活性，[11]缺锌能使实验动物脾细胞的绝对数量减少，胸腺和淋巴组织萎缩，T细胞依赖的及T细胞非依赖的抗原免疫反应下降，有研究报道：缺锌动物的脾细胞花环形成细胞只有锌充足脾的40%。即使T、B细胞的比率没有变，锌缺乏鼠B细胞表面的IgM的比率是对照鼠的2倍，表明锌缺乏鼠脾中有不成熟的B细胞在增加[12]。体外实验发现：无活性的胸腺肽在锌缺乏受试者血清中存在，并且通过补锌能够激活血清中的这种无活性的胸腺肽，体外测定胸腺肽的活性作为判断是否缺锌的标准。有研究表明轻度缺锌的结果是血清胸腺素的活性显著下降，而且补锌可使其得到纠正[13]。核因子KB（nuclear factor-kappaB，NF-KB）NF-kB是辅T细胞1（Helper T cells，Th1）调节白细胞介素2（IL-2）及白细胞介素2受体（IL-2R）表达的主要的转录因子，其机理：锌通过提高抑制性核因子（I-kB-a）磷酸化，使NF-kB转位、激活，同时增加IL-2及白细胞介素2受体拮抗剂（IL-2Ra）的产生。BAO等[14]将I-kB基因转染给缺乏锌的T淋巴细胞白血病细胞（HUT-78细胞），与缺乏锌的T淋巴细胞白血病细胞（HUT-78细胞）相比，锌能够抑制I-kB途径，增加NF-kB活性。据报道：硒在1mg/L浓度时能够对人舌鳞癌细胞有显著的抑制作用，但对正常成纤维细胞无显著抑制作用[15-16]。当硒浓度在30μmol/l时对正常肝细胞及肝癌细胞作用48h后，其增殖及活力都受到明显的抑制，从而导致细胞的凋亡[17]。锌的生理剂量（1mg/L）能够显著抑制人前列腺癌细胞生长作用[18]，在25、50、100μmol/L的锌浓度时，却能促进结肠癌细胞生长，它的存活率因锌浓度升高而升高[19]。因此，不同的锌、硒浓度产生不同的作用效果，其取决于锌、硒的浓度范围、细胞类型和作用方式。有研究发现：锌、硒都可以诱导细胞周期蛋白改变，导致细胞周期阻滞，DNA的合成降低，从而细胞生长受到抑制，只是它们作用机制有所不同。比如锌能抑制G1期细胞周期素依赖性蛋白激酶的P21蛋白表达增加，引起细胞G1期阻滞[20]；而硒能抑制细胞周期蛋白激酶cdk2及蛋白激酶C等，引起细胞周期停滞在S期[21]。比如锌浓度在3.5μg/ml时能使食管癌细胞周期停滞在G1期，从而不能进入S期合成DNA；硒浓度在0.3μg/ml时能使癌细胞S期延长，G1期减少，同时促进细胞的凋亡。因此它们联合对抑制食管癌细胞生长、DNA的合成以及促进细胞凋亡的作用远比其单独作用强，这与锌、硒都能通过下调抑制凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-2的表达，增加促凋亡蛋白Bax的表达，这与激活半胱天冬酶3（caspase-3）、诱导细胞凋亡[16]有关。
3锌、硒在感染性疾病中的作用
流行病学调查发现：微量元素锌硒缺乏者患感染性疾病的风险比正常者增高。锌硒可以辅助治疗病毒性心肌炎其机理可能如下：①微量元素锌硒具有保护心肌细胞膜及某些细胞器，提高心肌细胞氧化磷酸化能力，抑制脂氧合酶活性进而清除氧自由基。②锌硒能够增强体液免疫、细胞免疫及单核-巨噬细胞的吞噬能力及抗感染能力。③锌硒能够通过参与含硒酶GSH-Px、含锌酶SOD活性，增强机体抗氧化能力，进而使心肌细胞免受损伤和干扰，进而促进其功能的恢复[22]。小儿反复呼吸道感染与血清中多种微量元素的缺乏有关（如锌、硒等）。当某些微量元素浓度低下时，机体中的T、B细胞的增殖分化发生障碍，特别是辅T细胞功能受到损害，进而引起小儿反复呼吸道感染发作。锌、硒能够提高机体的免疫功能，参与许多酶的组成，促进T、B细胞的增殖与分化能力[23]。
4锌硒对其他疾病的作用
锌硒能使尘肺患者体内的脂质氧化物减少，使自由基的清除剂升高，起到抗氧化作用。有研究发现：补充葡萄糖酸锌给尘肺患者，能减轻尘肺患者的自觉症状、体征，从而改善肺通气功能[24]。锌硒能使尘肺患者的自觉症状（咳嗽、咯痰、胸痛、气促）得到明显的改善，延缓其进展，预防并发症的发生[25]。小儿厌食与微量元素锌硒关系密切，由于厌食症患儿食欲不振影响胃肠功能，营养素得不到吸收，致使微量元素摄入不足，并且微量元素缺乏又在某种程度上导致儿童厌食，导致恶性循环。给厌食儿童补充硒、锌制剂可以显著改善和增加儿童食欲，然而有报道表明：单用补锌制剂未见效果后要注意适量补充硒制剂[26]。近年研究发现，锌可以影响垂体分泌促性腺素这与生精功能密切相关，维持活动能力的重要因素之一是精浆中存在高锌，锌直接参与的生成、成熟、激活和获能过程，缺锌能够影响性腺的发育、导致性腺功能不足、性器官发育不全或减退、性成熟障碍。影响产生和代谢的一系列酶的组成成分之一是硒，缺硒导致生成不足。硒作为对抗某些毒性作用的代谢元素之一，能够避免有害物质伤害生殖系统，维持细胞的正常形态[27]。锌与胰岛素分泌和储存关系密切。微量元素锌硒与高血压、糖尿病的发病及慢性病变发生、发展存在密切关系。适当调整微量元素的供给等综合防治措施能纠正糖代谢紊乱、防止、延迟或减轻糖尿病慢性病变的发生[28]。类风湿性关节炎的病因或病情加重的原因之一可能是缺锌，口服硫酸锌糖浆能改善患者关节肿胀等自觉症状。硒对治疗类风湿（RA）却没有临床有效性[29]。
5锌硒的需要量
在我国出现的克山病和大骨节病可通过补硒来预防；流行病学调查中发现在美国高硒地区多种心脏病和死亡率明显低于低硒地区，尤其是发现了因硒缺乏使癌发生率、死亡率升高；在芬兰东部、新西兰东部低硒地区以心肌梗死为主的心脏病发生与低硒状态密切相关。因而有专家考虑把硒作为这些疾病的预防药，然而硒的营养安全带窄。摄入其1/10量则能引起缺乏病；而摄取营养水平的10倍量则引起中毒。因而对硒需要量的研究作为硒营养学中的一个新课题。以前的研究是通过动物实验和理论上的推测获得数据。由于我国同时有世界上少有的低硒地区和高硒地区，都出现相应的缺乏病和中毒症。因而这些地区是研究人类硒需要量的最佳实验基地。杨光圻等从1982年就开始研究人体硒需要量，在我国西南低硒地区进行硒的最低需要量和生理需要量的研究，并且测出成人每日最低硒需要量为17μg，生理需要量为40μg，用安全因子处理后得出满足最低及生理需要的每日膳食供应量分别为22μg和50μg[30]。动物实验表明硒的抑癌作用往往都接近中毒量。所以，在疾病防治上涉及到硒的最大安全摄入量。杨光圻等1985-1988年间在恩施高硒地区研究表明：成人每日最高限硒摄入量为750-800μg[31]，用安全因子处理后，得出非高硒地区和高硒地区最高摄入量分别为每日400μg和500μg。在1990年这些研究数据得到3个国际组织（FAO/WHO/IAEA）承认和采用。锌主要存在于动物内脏、海产品中。在日常生活中，摄取的锌元素往往不会发生锌的中毒，然而大剂量服用含锌制剂以致超过机体代偿能力时，就会对机体产生损伤作用。过量锌会引起含锌的金属蛋白酶AKP的活性减低，降低蛋白酶活性[32-33]。美国全国科学研究委员会推荐：半岁以内婴儿每人每天需锌3mg，1岁以内5毫克，1-10岁儿童每天10mg，11岁以后至成年均需15mg，妇女妊娠期每天增加5mg，哺乳期增加10mg。因此，微量元素锌硒虽然在人体内含量极少，却广泛分布于各个器官组织内，是机体生命活动中的物质转运和交换的必需微量元素，与人体息息相关。
6展望
锌、硒对人类健康的影响越来越受到人们的重视，即使有大量令人信服的证据说明微量元素锌硒对人体健康有着重要的调节作用，目前仍存在一些问题尚需进一步研究探索，比如它们对人体健康影响更深层次机理，它们之间的协同作用对人体健康影响及如何提高微量元素的吸收利用率均需更广泛、更深入的研究探索。随着各种机理的阐明它们必将作为保健、预防用药进入一个崭新的应用时代。
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[关键词] 大鼠；老年性痴呆；芹菜甲素；神经保护
[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2009）05（a）-011-03
A study on the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with Alzheimer’s disease
ZHU Jiying1，WU Hongwei2，WANG Mingqin1，GAO Ying3，ZHOU Yongkun4
(1.The Second Affiliated Hospital, Shandong TCM University, Jinan250001，China; 2.Jinan medical insurance manage office, Jinan250002, China; 3.Jinan medical society, Jinan250031, China; 4.The first hospital attached to Shandong traditional Chinese medical University, Jinan250011, China)
[Abstract] Objective: To study the mechanism of Donepezil's protection in neuron of hippocampus in mice with AD. Methods: The mice were given to D-galactolipin and chlorinate aluminium by intragastric administration to establishchronic Alzheimer's disease rat models, then Donepezil was given by intragastric administration. The behavioral abnormalities were investigated by Y type maze test. The expressions of T-SOD and MDA were measured by a immunohistochemistry technique. The performance and learning ability were observed. Results：Compared with model group, the performance records of learning and memory in Donepezil group were better (all P
[Key words] Mice;Alzheimer's disease;Donepezil;Neuroprotection
现代医学研究表明：AD病理改变主要为tau蛋白异常磷酸化、β-淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结、神经元颗粒空泡样变性和神经元丢失[1-2]。但病因复杂，发病环节较多，目前认为与神经递质紊乱、基因突变、氧化应激和自由基损伤、钙离子超载、免疫/炎症反应和神经细胞凋亡等多因素有关[3]。本实验在建立注射D-半乳糖(D-gal)致痴呆大鼠的模型基础上,再给予AlCl3连续灌胃造成拟AD复合模型,采用对照研究的方法观察实验动物的行为学、T-SOD、 MDA的活性、细胞内游离钙离子浓度的变化及神经细胞形态学和细胞凋亡的定量分析，探讨神经元凋亡在AD发病过程中的意义及芹菜甲素的防治作用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 动物及分组清洁级雌雄各半SD大鼠80只（购自中国军事医学科学实验动物中心），月龄2～3个月，质量（280±50）g,通过行为学实验筛选合格的大鼠随机分为：空白对照组、模型组、脑复康组、芹菜甲素组。大鼠用标准实验动物饲料喂养,其中微量元素含量均可满足动物正常生理需求。室温（23±2）℃。
1.1.2主要仪器及试剂结晶三氯化铝（沈阳市试剂三厂，批号：20001201)，D-半乳糖(上海试剂二厂，批号：990927。), 芹菜甲素（太原兴远生化有限公司），T-SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程公司，批号：20001112、20001008）；Fluostar多功能微孔分析仪(德国BMG公司)；流式细胞仪（FACS can型,美国BD公司生产，由总医院提供）。
1.2方法
1.2.1模型制备及药物干预适应性饲养1 周后，空白对照组正常饲养，模型组、脑复康组及芹菜甲素组给予 D-半乳糖 50 mg/（kg・d），颈背部皮下注射，并三氯化铝50 mg/（kg・d）灌胃，连续10周造成亚急性衰老复合模型鼠。造模的同时，芹菜甲素组按 20 mg/（kg・d）、脑复康组按200 mg/（kg・d），灌胃给予，每日1次，连续10周。
1.2.2 Y型迷宫试验利用Y型电迷宫，参照文献[4]方法训练于第10周后开始行迷宫测试，先将大鼠放入迷宫中适应3～5 min，然后无规则次序变换安全区，训练大鼠对安全方位及灯光刺激的辨别能力。大鼠受电击逃到安全区后以大鼠所在区作为下一次测试的起始位置，每日在固定时间（下午3∶00～5∶00）对每只大鼠进行15次训练,连续5 d。以大鼠在足底通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应；记录正确次数、正确率及跑至安全区所用时间作为判定大鼠学习记忆的标准。
1.2.3测试后处理于迷宫测试完成后末次给药后12 h，经心室腔穿刺取血。取血后立即断头取脑，去除血液及脑膜，置于液氮罐中保存备用。
1.2.4SOD和MDA测定血液经2%的EDTA抗凝离心后取血清，分别按试剂盒说明书进行测定。
1.2.5观察皮质和海马病理学变化分组取大脑，10%中性缓冲液福尔马林固定4 h以上，石蜡包埋。冠状连续切片8张（4 μm），HE染色, 免疫组化采用SP法，光镜下观察皮质、海马。
1.2.6神经细细胞内游离钙离子浓度的测定剥离脑皮质和海马组织，分别置于DMEM培养液中剪碎，用吸管吹打分散细胞，经300目铜网过滤，离心后弃上清，0.01 mol/L PBS洗涤,台盼蓝排斥试验检查，细胞成活率达90%。细胞悬液在37℃水浴中预温5 min，加入Fura 2・AM-1使终浓度为5 μmol/L，于37℃水浴中恒温振荡40 min进行负载。后以D Hank's液洗涤，并制成1×106/ml的单细胞悬液。采用Fluostar多功能微孔分析仪，激发波长340 nm和380 nm，发射波长505 nm，测定荧光强度，并按文献公式计算出神细细胞内游离钙离子。
1.2.7流式细胞仪检测细胞凋亡的定量分析[5-6]剥离脑皮质和海马组织，在冷70%乙醇中固定。用吸管吹打分散细胞，加入0.25%的胰蛋白酶液,37℃消化30 min,经300目铜网过滤，0.01 mol/L PBS洗涤并制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml。DAB显色，采用TUNEL检测法。将所得数据经Macintosh 650型计算机上用CellQuestPlot软件(BD公司生产)分析数据，分析细胞的凋亡百分率（细胞凋亡率=凋亡细胞/总细胞数×100%）。细胞核棕黄色为凋亡细胞。
1.2.8 统计学处理所有实验数据用SPSS 10.0统计软件处理，采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，各实验组均数间的两两比较，若方差齐则采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane's T2检验。
2结果
2.1 各组大鼠学习记忆成绩的比较见表1。
2．2 芹菜甲素对拟痴呆大鼠血清中SOD及MDA的影响见表2。
2.3芹菜甲素对拟痴呆大鼠脑组织形态学的影响
HE染色(免疫组化×400)可见空白对照组大鼠皮质、海马区神经细胞数目多，排列紧密、均匀而整齐，胞核呈圆形或椭圆形，染色质均匀，核仁明显；模型组和脑复康组均见不同程度的神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱，胞核深染、固缩，有核仁消失，胞浆周围发现空晕，胞间距较大，并可见不规则形胶质细胞及散在的胶质细胞增生小结，仅见少量正常神经细胞；芹菜甲素组正常神经细胞数目较多，排列较密，胞核圆或椭圆形，染色质丰富，核仁清晰，少见固缩变性的神经细胞。
2.4芹菜甲素对拟痴呆大鼠神经细细胞内游离钙离子浓度的影响
模型组大鼠神经细细胞内游离钙离子浓度较空白对照组升高(P
2.5芹菜甲素对拟痴呆大鼠神经细胞凋亡的影响见表3。
在DNA直方图上，模型组于G0/G1峰左侧出现了一个明显的亚二倍体峰（细胞凋亡峰），表明DNA的降解增多，芹菜甲素组的DNA直方图中也可见到凋亡峰，但显著低于模型组，空白对照组则未见明显的凋亡峰。
3讨论
芹菜甲素为伞形科植物旱芹的干燥成熟果实粉末状提取物的有效成分。铝作为一种神经毒素，可能是导致AD 的病因之一。铝可进入脑内取代钙和镁离子，同氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸的羧基结合形成谷氨铝盐或精氨酸铝盐的稳定复合物而沉积于脑内，引起tau蛋白异常磷酸化反应，形成神经元缠结，促进A β的形成而产生老年斑，破坏血、脑脊液屏障及改变脑细胞内溶酶体活性,使自由基生成过多等，最终导致神经元死亡，患者出现记忆、语言、认知功能等进行性智能功能丧失和近记忆力障碍[7]。因为AD的是多成因发病和错综复杂的病理过程，笔者在使用D-半乳糖致亚急性衰老提供的一个老化背景的基础上，再予铝剂模拟AD，以形成多因素复合实验性AD大鼠模型。这样的复合模型可能较以前的单因素AD动物模型更贴近AD复杂的病理变化过程，尤其是更适合用于探讨药物多靶点作用机制和有效药物筛选的研究模型[8]。通过实验提示，该模型在学习记忆、细胞凋亡等方面都表现出广泛的类AD的病理改变。
随年龄的增长，氧自由基的清除能力退化，在体内大量聚积，破坏细胞膜，可诱发细胞凋亡[9]。本实验在应用芹菜甲素后，治疗组较模型组SOD活性升高,MDA 含量降低，表明可能通过减轻脂质过氧化反应，保护酶的活性，达到抗氧化作用，直接或间接清除D-半乳糖和三氯化铝引起的自由基产生增多造成的损害，避免抗氧化性物质消耗导致的脑组织损伤，也从另一个侧面验证了SOD的活性和MDA含量的改变在AD发病中的作用。
随着老龄化的发生，细胞内的Ca2+调控能力逐渐衰退，细胞膜上钙通道开放和细胞内钙库的释放而引起胞内Ca2+呈渐进性增加，钙稳态被破坏[10]。钙超载使兴奋性氨基酸过度释放，产生自由基造成线粒体能量代谢障碍和神经细胞骨架破坏，最终导致神经元死亡[11]。因此阻断细胞钙内流，维持细胞内钙稳态，也是保护细胞正常功能的一个重要手段之一[12]。本实验结果显示，芹菜甲素可以降低拟AD大鼠细胞内的游离钙离子浓度，通过维持细胞内钙稳态，抑制了伴随脑老化产生的钙超载，对神经细胞起到了保护作用。
凋亡是一种细胞主动参与的自毁过程，与细胞坏死有根本区别，它与细胞的增殖共同维持机体正常生长发育和内环境的稳定。在细胞凋亡的诸多诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡，细胞凋亡可能是机体氧化和抗氧化失衡的结果之一。细胞发生凋亡时,出现明显的核固缩、断裂、凝聚,形成凋亡小体[13]。
本实验研究结果显示通过激光共聚焦的形态学检测和在流式细胞仪DNA定量分析图谱上出现显著的凋亡峰，结合芹菜甲素能提SOD 活性, 降低脂质过氧化产物丙二醛含量, 减轻氧化应激，清除自由基, 维持细胞内钙稳态，抑制神经元凋亡，抗脑萎缩多位点作用, 提示芹菜甲素具有较好的抑制AD发生的作用，也为开发中药及其提取物从多环节防治AD提供了客观的理论依据。
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【关键词】 ngal基因 食管癌细胞 基因表达调控 tpa反应元件
0 引言
ngal（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin）基因是lipocalin家族的一个新成员，全长5 869bp，包括7个外显子，位于染色体9q34区域，单拷贝，蛋白编码区长度591bp，编码197个氨基酸。近年有研究证明，ngal基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，mmp9）的活性，以及作为小分子铁化合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能[13]。我们以往研究发现，在tpa（12otetradecanoylphorbol13acetate）诱导永生化食管上皮细胞癌变过程中ngal基因过表达[4]。这提示在食管癌细胞ngal基因转录调控区可能存在着某种tpa反应元件，但具体位置尚不清楚。为此，本文通过双荧光素酶报告基因检测系统对ngal基因5′侧翼416～+84区片段的tpa反应性进行研究，主要目的是检测ngal基因启动子区及其附近是否存在tpa反应元件。这将有助于深入到分子水平揭示食管上皮细胞癌变过程中ngal基因过表达机制。现将有关实验方法与结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞与细胞培养 食管癌细胞系ec109由中国医学科学院肿瘤研究所林晨研究员惠赠。使用199培养基（invitrogen），在常规条件下传代培养。
1.2 细菌菌株、质粒及主要试剂 jm109细菌菌株、萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pgl3basic(pglb)和pgl3enhancer（pgle）、海肾荧光素酶报告基因表达载体prltk（内参照质粒）、双荧光素酶报告基因分析系统均购自美国promega公司；转染试剂fugene 6 reagent购自德国roch公司。质粒提取试剂盒购自德国qiagen公司。实验质粒pglb416和pgle416，采用pcr法从食管癌细胞sheec(在tpa作用下,由永生化食管上皮细胞恶变而来[5])中克隆出ngal基因5′侧翼区416～+84片段，分别插入到质粒pglb和pgle的xhoⅰ和bglⅱ 双酶切位点，测序鉴定。
1.3 瞬时转染与tpa诱导实验 采用qiagen公司质粒提取试剂盒分别提取实验质粒pglb416和pgle416、对照质粒pglb和pgle以及内参照质粒prltk，并测定各质粒含量。质粒转染步骤参照文献[6]进行。转染后24h，加入终浓度为5ng/ml的tpa（sigma公司）进行诱导。继续培养24h后，收获细胞。每组实验样品3个实验孔，并至少进行3次重复实验。
1.4 双荧光素酶活性检测 双荧光素酶活性（dlr）检测按照双荧光素酶报告基因分析系统（promega公司）操作手册及文献[6]所述方法，在td20/20照度计（turner designs 公司）上进行。
1.5 统计学分析 根据td20/20型照度计配置的软件包计算出各组相对荧光强度（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶），以此代表荧光素酶活力。各组实验数据均计算平均值及标准差。应用spss 10.0对各组实验数据之间是否有显著性差别进行t检验。
1.6 生物信息学分析 应用转录因子数据库（ 2 结果
2.1 pglb416或pgle416的表达活性及tpa反应性
2.1.1 pglb416的表达活性及tpa反应性
有关实验结果见图1-a。从中可见: (1）在没有tpa作用下，与转染空载体pglb相比，转染pglb416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力极显著升高 (t检验， p<0.01)，约升高6.42倍。(2） 在5ng/ml tpa作用下，与转染空载体pglb相比，转染pglb416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力升高更显著 (t检验， p<0.01)，约升高46.82倍。(3）转染pglb416的食管癌细胞ec109，tpa作用（5ng/ml）与没有tpa作用相比，前者的相对荧光素酶活力极显著升高(t检验， p<0.01)，约升高5.17倍。上述实验结果提示，ngal基因5′侧翼416～+84区段是启动子所在部位，启动基因表达的基础水平很高，而且具有明显的tpa反应性，说明在ngal基因5′侧翼416～+84区段存在较强的tpa反应元件。
2.1.2 pgle416的表达活性及tpa反应性
有关实验结果见图1-b。从中可见: (1）在没有tpa作用下，与转染空载体pgle相比，转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力极显著升高 (t检验， p<0.01)，约升高32.25倍。(2）在5ng/ml tpa作用下，与转染空载体pgle相比，转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力升高更显著(t检验， p<0.01)，约升高46.41倍。(3）转染pgle416的食管癌细胞ec109，tpa作用（5ng/ml）与没有tpa作用相比，前者的相对荧光素酶活力极显著升高(t检验， p<0.01)，约升高7.37倍。上述实验结果表明，ngal基因启动子元件接受增强子作用，与之协调的能力是很强的，而且表现出明显的tpa诱导特性。
2.2 pglb416与pgle416 tpa反应性的比较
有关实验结果见图2。从中可见: (1）无论是否有tpa作用，与转染pglb416相比，转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力均极显著升高（t检验， p<0.01），约分别升高5.77（没有tpa作用）和7.17（有tpa作用）倍。(2）转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力，有tpa作用与没有tpa作用之间的差值为48.35(55.85～7.50)；相对而言，转染pglb416的则为6.69 (7.79～1.30)，不足前者的1/7。这表明在tpa作用下，与转染pglb416相比，转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力升高的幅度要大得多。这些实验结果提示，在体现应答tpa刺激时ngal基因启动子的作用在增强子协助下会显著增强。
无论是否有tpa作用，与转染pglb416相比，转染pgle416的食管癌细胞ec109的相对荧光素酶活力均极显著升高（t检验， p<0.01）。上述相对荧光素酶活力检测实验方法同图1。
2.3 生物信息学分析结果
应用转录因子数据库（ 3 讨论
我们以往研究发现，ngal基因在人食管上皮细胞癌变中显著过表达[4]，具有促进癌细胞侵袭的功能[7]，同时可能还在癌细胞的不良分化中发挥作用[8]。这些研究结果提示，ngal基因可能是人类的一个重要的新癌基因，但在食管癌等肿瘤细胞中过表达调控的机制不明。
近年，cowland等[9]研究发现，在ⅱ型肺泡上皮细胞a549培养液中加入细胞因子il1β可诱导ngal基因表达上调10倍以上。而gombart等[10] 则研究发现，c/ebpε因子(增强子元件ccaat特异性结合蛋白因子)缺陷鼠中性粒细胞ngal基因的转录减弱。这些实验结果提示，il1β和c/ebpε等因子的作用分别与ⅱ型肺泡上皮细胞和中性粒细胞中ngal基因的表达相关。然而，我们最近的研究结果表明，在食管癌细胞中，ngal基因的转录与il1β和c/ebpε等因子的作用均没有关系（另文发表）。这提示在食管癌等肿瘤细胞中可能存在着另外一种机制控制着ngal基因的转录。以往我们曾研究证明ngal基因的启动子位于其5′侧翼-152～＋84区段[11]，而通过本文的实验结果来看，在ngal启动子及其附近区域（-416～＋84）存在着tpa反应元件。这说明tpa是导致食管癌细胞ngal基因过表达的一种调节因素。推测tpa可能是通过细胞内信号传递途径激活了某种tpa反应元件结合蛋白，导致ngal基因过表达。
pglb和pgle是两种不同性质的萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。pglb空白载体上无任何的启动子或增强子等基因转录调控元件。把ngal基因5′侧翼-416～＋84区段dna插入pglb，主要目的就是要考查ngal基因的这一区段dna启动基因表达的基础水平。pgle空白载体上插有一个强增强子，即sv40大t抗原基因的增强子。把ngal基因5′侧翼-416～＋84区段dna插入pgle，主要目的就是要考查ngal基因启动子区dna接受增强子作用的能力，评价ngal基因表达的诱导特性。综合本文研究所获得的各项实验结果来看，ngal基因5′侧翼区-416～+84这一区段dna，启动基因表达的基础水平很高，接受增强子作用的能力很强，且表现出非常明显的tpa诱导特性。
关于tpa反应元件，较早就有研究报道，但效应细胞种类不同，tpa反应元件的序列会有很大变化。迄今被研究报道的tpa反应元件主要有如下三种类型：①ap1复合因子结合型[12]，元件典型序列为tga(c/g)tca， ② gata家族蛋白结合型[13]，元件典型序列为gata box，③ sp1样家族蛋白结合型[14]，元件典型序列为 ggggcggggc。生物信息学分析发现，在ngal基因-416～+84区段存在4个sp1型tpa反应元件，但究竟是哪一个或几个在实际中发挥作用，以及是否存在新的tpa反应元件，均需进一步实验鉴定。最近，我们联合运用定点突变、双荧光素酶报告基因检测系统和凝胶滞留等实验技术手段研究证明，ngal基因的tpa反应元件位于其5′侧翼-95/-94左右，并且很可能是一种新结构类型形式，而ec109食管癌细胞核内也的确存在着某种核蛋白因子能够与ngal基因这一区域的相应片段（-107～-82）相结合（另文发表）。
总之，在ngal基因-416～+84区段发现存在tpa反应元件是十分有意义的。这既有助于深入到分子水平揭示为什么食管上皮细胞癌变中ngal基因过表达，同时也有助于进一步认识tpa细胞信号传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用机制。
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[关键词] 巴戟天；骨代谢；实验研究；综述
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）22-27-04
Advances in experimental research of morinda officinalis on bone metabolism
LI Yunhai WANG Yafei WEI Zhiqiang ZHANG Qingfeng JIANG Zhuonan BAI Liqun
Eastern Orthopaedic Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078， China
[Abstract] A system review of morinda officinalis's effect on bone metabolism， provides a new method for further study. The efficient ingredient of Morinda officinalis is able to promote the proliferation of the bone marrow stromal cells（BMSCs） and osteoblasts， which can restrain the apoptosis of the osteoblasts and the bone resorption of the osteoclasts. Especially， morinda officinalis has various of microelement that bone metabolism needs. We should enhance the experimental research of the Morinda officinalis's effect inside human body.
[Key words] Morinda officinalis； Bone metabolism； Experimental research； Review
巴戟天（Morinda officinalis How）又名鸡眼藤、百眼藤、三角藤、黑藤钻、土藤、糠藤、鸡肠风、猫肠筋、兔儿肠、兔仔肠等，为双子叶植物纲茜草科植物。巴戟天以根入药，我国著名的四大南药之中即有其地位。巴戟天最早载于我国现存最早的药物学专著《神农本草经》中，曰其味辛微温，“治大风邪气，阴痿不起，强筋骨，安五脏，补中增志益气”[1]。我国中医药学中认为其味甘、辛，性微温；归肾、肝经；具有补肾阳，强筋骨，祛风湿之功效；用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软[2]。根据近年来现代药理学研究显示[3]，巴戟天具有多种药理活性，包括调节免疫、抗氧化、抗炎镇痛、抗焦虑抑郁、强壮骨骼、调节心血管及生殖系统功能以及抗肿瘤等的药理活性。并且其化学成分较为复杂，现有研究已分离出24种无机元素以及11类化合物[3-4]，其中巴戟天醇提取物中含蒽醌类化合物、B-谷甾醇、水晶兰甙、环烯醚萜苷类、黄酮等有效成分，而其水提取物中含有维生素C、糖类、氨基酸等多种有效成分。当前，巴戟天对调节骨代谢作用的研究取得了一定进展，本资料将对巴戟天对骨代谢相关作用的相关实验研究作一综述，为进一步研究巴戟天在骨科领域，特别是骨代谢相关实验研究和临床研究提供理论依据。
1 巴戟天的对骨髓基质细胞增殖的促进作用
骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是一种间充质细胞，其来源于骨髓基质，它可向不同的中胚层组织细胞分化，例如成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等[5]。
凌昆等[6]将巴戟天中分离出的各组分对大鼠骨髓基质细胞进行培养72 h后，以MMT法检测其A值。结果显示，其中的某些成分对骨髓基质细胞的增殖具有促进作用。但其具体成分尚不明确，可进一步进行研究。
近年来研究显示[7]，核心结合因子α1（core-banding factor α1，Cbfα1）为骨形成的关键基因之一，它对成骨前体细胞以及非成骨细胞上的与成骨分化相关的基因的表达进行调和，而对其向成骨细胞的分化具促进作用。胚胎时期的骨发育期的间充质细胞凝集阶段时Cbfα1基因即开始表达，而无成骨细胞的发生也由此时期此关键基因的表达缺失导致[8]。王和鸣等[9]研究表明，成骨细胞的自骨髓基质细胞分化而来的过程也与Cbfα1基因关系密切，巴戟天水提取物及其醇提取物皆可以增强此过程中Cbfα1基因的表达，而且巴戟天醇提取物的促进作用强于巴戟天水提取物。黄胜杰[10]等研究也表明，特定浓度的巴戟天提取物可促进体外培养成骨分化。这说明对骨髓基质细胞的成骨分化的促进作用即为巴戟天所具有的补肾、强筋骨的作用机制可能性较大。
2 巴戟天促进成骨细胞增殖并抑制其凋亡的作用
骨代谢中骨量的维持主要由两种主要细胞来完成，即成骨细胞（osteoblast，OB）介导的骨形成和破骨细胞（osteoclast，OC）介导的骨吸收[11]。成骨细胞是骨组织形成中的重要功能细胞，由间充质细胞分化而来，它能够合成I型胶原，进而生成分泌骨基质，属于蛋白分泌型细胞；它具有较高的碱性磷酸酶（ALP）活性，它还可以对钙离子进行吸收和转运，故而对骨形成和骨重建具有重要意义。成骨细胞变形离开骨面后破骨细胞附着其上进行骨吸收，而后成骨细胞再于骨吸收形成的凹陷处分泌合成非胶原蛋白和骨基质，从而参与骨形成[12]。骨吸收和骨形成之间的平衡被破坏可由成骨细胞被破坏所导致，一旦如此则进入病态，多种骨疾患的发生多由此导致，并可能导致骨代谢的障碍[13]。例如赵星辰等[14]研究发现，低氧等因素可诱导机体产生低氧诱导因子α1，进而通过Osterix因子、表皮生长因子、骨形态发生蛋白、前列腺素2及其受体EP1影响成骨细胞的生成，进而影响骨代谢的平衡。故而，骨形成过程中重要的功能细胞――成骨细胞，它的状态和功能的重要性在骨形成的过程中凸显出来，而巴戟天具有较强的抑制成骨细胞凋亡并促进成骨细胞的增殖的作用。
细胞凋亡（apoptosis）为一种程序性细胞死亡（PCD），它是一种细胞自身的主动的、有序的一种死亡方式，多由内环境或外环境所激发而启动，其过程与精确的基因转录以及蛋白质合成密切相关。而构成组织的细胞发生凋亡过早或过迟的话，均将影响组织机能的运作。相关研究提示[15]，发生骨质疏松症与异常凋亡的成骨细胞关系密切。张莉莉等[16]研究显示，生长因子等细胞因子在骨髓局部微环境中对成骨细胞的生存时间的调节与维持内环境的稳定可能关系密切。细胞因子的改变可以由人体营养、内分泌、炎症、应力变化等原因引起，而骨吸收也可以由细胞因子对成骨细胞发生异常凋亡的诱导而导致，致使“耦联”细胞数量失调，最终导致骨质疏松。故而，对成骨细胞的凋亡的干预与调节骨代谢进而对骨质疏松的预防意义重大。
王和鸣等[17]通过实验证实，巴戟天及其水提物和醇提物可以对骨髓基质细胞分化为成骨细胞进行诱导，将巴戟天醇提物和水提物的含药血清在经典成骨诱导组（地塞米松、B-甘油磷酸钠、维生素C）中进行培养，对骨髓基质细胞分化为成骨细胞的过程具有较为明显的促进作用，其中巴戟天醇提取物的作用较水提取物为强。李楠等[18]研究显示，巴戟天多糖含药血清可以在一定程度上保护由反全式维酸钾（ATRA）所诱导的成骨细胞凋亡，而巴戟天水提物对此过程的保护作用则弱于巴戟天多糖。这说明巴戟天多糖是巴戟天抑制成骨细胞凋亡的主要成分之一。
正常机体组织中基本都存在有转化生长因子，而转化生长因子又富含于骨组织中，其中转化生长因子β含量最为丰富。而转化生长因子β与骨质疏松症的发生密切相关[15]。有研究证实，成骨细胞转化生长因子Cbfα1mRNA[19]和βmRNA[20]的表达可以由巴戟天多糖以及巴戟天水提取物显著地促进。同时，成骨细胞分泌ALP以及BGP也可由巴戟天促进；巴戟天可以促进转化生长因子β1的表达，进而促使成骨细胞大量分泌I型胶原，促进机体钙盐的沉积[21]。成骨细胞其数量增长并不依靠其本身分裂，而是完全由于其前身细胞的增殖、分化才得以增加，但是在试验中，体外培养的成骨细胞是可以进行分裂增殖的。李楠等[22]采用MMT法检测成骨细胞增殖和巴戟天多糖、巴戟天水提物的关系。结果发现巴戟天多糖对促进成骨细胞的增殖的作用明显优于巴戟天水提物，其二者均可明显促进体外培养成骨细胞的增殖。崔可赜等[23]研究发现巴戟天多糖不仅可明显促进成骨细胞的增殖分化能力，且可降低能够抑制骨形成的DKK-1蛋白的表达，进而防治骨质疏松的发生。故而可以认为巴戟天多糖具有有效促进成骨细胞增殖的作用。
3 巴戟天对破骨细胞活性的影响
破骨细胞（osteoclast， OC）的主要功能为骨吸收的负责，属于特殊类型的多核巨细胞，由骨髓造血系统中单核-巨噬细胞系发育而来。骨髓微环境中单核的破骨细胞前体细胞相互融合，形成多核细胞，进而分化为破骨细胞。破骨细胞性骨吸收一般通过以下两个途径来实现[24]：（1）分泌水解酶等来溶解吸收骨基质；（2）分泌酸性物质对骨中无机质进行降解。
郑素玉等[25-26]研究发现，巴戟天含药血清可以明显抑制RANK、CAII、NFAT2mRNA的表达，进而抑制破骨细胞的骨吸收功能。鲍蕾蕾等[27]的研究表明破骨细胞的形成、分化和骨细胞的破坏吸收可由巴戟天蒽醌类化合物显著抑制，但它并不会显著影响成骨细胞。但巴戟天多糖、蒽醌类成分在体内如何作用进而保证骨质不流失有待研究。吴岩斌等[28]将八类从巴戟天中分离出的蒽醌化合物分别对成骨细胞和破骨细胞进行作用，以研究巴戟天对骨质疏松的对抗作用中的活性成分。结果表明，它们所有八类均可对破骨细胞TRACP的活性进行抑制，进而影响骨吸收作用，其中香豆素莨菪亭对新生大鼠成骨细胞增殖以及成骨细胞ALP的活性具有明显的促进作用，并且对破骨细胞TRACP的活性具有明确的抑制作用；而1，3，8 -三羟基-2-甲氧基蒽醌、大黄素甲醚的抑制破骨细胞骨吸收作用则较其他化合物为强。说明巴戟天中巴戟天蒽醌可以对抗骨质疏松。
4 巴戟天中微量元素的研究
以往的研究表明，钙、磷等元素的代谢密切相关于骨质疏松症，而人体骨骼中还必需铁、锰、锌、铜、钼、铬、硒等各种微量元素。动物实验表明，骨质疏松的大鼠模型的骨组织中，磷、钙、镁等宏量元素降低可明确引发锰、锌、铁、铜等微量元素的降低，而骨质疏松症的发生也可能与这些微量元素的含量减少密切相关[29]。近年来研究显示[30]，人体内Cu含量的减少也可能和骨质疏松症的发生密切相关。将巴戟天及其水煎液中的22种微量元素Cu、Cr、Zn、Mn、Se、Co、Sn、Ni、Cd、As、Pb等的含量以电感耦合等离子体质谱法进行测定，其结果提示，巴戟天药材样品中人体所必需的元素Fe、Zn、Mn的含量较为丰富[31]。罗盛旭等[32]分析了巴戟天中微量元素的含量，结果显示，巴戟天中元素含量由多至少依次为Mn、Fe、Zn、Pb、Cu等。而许多酶系统中，Mn是其中重要的活化剂，而且它密切相关于骨骼的形成、造血系统的正常运转，可以促进生长发育，并且Mn与硫酸软膏素合成的酶系统关系密切，可以参与活化其酶系统，进而促进合成骨质。当人体内Mn的含量缺乏时，将增强破骨细胞的活性，而降低成骨细胞的活性，成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡遭到破坏，进而出现骨质疏松[33]。且有实验表明，去卵巢大鼠股骨中Mn、Zn、Mg、Ca、Fe、Cu、P的浓度可由巴戟天的作用而升高[34]。以上研究结果均进一步佐证了巴戟天对于骨生长的促进作用。
5 巴戟天与免疫相关的研究
骨骼免疫学（Osteoimmunology）作为相关领域中的一个交叉学科还是比较新出现的，界内对骨骼系统与免疫系统的相关性已经较为认可 [35]。杨宏健等[36]发现，刀豆蛋白A（ConA）对T淋巴细胞的增殖和巨噬细胞吞噬功能进行诱导，再将巴戟天对其进行作用，二者的结果提示它们均被较有效地促进和增强。赵辉等[37]发现，ConA活化的人体淋巴细胞的增殖可被巴戟天促进，而小鼠巨噬细胞产生TNF的水平也可被其提高；并且淋巴细胞的转化率、NK细胞的杀伤功能也可以被巴戟天所提高，而它还可能由刺激细胞因子进而增强免疫作用，巴戟天可刺激CB2效应器，进而释放NF-γ介质，而IL-4的释放也可被其抑制[38-40]。曾高峰等[41]研究显示，巴戟天多糖可能通过抑制肿瘤坏死因子以及白细胞介素1的表达以升高血清护骨素的表达水平，进而起到防治骨质疏松的作用。巴戟天对这些淋巴细胞以及细胞因子的作用可能也是巴戟天调节骨代谢、抗骨质疏松的作用机理之一。
6 总结
巴戟天作为我国传统补肾阳、强筋骨中药，在传统医学治疗骨伤科疾病中起到了不可替代的作用。巴戟天中有效成分，其中以巴戟天多糖和巴戟天蒽醌类化合物为代表，可促进骨髓基质细胞的增殖、促进成骨细胞增殖并抑制其凋亡、抑制破骨细胞骨的吸收作用，对调节骨代谢中成骨细胞及破骨细胞的平衡可起到良好的作用，可在防治骨质疏松症的方向上起到一定作用。并且巴戟天中含有多种骨代谢所必需的微量元素。而巴戟天对一些淋巴细胞及细胞因子具有正向作用，这些也可能为巴戟天与骨代谢调节的一个相关方面。但当前国内对此的研究相对较少，可加强相关的研究工作。而巴戟天对破骨细胞干预及相关交叉领域的研究虽已取得一定进展，但仍相对较不完善，应当进一步利用现代医药科技手段对其作用机制和现代药理进行进一步系统研究。并且成骨细胞及破骨细胞在机体内、外的生物学特性并不完全相同，故而在条件成熟时应加强巴戟天体内作用试验的研究，以便更好地为临床实验提供理论及技术支持。
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【摘要】
目的 研究脑心清及其黄酮成分对海马神经元细胞L型Ca2+通道活性的影响。 方法 采用全细胞记录式(wholecell model)的膜片钳技术记录海马神经细胞L型Ca2+通道电流变化。 结果 槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/mL浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流(ICa，L)峰值(P
【关键词】 L 型Ca2+通道 脑心清 黄酮 槲皮素 海马神经元 膜片钳技术
Abstract:Objective To investigate the effects of quercetin，FLDKP70 and Naoxingqing (NXQ) on Ltype calcium channel (LTCC) in the cultured pyramidal neurons isolated from hippocampus.Methods Calcium currents were recorded in wholecell patchclamp mode with quercetin，FLDKP70 and NXQ in the measurement medium.Results It was found that 5.0～25.0 μg/mL of quercetin，FLDKP70 and NXQ enhanced Ltype calcium channel current by 61.6%，55.3%，52.0% ，respectively in the cultured neurons. Significantly，the quercetin，FLDKP70 and NXQmediated increases of calcium currents saturated at the concentrations around 100 μg/mL in the cultured neurons.Conclusion These findings suggested that the Ltype calcium channel in cultured pyramidal neurons could be modulated by quercetin，FLDKP70 and NXQ，which might be beneficial to the intracellular calcium homeostasis in the insulted and damaged susceptible neurons under ischemia/reperfusion disorder.
Key words:Ltype Ca2+ channels; hipocamcal pyramidal neurons; Naoxinqing (NXQ);flavonoids;quercetin;patchclamp
在复杂的编码细胞内激活细胞凋亡的信号相互作用中，钙起着重要作用。通过内质网、线粒体和其他信号通路，Ca2+稳态改变与启动细胞凋亡性死亡密切相关[1，2]。Ca2+稳态的调节极其复杂，至今还未明了。近年来研究表明，在控制Ca2+稳态的过程中更精细的变化可能对决定细胞生死有深刻影响[3]。Ca2+稳态可能是凋亡的基本致病过程中的一个药理靶标。
L型Ca2+通道在海马锥体神经元基底树突和胞体都特别集中，其电流占细胞总钙电流的30%～50%。它们的开放和关闭能有效调节细胞浆内Ca2+的水平，而且有证据表明它们还能将钙信号直接传至细胞核[3，4]。L型Ca2+通道的激活可以直接调控一些对神经元存活及其功能所必需的重要基因的表达，如bcl2和脑源性神经营养因子等[5]。
脑心清(NXQ)及其有效成分柿叶黄酮(FLDK)都具有抗脑缺血损伤作用[6]，通过上调抗氧化基因bcl2的表达，改善神经细胞氧化还原状态，清除自由基、抗脂质过氧化等方面来发挥其抗缺氧缺血性神经损伤、抗氧化应激和抗兴奋性谷氨酸毒性神经损伤、抗急性脑缺血作用，抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，保护缺血再灌注引起损伤的脑组织，并能改善缺血再灌注引起损伤的脑组织神经功能[6，7]。本文研究脑心清及其黄酮成分对海马锥体神经元L型Ca2+通道活性的影响，以探讨在Ca2+稳态调节方面，脑心清及其黄酮成分抗脑缺血损伤神经保护作用的机制。
1 实验材料
1.1 受试药
脑心清片用干浸膏(以下简称脑心清、NXQ)，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。
脑心清黄酮(FLDK)，由脑心清经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量77.35%，其中槲皮素类含量34.625%，山柰酚类含量为42.50%(HPLC测定)，代号FLDKP70。用2% NaHCO3 溶液加热到80 ℃溶解成含药25 mg/mL的热溶液。
实验所用溶液的pH均用HCl 和NaOH溶液调至7.2～7.4，并用0.22 μm的滤膜过滤除去尘粒和细菌。室温保存，用时加PBS稀释至所需浓度即可。
1.2 药品与试剂
阿拉伯糖胞嘧啶、DNA酶Ⅰ、2巯基乙醇、MEM(modified eagle medium)合成培养基、DHanks 平衡盐干粉、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、L谷氨酰胺、多聚赖氨酸(MW70150KD)均为美国Hyclone公司产品。RNase A(Sigma):以1 mg/mL的水溶液，经100 ℃煮沸以灭活DNA酶活性后，分装冻存于-20 ℃备用。
1.3 大鼠
新生SD乳鼠，24 h龄，体质量约5.5～10 g，清洁级，合格证号：粤检证字第2003A053号，南方医科大学实验动物中心提供。
1.4 主要仪器
LEICA DMLFS倒置显微镜、MO203微电极操纵器(MO203，日本)、Axopatch 200B型膜片钳放大器(美国 Axon Instrument)。
2 实验方法
2.1 新生乳鼠海马神经元的原代培养[4]
无菌条件下，借助于解剖显微镜，取刚出生24 h内的SD乳鼠，分离海马组织，用0.25%胰蛋白酶和0.2%脱氧核糖核酸酶PBS溶液37 ℃孵育消化20 min，并不断摇动，用3倍体积的DMEM培养基分散和冲洗，消化的细胞经200目细胞筛过滤后，200×g离心5 min，用血球计数板计数细胞，0. 4%台盼蓝镜检存活率大于95%，以1.5 × 105个/mL的密度种植于涂有多聚赖氨酸(10 μg/mL)的24孔培养皿内，每孔0.4 mL，完全培养基为45% DMEM+45% F12+10%胎牛血清的混合液，内含青霉素(100 IU/mL)和链霉素100 μg/mL。正常糖培养液： 含5 mmol/L葡萄糖的完全培养基。在一定湿度的37 ℃恒温的培养箱(5%CO2)培养48 h，换培养基去除死细胞，加入终质量浓度为10 μg/mL的阿糖胞苷培养48 h，抑制非神经元细胞生长。然后隔48 h换半量新培养基，继续培养12 d，进行钙通道活性测定。
2.2 膜片钳技术测定海马神经细胞L型Ca2+通道电流[8]
2.2.1 L型钙通道全细胞钙电流记录的液体配制 细胞浴液(mmol/L)：Choline chloride 75; TEACl(氯化四乙铵，Tetraethyl ammonium TEA)50;BaCl2 5; CsCl 5;HEPES 10; MgCl2·6H2O 2;DGlucose 10;TTX(河豚毒素，Tetrodotoxin) 0.001。用TEACl调pH 至7.3。电极冲灌液(mmol/L)：CsMeth 145; TEACl 10; EGTA 10;MgCl2·6H2O 5;HEPES 10; CaCl2·2H2O 1;MgATP 5;Leupitin 0.1;用CsOH调pH 至7.3，过滤除菌，避光保存。
2.2.2 记录用玻璃微电极的制作 用无芯硬质玻璃毛细管坯(GG15，中科院上海生理所)在垂直微电极拉制仪(P97拉制器)上用两步法拉制。在其尖端涂布Ntrimethylsilydiethylamine，并进行热抛光。电极尖端直径约为1 μm，内灌电极液后，全细胞记录的电极冲灌电极液后入细胞浴液的电极电阻在2～5 MΩ为佳;内插泛极化氯化银与膜片钳放大器探头相连。
2.2.3 全细胞式膜片钳记录[10] 将载有海马神经元的载玻片从培养板中取出，在每次实验前均用记录浴槽内的溶液冲洗带有神经细胞的载玻片，以洗去细胞表面上的其他成分，然后置于含有培养液的膜片钳测定专用平台液槽中，加1 mL浴液，实验仅选用状态优良的锥体细胞(贴壁良好、有明显突起、细胞边界清昕、胞浆均匀一致)。
在显微镜下找到优良的单个神经元细胞，通过倒置显微镜和微电极操纵器监视，驱动微电极接近细胞。当微电极尖端刚刚接触到细胞时，稍加负压，使之与细胞膜形成高达10 GΩ以上的高阻密封即刻形成。
在贴附式基础上，实验中仅选用密封电阻大于5 GΩ的细胞。再施以负压吸破细胞膜，形成全细胞记录状态，根据需要对串联电阻和电容进行补偿，再进行记录即为全细胞记录[10]。用L型钙通道特异性阻断剂硝苯地平(Nifedipine)和开通剂Bay k 8644鉴定所记录的电流为L型钙通道电流。前置放大器的低通滤波设置 1 kHz。用 Axopatch 200B型膜片钳放大器，调用Pclamp软件的Clampex程序，由此发出去极化脉冲波，同步采集通道开放电流，一次采集50条曲线存入硬盘。记录时，钳制电压-40 mV施予150 ms，0 mV去极化脉冲，记录ICa，L。并给予-70～60 mV的系列去极化脉冲，去极化步距为10 mV，记录钙电流，以各电流幅值对相应电位作图得I-V相关曲线。
2.3 实验分组与药物处理
药物以高浓度溶解在电极液中，实验时加5～20 μL到神经细胞孵育液中，使达到所需浓度。分组：①正常对照：给予溶媒对照。②给药组: 脑心清、FLDKP70 、槲皮素、芦丁，剂量分别为5.0、10.0、20.0 μg/mL。
测定记录正常和给药条件下的海马神经细胞L型Ca2+通道活性的有关参数，记录在电脑软件上。实验在(25±1)℃温度下进行。
2.4 资料分析
全细胞记录的结果可用Clampfit软件直接分析。
2.5 统计学处理
数据以(±s)表示，采用非配对t检验，P
3 结 果
3.1 海马锥体神经细胞全细胞L型钙通道电流特性
正常海马锥体神经细胞L型钙通道多显短暂性开放，在记录时间里，无明显的通道时间依赖性失活;当钳制电压VP为-40 mV时，可见一定的内向电流。不同钳制电压下，有不同的电流值，能被Bay K 86444激活，并且被硝苯地平完全抑制。当VP=-10 mV时，L型钙通道电流ICa，L峰值，电流幅度平均值为(-192.7±46.2)pA，见图1、表1。
3.2 脑心清及其黄酮对海马神经元全细胞L型钙通道电流幅度的影响
脑心清及其黄酮FLDKP70 、槲皮素对海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流幅度的影响见表1、图1-3。表1 脑心清、柿叶黄酮和槲皮素对大鼠海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流的影响注:*VP=-10 mV时，药物处理各组ICa，L峰值(电流幅度平均值);与对照组比较:*P
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/mL浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流(ICa，L)峰值(P
对海马锥体神经元全细胞L型钙通道电流最大幅度增强作用的强度从大到小顺序为槲皮素>柿叶黄酮>脑心清。
4 讨 论
中枢神经系统神经元上存在L、N、P、Q、R、T等6种类型的电压依赖型钙通道，它们各自有不同的电生理学特征[3]。本实验由于细胞外液中的TTX选择性地阻断了钠通道，外液中的TEA和电极内液中的Cs+选择性地阻断了钾通道，所记录到内向电流为钙电流。其开放动力学特征与文献报道高电位激活电压门控性钙通道有相似的电学特征性[3]，是典型的L型钙通道。
近年来，传统的兴奋性毒性所致的Ca2+超载学说也受到挑战。虽然细胞凋亡时，大多数情况下，细胞内钙离子浓度是增高的，而且这可能是凋亡中的某些环节所必需[9]。但是，另一方面，通过多种途径提高细胞内钙离子浓度又可以减轻培养的神经元细胞的凋亡，如在培养基中加入低浓度的N甲基D门冬氨酸(NmethyDaspatrate，NMDA)[10]，激活电压门控的钙离子通道[1]等措施。
实验发现：在培养的交感神经元，抑制神经元凋亡的钙离子水平为180～240 nmol·L-1[17]，这比在许多细胞中引起细胞中毒的钙离子浓度水平(>5 μmol·L-1)[11]要低得多。年青的、生长因子依赖性很大的交感神经元，其细胞内钙离子浓度比对生长因子依赖性很小的年老交感神经元细胞内钙离子浓度要低。Johnson EM 等因此提出了一个神经细胞的存活和轴突的生长依赖于细胞内一个适宜的钙浓度的钙调定点学说[1]。认为细胞可能主要有3个不同的钙离子状态：(1)低钙离子状态，此时神经元有凋亡的危险，其存活对生长因子高度依赖;(2)中等浓度钙离子状态，适合细胞的生存，对生长因子的依赖性很小;(3)高钙离子状态，具有细胞毒性[11，13]。
据钙调定点学说，可以推测缺血后谷氨酸受体(glutamate receptor，GluR2 /GluRB) 表达下调引起钙离子内流，可能具有细胞保护作用;而且，近年来的研究也表明，短暂的前脑缺血3 d后，细胞内钙离子浓度没有增高，并且电压门控钙通道电流是降低的[14]。Koh JY 等报道，皮层神经元持续暴露于电压门控钙离子通道拮抗剂中，或者降低培养基中钙离子浓度都能引起细胞凋亡，这与钙调定点学说一致[15]。
NMDA本身也可以减少细胞凋亡，而NMDA受体拮抗剂类药物则能增加培养细胞和发育中的啮齿类神经细胞的凋亡。这些结果表明NMDA受体拮抗剂类药物对缺血性脑损伤的治疗可能具有双刃剑的效果：一方面可降低由于钙超载引起的兴奋性神经元的坏死; 另一方面则可加重其他细胞内的钙离子缺失而引起细胞凋亡[16]。
李晓明等发现对缺血特别敏感的海马CA1区锥体神经细胞L型钙通道活性在脑缺血再灌流早期呈瞬时升高(电流增大、开放概率和频率上升)，而在再灌流后期和晚期却持续性降低(电流减小、开放概率和频率下降)，即先激活后抑制，而对缺血不敏感的海马CA3区神经元则无此现象。此外，海马CA1区锥体神经细胞L型钙通道活性可被细胞外氧化还原状态所调节。细胞外处于高氧化的状态时，L型钙通道活性明显受抑制，细胞外处于高还原的状态时，L型钙通道活性受激活(电流增大)，这在脑缺血后期的CA1区锥体神经元上呈得更明显。抗氧剂在脑缺血后期的CA1区锥体神经元上能更显著地增大全细胞L型电压敏感钙通道电流。提示缺血后晚期L型电压敏感钙通道的抑制可能是由于通道被氧化所致，且这种抑制可能与自由基参与海马CA1区锥体神经元缺血性神经元迟发性死亡的机制之一[17]。
总之，虽然钙超载和钙缺失是两个相反的状态，但缺血后的不同时间和不同区域，两种情形都可出现，兴奋毒性的钙超载可能主要出现于缺血早期和缺血中心区，而钙缺失和细胞凋亡可能主要出现在缺血后期和缺血边缘区。不同时间和不同区域，不同的损伤程度细胞内的钙离子浓度水平不一样，其细胞命运也不一样。可见细胞内钙的水平与缺血性神经元损伤的关系相当复杂[1，11]。
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清均能增加海马锥体神经细胞L型钙通道的电流幅度，提示它们对海马锥体神经细胞L型钙通道有激活增强作用。作用强度柿叶黄酮大于脑心清，提示黄酮类是其增加L型钙通道电流的主要活性成分。
脑心清所含黄酮类和酚酸类成分是其抗脑缺血神经保护的重要活性成分。黄酮类成分和酚酸类成分是天然抗氧化剂，能改善细胞的氧化还原状态和促进细胞抗氧化基因表达[7]，将有助于维护L型电压依赖性钙通道的正常功能，这对缺血再灌注时缺血敏感神经元的存活有重要保护意义，可能是脑心清抗脑缺血损伤的药理机制之一。但脑心清及其黄酮成分对L型电压依赖性钙通道的作用是直接激活，还是通过改变细胞外氧化还原状态而激活，还有待进一步研究。
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1、细胞学说的建立：
（1）1665英国人虎克(RobertHooke)用自己设计与制造的显微镜（放大倍数为40-140倍)观察了软木的薄片，第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文cella（小室)这个词来对细胞命名。
（2）1680荷兰人列文虎克（A.vanLeeuwenhoek），首次观察到活细胞，观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等。
（3）19世纪30年代德国人施莱登（MatthiasJacobSchleiden）、施旺（TheodarSchwann）提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位。这一学说即“细胞学说（CellTheory)”，它揭示了生物体结构的统一性。
2、细胞：是生物体结构和功能的基本单位。除了病毒以外，所有生物都是由细胞构成的。细胞是地球上最基本的生命系统
生命系统的结构层次：细胞组织器官系统（植物没有系统）个体种群群落生态系统生物圈。
3、组成生物体的化学元素有20多种：
大量元素：C、 O、H、N、S、P、Ca、Mg、K等； 微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo； 基本元素：C。
主要元素；C、 O、H、N、S、P； 细胞含量最多4种元素：C、 O、H、N。
（来源：文章屋网 http://www.wzu.com）
但是，为了进一步在人体上直接使用外来的这种接近人体自然状态的硅烷醇，仍然需要我们对它进行严格的测试和评估，因此各种安全性体外和活体实验被付诸实施，接着临床评估被采用。所有实验结果都证明硅烷醇(包括它的一些衍生物)对于人类不存在安全问题。
硅烷醇在细胞外间质(ECM)中能够帮助重建被破坏的结缔组织，所以我们将它的一种衍生物MHA(商品名称是Hydroxyprolisilane CN，INCI中文名是甲基硅烷醇羟脯氨酸酯天冬氨酸酯)引入对抗妊娠纹的临床试验中，发现效果明显。
妊娠纹是一种在皮肤上颜色不佳的疤痕形式。它首先有疤痕般的红色，然后逐渐形成永久的珍珠白色。妊娠纹是快速生长(一般在青春期)或者体重迅速增加(例如怀孕)所造成的皮肤迅速牵拉的结果，这种牵拉克服了皮肤弹性，导致皮肤结构蛋白(例如：胶原蛋白、弹性蛋白)破裂，这个过程几乎是不可逆的。
1. 硅元素：在细胞外间质(ECM)组织和重建中的一个必要元素
1.1硅元素和硅烷醇
硅元素是非金属元素，自然界存在矿物结构和有机结构两种形式。有机结构形式可分为两大类：
1) 聚硅氧烷(polysiloxane)不溶解于水。它的特征在于化学惰性和热力学惰性，不具备生物学的活性。
2) 硅烷醇(silanol)的特点在于硅原子的数量小于等于2，溶于水，具有生物活性。
硅烷醇能够自发地形成不溶于水的聚硅氧烷或者硅树脂，但我们(EXSYMOL)能够通过稳定羟基的方法阻止聚合的发生。硅烷醇的衍生物只有在特定的条件下才能存在并稳定，浓度要低于或等于1%, pH值在4-6.5之间。
1.2 硅元素是高等动物结缔组织必须的矿质元素
硅元素存在于形成结缔组织的大分子中，例如弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白.
硅元素在蛋白多糖中非常丰富(400-500mg Si/1000g脱水组织)。蛋白多糖是结缔组织物质基础的必须成分，所以我们可以认为硅元素是皮肤学化妆品学值得研究的一个方向。
另外，在受到干扰或破坏的组织上，硅烷醇在表皮―真皮结合部的层面上，通过大量的信息素中介作用，能够诱导和调节成纤维细胞的增殖，有利于胶原纤维和弹性纤维的再生。所以，硅烷醇被强烈推荐用于妊娠纹治疗。
硅元素通过实验被证明主要存在于细胞外间质(extra-cellular matrix, ECM)中,是结缔组织中的糖胺聚糖和相关的蛋白质复合物构成整体所需要的成分之一。 所以硅元素在衰老中的作用可能和糖胺聚糖的变化有关。
硅元素含量在胚胎间叶细胞中是非常重要的，随着年龄增长会逐渐下降。随着组织中硅元素的减少，干扰、衰老和硬化现象也会出现，因为肠胃消化吸收能力随着年龄增大会逐步下降(见图1)。
2. MHA在角质细胞―成纤维细胞相互作用中的角色
表皮细胞的角色特别是角质细胞组织在分化方面、增殖方面和对成纤维细胞的影响方面知道的并不多。角质细胞产生大量的可溶性因子发挥多种活性，在这些产物中，只有IL-1(白介素-1)在调解真皮成纤维细胞活动上的功能是已知的：IL-1刺激成纤维细胞的增殖，促进I型和III型胶原蛋白mRNA的形成和纤维连接蛋白的形成，增加胶原蛋白酶的生成。如果角质细胞在物理或者化学破坏之后，IL-1的生成是非常微弱的，因此很难将表皮到达真皮的所有影响归结于这一种细胞因子上。
我们的研究主要针对角质细胞―成纤维细胞交互作用。目的是确定角质细胞产生的可溶性因子对于成纤维细胞的增殖影响。通过“插入系统”(Insert System, 图2)，角质细胞先和含有MHA的培养基接触，产生的分泌物随后被另一个“条件性培养基”(KCM)收集(培养6或者22小时)，MHA在角质细胞转换至“条件性培养基”(KCM)之前被除去，从而达到只获得角质细胞分泌物，而没有MHA存在其中的目的。这些角质细胞分泌物被放入培养成纤维细胞的培养基，这些成纤维细胞被培养2天之后，我们通过测量存活细胞数量，与空白对照做比较，从而得出成纤维细胞增殖的比率。
图2：分泌模型简图。1)角质细胞在“Insert”系统上层的多孔“Insert”皿(角质细胞不会漏到下层培养基中)内培养，我们在下层的培养基中加入不同数量的MHA。2)为了收集由角质细胞分泌的蛋白质，冲洗过的“Insert”皿被放置在不包含血清的环境中培养。3) 取出“Insert”皿，将成纤维细胞放入含有角质细胞分泌物的培养基中，48小时后检测其增殖的活动。
结果和分析
所有结果显示通常的角质细胞培养的分泌物对于成纤维细胞的生长有微量的刺激作用，而当分泌时间延长时(步骤2中22小时，KCM+MHA0%)这种刺激并没有提高。当角质细胞预培养基(步骤1)加入MHA时，这种刺激被显著加强了，实验结果根据MHA的浓度和分泌时间的增加而增加。最佳的情况为：步骤1加入10mg/l的硅元素含量的MHA，在步骤2中采取22小时的培养，这样能够提高成纤维细胞的增殖率至67%见(图3)。
在条件性培养基(KCM)中的硅烷醇含量已经通过吸收光谱测定，没有发现硅烷醇的踪迹。也就是说，这些条件性培养基(KCM)包含了更多的细胞因子(而不是MHA本身)，来刺激成纤维细胞增殖。这种更佳的刺激有利于生成更多的胶原蛋白，对于妊娠纹的治疗是非常必要的。
3. MHA在伤疤愈合中的组织学研究
妊娠纹是一种皮肤疤痕形式，如果在疤痕愈合过程中了解MHA的确切作用是非常有意义的。为了揭示这种作用，我们使用皮肤疤痕组织来评估弹性纤维、胶原纤维以及成纤维细胞的变化(例如：结缔组织的再生状况)。我们在动物(白鼠)身上进行了MHA对于皮肤疤痕愈合影响的组织学研究。结果发现在使用4%的MHA凝胶情况下，相比空白凝胶对照，疤痕愈合后的表皮和真皮组织形态有了明显的改善。使用MHA能够快速解决伤疤形成的皮层加厚问题，也没有真皮部分的不正常突起。相比空白对照的疤痕组织，我们能够观察到大量的但是精细的再生结缔组织，这说明结缔组织被有效重建。这些结果也符合在细胞实验中获得的结果，MHA在贫瘠培养基中能够刺激成纤维细胞增殖。这个实验说明，MHA对于像妊娠纹这样的疤痕组织也应该有积极的效果。
4. 有机硅衍生物MHA的安全性评估
在将MHA用于人体之前，安全性是我们考察的重点。没有产品安全性作为前提，我们是不会将其用于人体的。
4.1 细菌回复突变实验
这是一个关于遗传毒性的关键研究，目的是在实验室条件下评估MHA的潜在突变作用以及这一物质的代谢。针对在细菌回复突变试验中使用的7个菌株，在选定实验条件下，无论是否加入代谢激活剂，MHA都不会出现致突变的活性。
4.2 MHA对于皮肤刺激性、敏感行、光毒性和光过敏的临床研究
通过大规模人体样本的试验，在使用MHA的部位没有发现红斑、水肿、丘疹、水疱等不良反应。MHA没有诱导出任何皮肤刺激或者敏感症状，也不能引起光毒性或者光过敏。所以MHA允许用于皮肤局部。
5. MHA抗妊娠纹效果的临床试验
MHA(羟基脯氨酸酯硅烷醇)对预防妊娠纹具有显著作用。对照形态学和每位受试者的怀孕次数情况，结果是足够令人满意的。
5.1 试验方法
受试者第一次进行孕期产前检查的时候，大概从怀孕第三个月初起，在其腹部轻轻地涂抹含有6% MHA的乳液。这一治疗一直持续到分娩后一个月，也就是说皮肤组织恢复正常的时期。
5.2 试验结果说明
观察到的结果分类：
5.3 试验结果
1) 初产妇(第一胎)
结果如下 (图4)：
2) 经产妇试验结果如下(图5)：
5.4 试验结论
虽然我们的这一试验只有23个受试者，但我们可以通过记录下的多个正面结果得出在预防妊娠纹方面MHA具有不错的活性。可以指出的是，在15个身体形态正常的初产妇中，有13个没有观察到妊娠纹的出现。
6. 结论
硅元素是人体不可或缺的微量元素之一。它在人体内以生物活性硅的状态存在，是结缔组织中细胞外间质(ECM)的重要成分，与糖胺聚糖和相关蛋白质复合物构成了重要的维持皮肤正常状态的“骨架”结构。外源的硅烷醇(可溶性有机硅)模拟了体内天然硅元素的形态，能够帮助结缔组织的重建和修复，促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的生成。
硅烷醇 (例如MHA)已经被证明用于皮肤局部没有任何毒副作用，在任何人体试验中都没有不良反应的报道，这也间接证明了硅烷醇和皮肤组织的相似性和亲和性。
除了上面提到了MHA的抗妊娠纹临床研究，MHA的抗妊娠纹效果已经被不少使用者证明和认可。一些著名专家和公司一直在使用各种硅烷醇产品用于抗妊娠纹，间接证明了在所有有机硅衍生物中，硅元素的基团在抗妊娠方面起了主导作用，这也支持了在实验室中得到的结论。
关键词：周围神经内源性再生因子综述
【中图分类号】R-0【文献标识码】B【文章编号】1008-1879（2012）12-0057-02
周围神经损伤是目前发病率很高的疾病，对周围神经损伤和再生的研究是当今世界医学领域里科学研究的热点之一。周围神经损伤后伤残症状严重，痊愈的可能性较小，直接影响着患者的生活质量，所以，近几十年来，周围神经损伤后再生的修复研究非常活跃，其中相当一部分研究以影响周围神经再生因素为研究对象。
以往研究证明：周围神经在受到挫伤或发生断裂后，可出现明显再生现象。它的再生主要依靠轴突向靶器官的延伸，Schwann细胞的分裂、增殖和髓鞘的形成等来完成的。而影响周围神经再生的因素很多，其中内源性再生促进因子起着主要作用，目前已研究的内源性再生促进因子有：
1神经营养因子（NGFs）
神经营养因子（NGFs）在周围神经细胞的维护和存活中的作用已成为许多研究的主题。NGFs是一类来源不同但具有相似作用的蛋白类生物大分子，它们的作用是维护神经元的生存并促进其生长发育。NGFs主要存在于神经支配的外周靶器官及其它被神经支配的结构，例如肌肉、感觉效应器以及远侧的神经干，这些结构中的营养因子由神经终未摄取，通过轴浆逆行运输到达神经细胞胞体，从而发挥其支持和营养作用。
Manthrope等发现神经组织产生的NGFs与周围神经局部损伤性反应有关。近年来，学者们在对NGFs作用机制的研究上，进一步发现NGFs的效应由其受体介导，首先NGFs与效应细胞上的膜受体结合，形成复合体，再沿轴浆逆行转运，经轴突至细胞核，引起一系列生物学效应。具体而言NGFs被认为通过两种受体起作用：神经生长因子低亲合力受体（LNGFR，P75）和神经生长因子高亲合力受体（TrKA），TrkA是神经生长因子的功能性受体，传递信号，促进神经再生已被人们所确认，但P75的功能仍然不清楚。Rabizade等认为P75诱导神经细胞死亡。在此基础上尹方明等的动物实验证实，P75在坐骨神经损伤一侧的脊髓前角运动神经元胞体、脊神经节感觉神经元胞体和坐骨神经均有表达，而在未损伤的周围神经系统则无表达。从而进一步推测NGFs促进周围神经损伤修复机理是NGFs与P75的结合，而阻断P75诱导神经元死亡活性，从而阻止神经元的死亡，促进损伤神经传导[1]。
李强等通过应用新型的神经再生小室模型观察到NGF在周围神经再生过程中具有较为明显的血管形成作用[2]。
2微管相关蛋白（MAPs）
微管相关蛋白1B（MAP1B）是微管间“桥”的主要成份，参与微管蛋白聚合成微管的过程，并使微管稳定聚合成束，从胞体延伸到轴突末端，而且对Schwann细胞在轴突再生时形态的改变起一定的支持作用即促进轴突的再髓鞘化等。
2.1调节轴突生长锥的生长方向。在轴突生长时，轴突生长锥通过接受周围环境的各种信号来不断调整其生长方向，以使轴突能够准确长入靶组织。近来研究发现MAP1B与轴突生长锥的生长方向的调节有关，而体内又存在MAP1B和P2MAP1B两种形式，人们发现这两种形式通过相互转化来调节轴突的生长，MAP1B使微管的聚合稳定，P2MAP1B则相反。Meixner等发现一种MAP1B基因的无效等位基因的纯合子小鼠的大脑存在严重的发育缺陷，其中发现皮质神经元的轴突生长方向被误导，而杂合子则不出现明显异常。Mack等也发现P2MAP1B和细胞骨架联系紧密，大量集中于小鸡视网膜神经节细胞的轴突末梢及生长锥，生长锥在非允许基质边缘转向时，P2MAP1B被限制在稳定区，当P2MAP1B被灭活后，生长锥的移动、生长方向及形态都发生了改变。
2.2MAP1B促进轴突延长和再髓鞘化。MAPlB诱导神经微管集束重组，从而调节微管的动力学状态而影响轴突的发育。研究证实脑外伤、癫痈、缺血性脑血管病的神经再生均伴随有MAP1B的上调表达。Meixner等观察到MAPlB基因缺陷小鼠周围神经有髓纤维数量明显减少，而且髓鞘变薄。Ma等发现在坐骨神经离断到重新缝合的这段时间内，背根神经细胞MAP1B表达水平轻度降低，而在坐骨神经损伤远端MAP1B表达水平在3d-14d内迅速升高，但主要分布于Schwann细胞及髓鞘，当再生轴突长人损伤远端后，MAP1B在这些轴突中大量表达。MAP1B-1P在轴突远端和生长圆锥达到峰浓度，促使轴突生长圆锥微管系统在轴突生长时进行延伸、旋转、调节生长方向。MAPIB-1P仅存在于轴突出芽的早期阶段，最终稳定于轴突远端直至轴突发育生长完全，因而可视为轴突生长的标志物。而MAP1B-2P受酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，随着神经元发育成熟而逐渐增加，并在成熟神经元内保持一定水平。MAP1B-2P在背根神经节细胞和脊髓运动神经元中亦有高表达，也存在于Schwann细胞及少突胶质细胞，在再生轴突中大幅减少，仅少量存在于近胞体的树突、轴突基底部，提示MAPlB通过诱导Schwan细胞来影响轴突的再生和髓鞘化。
2.3雪旺氏细胞（SCs）。SCs是周围神经系统（PNS）的胶质细胞，包绕PN轴突形成或不形成髓鞘。SCs可通过以下几种途径促进周围神经再生[3]：①激活免疫反应，有利于再生。在神经系统损伤中免疫反应通常成为阻断再生和造成继发性损伤的破坏性机制。然而最近研究显示巨噬细胞激活有利于神经再生。预损伤的神经组织片在体外培养中促进神经再生，而未损伤的神经组织片不能维持体外培养背根神经节细胞（DRG）的生长，如用巨噬细胞条件培养基预处理未损伤的神经组织片，则可发生再生，这进一步说明巨噬细胞的激活提供了有利再生的条件。研究发现，损伤后可分泌巨噬细胞游走抑制因子（MIF）[4]，它是神经系统中重要的炎症及免疫反应调节因子，可激活巨噬细胞调节炎性反应，巨噬细胞在损伤处大量聚集并被激活，吞噬清除坏死崩解物，提供了再生的空间。而激活的巨噬细胞又能刺激雪旺细胞增殖和分泌神经生长因子，因此，巨噬细胞与在再生过程中可相互影响。②增殖迁移，先行引导促进轴突再生 神经断裂后24小时，开始分裂，增殖，清除变性碎屑，变性产生的髓鞘降解物和巨噬细胞及其分泌物可以促进变性初期的雪旺细胞的迁移和增殖，而神经修复再生阶段的轴突可以调节变性后期雪旺细胞的增殖在原来的神经内膜管内形成多数纵行排列的柱状细胞突，称Bungner带，为再生轴突芽提供向远端生长的通道。损伤轴突近侧端生成芽胚，枝芽沿Bungner带以每天大约1mm的速度生长，到达靶器官并形成新的突触。③分泌神经营养因子 SCs可分泌等物质以支持神经元胞体的存活，减少伤豁和变性死亡，还可以促进再生纤维的生长，有益于神经功能的恢复并促进再生。目前已发现雪旺氏细胞可分泌10多种营养因子，如神经营养因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF），睫状神经营养因子（CNTF），成纤维细胞生长因子（FGF）等。④分泌细胞外基质分子促进轴突延长 周围神经损伤后SCs分泌细胞外基质（ECM）和细胞黏附分子（CAM）等，能包饶轴突形成基底膜，提供轴突再生通道，引导轴突生长。⑤趋化作用：周围神经在损伤后由近端向远端延伸至终末靶组织，是由在远端产生特有的趋化物质诱导所致。许多资料表明，轴突的再生主要依赖于远端上存留的SCs，这是由于SCs分泌的相关分子和营养子对轴突的诱导作用[5]。
2.4巨噬细胞。巨噬细胞对周围神经再生的影响可从两个方面考虑[6]：①是巨噬细胞的清扫作用；②是巨噬细胞分泌活性物质直接或通过雪旺细胞间接影响神经再生。研究发现巨噬细胞能分泌多种物质，这些物质有的能刺激雪旺细胞分裂；有的能促进神经再生。正常周围神经几乎不含神经生长因子和其受体，但神经切断和挤压伤后，这两种分子和各自的mRNA在损伤神经的远端大量增加。神经生长因子的增加很可能是巨噬细胞分泌的IL-1的作用。此外活化的巨噬细胞能合成并分泌肿瘤坏死因子，这一因子在体外能促进毛细血管内皮细胞的分裂增殖。为周围神经提供良好的血液循环。
2.5胰岛素样生长因子（IGFs）。胰岛素样生长因子（IGFs）是一类既具有促进细胞增殖和分化，又具有胰岛素样作用的多肽，在细胞的增殖、分化、物质代谢与个体的生长发育和创伤愈合中具有重要的促进作用。同时胰岛素样生长因子（IGFs）是一类多功能的神经营养因子，由2个多肽类生长因子IGF-1＼IGF-2构成，与IGFs受体结合后通过PI-3K和MAPK信号转导通路发挥其生物学作用。具有促进施旺细胞（SCs）增殖和存活，抑制SCs凋亡；促进神经损伤后轴突再生和髓鞘化，参与神经元的保护和伤后突触的重建及抑制失神经肌肉萎缩等作用。
2.6甲状腺激素（TH）。甲状腺激素（TH）的主要作用是促进机体物质与能量代谢、生长和发育，范围十分广泛机制复杂，对周围神经的发育和再生，也起着重要的作用[7]，主要作用如下：①对基因的作用：在周围神经系统，外源性甲状腺激素可以增加受损神经元合成蛋白质的数量，促进轴突的再生。②对神经元和轴突的作用：新生大鼠甲状腺素的缺乏将会导致髓化神经纤维的减少，坐骨神经内轴突直径的增长速度减慢，影响非髓鞘化轴突和他们所关联的雪旺细胞的发育，Reier认为甲状腺素在轴突和雪旺细胞建立关联的时期具有关键作用。
2.7黄体酮。黄体酮是类固醇激素的一种，近年来的研究发现黄体酮在周围神经系统的生长发育及周围神经损伤后的修复过程中起着重要作用，是周围神经系统中一种重要的信号传导分子，它可以通过某些机制促进髓鞘再生和轴突再生，尤其是对于伴有神经病变的老年人及先天性黄体功能不全患者，应考虑其体内的黄体酮水平，这对于指导治疗具有实际意义[8]。
综上所述，有很多因素影响周围神经再生，尽管国内外学者对此做了大量的研究，但使周围神经恢复完全达理想要求还需很长时间。
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【摘要】 目的 研究钨酸锂对人淀粉样前体蛋白及早老素1（M146L）细胞分泌β淀粉样蛋白（Aβ142）的影响及其对体外培养新生小鼠大脑皮层神经元的保护作用。方法 ①体外培养转染AD相关基因、可分泌Aβ142的M146L细胞，在培养液中加入低、中、高剂量（3.1、5、8 mmol/L）钨酸锂或阳性对照药，通过对M146L细胞活性及培养基中Aβ142含量的测定，研究钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响。②体外无血清培养新生小鼠大脑皮层神经元，采用NSE免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定；观察神经元突起生长状况，分析研究钨酸锂对大脑皮层神经元的神经保护作用。结果 ①低、中、高剂量钨酸锂对M146L均无细胞毒性；②低、中、高剂量钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ142；③原代培养的新生小鼠大脑皮层神经元，经NSE免疫细胞化学染色被染成棕褐色的细胞占绝大多数，表明所培养细胞基本为神经元；④除低浓度（0.008 mmol/L）外，终浓度分别为0.2，0.04 mmol/L的钨酸锂均能明显使突起数目和长度增加，可促进神经元的存活。结论 适量的钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ142；对新生小鼠大脑皮层神经元具有神经保护作用。
【关键词】 钨酸锂；阿尔茨海默病；M146L细胞；β淀粉样蛋白；神经保护作用
【Abstract】 Objective To explore the effects of lithium tungstate (LT) on the secretion of amyloid betaprotein 142（Aβ142）of M146L and the neuropretection on neurons from cerebral cortex of newborn mouse in vitro. Methods ① M146L cells were culture by low， middle and high dose of LT or positive control drug and the cell activity and the content of Aβ142 were detected. ② The neurons from cerebral cortex of newborn mouse were cultured in B27supplemented neurobasal， a new serumfree medium combination， and identified by NSE staining; MTT assay was carried out to investigate the effect of the LT on development of neurons. Results ①Different concentrations of LT had no influence on the survival of M146L cells；② Different concentrations of LT could inhibit the secretion of Aβ142 by M146L cells；③Most of the neurons were stained to be positive with NSE， which suggested them being neurons; ④The results showed that LT (0.04 mmol/L， or 0.2 mmol/L) could increase the number and the length of neurites as well as the number of survival neurons. Conclusions Adequate LT could inhibit the secretion of Aβ142 by M146L cells and has a neuroprotective effect on the neurons from cerebral cortex of newborn mouse.
【Key words】 Lithium tungstate; Alzheimer′s disease; Amyloid betaprotein; M146L cells; Neuroprotective effect
β淀粉样蛋白（Aβ142）生成抑制剂是目前阿尔茨海默病（AD）药物研发的重要方向，这类药物大多仍处于实验研究阶段，个别进入临床研究。近年研究表明，氯化锂具有神经保护作用，可拮抗多种因素诱导的神经元凋亡，在一定程度上促进神经元发生〔1〕。Phiel等研究发现氯化锂可通过抑制GSK3α而减少Aβ分泌〔2〕。同时，有研究发现钨酸钠亦是一种GSK3抑制剂〔3〕，并且与氯化锂合用具有协同作用〔4〕。因此，作者设想将氯化锂和钨酸钠经化学方法合成钨酸锂，其作用可能更优。本实验通过钨酸锂与前几种试剂对神经元作用的对比来验证这一假说，并探寻一种更佳的Aβ142生成抑制剂。钨酸锂为本实验室首次合成，也是国内外首次探讨钨酸锂对Aβ表达的影响，具有自主知识产权（专利号：ZL200710027721.1）。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 昆明种小鼠（广东省实验动物实验中心提供，合格证号：2003A003）
1.1.2 试剂 M146L细胞株（美国哈佛大学医学院张冀民博士惠赠），钨酸锂（暨南大学脑科学研究所神经药理研究室提供，批号：061230），氯化锂（天津市科密欧化学试剂公司，批号：00060529），钨酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20060419），DMEM细胞培养基（美国Gibco公司，货号：12100046），人类Aβ142 ELISA试剂盒（日本WAKO公司，批号：4008），重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF，R﹠D，批号:AU824031），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器 680型全自动酶标仪（美国Biorad公司），3K18型低温高速离心机（美国Sigma公司），细胞培养板（美国Corning公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 钨酸锂对M146L细胞活性及其分泌Aβ的影响 M146L细胞培养，复苏M146L细胞株，用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养。该培养液含G418（200 μg/ml）、嘌罗霉素（puromycin，25 μg/ml）两种抗真核细胞抗生素，进行抗性筛选。37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养，每2 d换液传代培养，取指数生长期的细胞进行实验。(1)细胞活性测定。①取对数生长期的M146L细胞，用培养液调为单细胞悬液，浓度为2.5×105个/ml。96孔圆底细胞培养板每孔加入200 μl以上悬液，培养8 h后，弃液冲洗后，取DMEM培养液195 μl及低、中、高钨酸锂各5 μl，使终浓度分别为3.1、5、8 mmol/L。另设空白对照组、氯化锂组、钨酸钠组、氯化锂+钨酸钠混合组，各加相应药液5 μl，后三组终浓度分别为20、5、（5+5）mmol/L，各剂量组重复8孔。②培养24 h后，吸出培养液，各孔加新鲜DMEM培养液Ⅱ 180 μl及5 mg/ml MTT 20 μl。继续培养4 h后弃上清，加150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min至晶体完全溶解，置酶标仪上，490 nm波长下测定各孔吸光度（OD值）。(2)Aβ142含量测定(酶联免疫吸附测定法)。标准蛋白配制浓度依次为（单位pmol/ml）：100，50， 25，10，2.5，1，0；①与细胞活性测定①相同；②继续培养24 h后，每孔取100 μl培养液。试剂空白对照组加入缓冲液100 μl，空白样本对照组、加药组和标准品组中各加入100 μl相应试剂；③4℃孵育过夜，缓冲液冲洗彻底弃去，空白样本对照组、加药组和标准品各孔中均加入标记抗体100 μl；4℃孵育1 h，重复冲洗5次，加入染料，室温下避光放置30 min；④每孔加100 μl终止液混匀，液体变黄。用450 nm波长检测。
图1 体外培养大脑皮层神经元的鉴定(NSE，×250)（略）
1.2.2 钨酸锂的神经保护作用 (1)新生小鼠大脑皮层神经元无血清培养及鉴别:取新生昆明种小鼠（＜24 h）大脑皮层组织，用神经元培养液制成单细胞悬液，接种于预先涂布0.012 5％L多聚赖氨酸的24孔培养板上，每孔接种12～13万个细胞，接种培养4 h开始实验。采用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定，染成棕褐色即为神经元（图1）。(2)钨酸锂对小鼠皮层神经元突起长度和突起数量的影响：①用24孔板培养新生小鼠大脑皮层神经元4 h。②吸出培养液，每孔加入含1％B27的NeurobasalTM培养基390 μl，实验分为8组：空白对照组（加入10 μl PBS溶液）；阳性药对照组：重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）组（加入rhbFGF，终浓度为20 ng/ml）；氯化锂组（加入氯化锂，其终浓度为1.0 mmol/L）、钨酸钠组（其终浓度为0.3 mmol/L）、氯化锂+钨酸钠组（终浓度分别为：0.1 mmol/L+0.1 mmol/L）；钨酸锂低（0.008 mmol/L）、中（0.04 mmol/L）、高（0.2 mmol/L）三个组；各组终体积均为400 μl。③继续培养48 h，在倒置显微镜（×250）下观察其生长情况，以胞体呈明显光晕、长出突起的神经元为记录对象，每孔随机取5个视野，每组3个复孔，用目镜测微尺随机在每个视野测量15个神经元突起的长度和突起的数目，取均值进行比较，实验至少重复3次。
1.3 统计学处理 数据均以x±s表示，使用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 钨酸锂对M146L细胞毒性测定 实验浓度下，各组OD值分别为：空白对照组0.891±0.038；氯化锂组0.882±0.028；钨酸钠组0.880±0.038；钨酸钠＋氯化锂0.867±0.041；低、中、高浓度钨酸锂组分别为：0.974±0.039、0.861±0.029和0.886±0.034。与空白对照组相比较，低、中、高浓度钨酸锂组和其他各阳性对照组间均无显著性差异（P＞0.05），即各组对M146L细胞活性均无明显影响，不具有细胞毒性作用。
2.2 钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响 见表1。氯化锂、钨酸钠、氯化锂+钨酸钠和钨酸锂组对Aβ142分泌均有抑制作用。钨酸锂抑制Aβ142分泌呈一定的量效关系。
表1 钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响（略）
与空白对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01；下表同
表2 钨酸锂对培养48 h大脑皮层神经元的影响（略）
2.3 钨酸锂对小鼠皮层神经元突起长度和突起数量的影响 如表2所示，rhbFGF组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加；氯化锂和钨酸钠组与空白对照组相比突起数目无显著性差异，但氯化锂组与空白对照组相比突起长度有显著性增加；氯化锂＋钨酸钠组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加。低浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均无显著性差异；中浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目无显著性差异，突起长度有显著性增加；而高浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加；但高浓度钨酸锂的作用尚不及rhbFGF，但优于除rhbFGF组外的其他各组。新生小鼠大脑皮层神经元经钨酸锂处理48 h后，低浓度钨酸锂组和空白对照组相似，细胞生长较差，以单极、双极神经元为主，突起短，形成密集交叉网络的较少；中浓度钨酸锂组，伸出突起的细胞明显多于空白对照组和低浓度钨酸锂组，且出现三级和多级神经元；高浓度钨酸锂组，存活的神经元较多，以三级和多级神经元为主，突起较长，生长速度较快，进而局部形成网络。见图2。
图2 倒置显微镜（×250）下观察各组小鼠培养48 h的大脑皮层神经元生长情况（略）
3 讨论
目前认为Aβ在AD病理机制中扮演着非常重要的角色。因此阻止Aβ的合成和沉积，促进其代谢的药物在AD治疗中具有很大的潜力〔5〕。Aβ抑制剂有抑制Aβ生成和抑制Aβ聚集两大类〔6〕。细胞凋亡的异常也是AD脑的主要表现，同时，也是引起神经元丢失的主要原因〔7〕。
本实验所采用细胞株M146L是同时转染了人类AD两个相关基因（APP和突变型PS1）的CHO细胞，它能过度产生Aβ142，是一较理想的探讨Aβ表达机制的细胞模型。
锂为人体非必需微量元素，具有广泛调节生理功能的作用，涉及神经精神、免疫、内分泌、血液等系统〔8〕。研究发现，锂盐可抑制tau蛋白磷酸化﹑稳定微管系统﹑稳定βcatenin以及抗细胞凋亡〔9〕，并可促进体外培养的神经祖细胞的增殖，拮抗谷氨酸盐、糖皮质激素等的抑制增殖作用。另有实验发现，氯化锂可明显促进成年小鼠海马齿状回的细胞增殖与神经元发生，而且新生的神经元与神经胶质细胞比例基本不变。这一结果说明，氯化锂的作用是多方面的，它不仅能增加新生神经元，而且还能促进神经胶质细胞的发生。研究发现，钨酸钠与氯化锂一样，都是GSK3抑制剂，并且和氯化锂合用具有协同作用。同时也有报道，钨酸钠具有低毒性的特点〔3，4〕。
本实验室合成的钨酸锂结合了锂盐和钨酸钠各自优势。本研究结果也表明，钨酸锂在试验浓度范围内，与其他阳性药物组作用类似，对M146L细胞无毒性，并对M146L细胞分泌Aβ142有抑制作用。同时，可促进新生小鼠大脑皮层神经元突起数目、突起长度及存活细胞数目增加，减少神经元死亡。因此，钨酸锂有望成为神经退行性疾病如AD的治疗药物。
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目前，电针对脑缺血模型大鼠海马细胞影响的研究报道很多，对海马与学习记忆关系的研究已成为国内研究的重点。本文就电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作简要综述。
【关键词】 电针 海马 物质
海马的生理功能目前仍在探讨之中.大量的动物模型研究表明，海马与学习记忆有关。当脑缺血等致海马受损时，可引起学习记忆功能的严重障碍。电针刺特定穴位可影响脑功能障碍大鼠海马物质的表达。现就目前电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作一综述。
1 电针对海马细胞凋亡相关蛋白表达的影响
1.1 Bcl2是功能最为明确的细胞凋亡拮抗基因 Bcl2蛋白基本生物学功能为延长细胞的生命期限、增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性。Bax与Bcl2作用相反，能够促进凋亡，Bcl2表达水平较高时，形成Bcl2／Bcl2同源二聚体，抑制细胞凋亡；Bax表达水平较高时，形成Bax／Bax同源二聚体，加速细胞凋亡；Bcl2和Bax水平相当时，则形成Bcl2／Bax异源二聚体，终止细胞凋亡。近年的研究提示Bcl2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与Bax／Bcl2比率有关，当比率增大时，细胞趋于凋亡［1］。caspase3激活是触发凋亡的关键(有“分子开关”之称)，是凋亡的最终执行蛋白。Bc12家族基因在调节线粒体通透性上发挥重要作用，Bcl2或其他抗凋亡Bcl2家族成员下调，或促凋亡Bcl2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位，均导致线粒体通透性增加，使细胞色素C从线粒体释放入胞浆，与Apaf1、dADP形成复合体，再与胞浆中的caspase9前体形成凋亡小体，导致caspase9被裂解激活，随后再裂解caspase家族其他成员包括caspase3，引发凋亡。赵建新等［2］报告电针刺激脑缺血小鼠“肾俞”“膈腧”“百会”，各观察时点均可上调小鼠海马细胞Bc12表达，下调Bax表达，降低凋亡率。故电针可起到抑制凋亡、保护神经元的作用电针可显著上调内源性海马Bc12表达，降低Bax表达，有可能进一步抑制caspase3的激活，或影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用，有待今后动物实验验证。Noxa为BH3only亚家族成员［3］，脑缺血研究发现，Noxa在脑缺血引起的细胞凋亡中起重要作用［4］。朱燕珍等［5］报告，电针刺激血管性痴呆模型大鼠“大椎”“百会”，海马CA1区的Noxa阳性细胞数增加，Caspase3阳性细胞数增加，提示Noxa调节的线粒体凋亡途径促进血管性痴呆的发展；电针治疗抑制Noxa和Caspase3的表达．推测电针治疗抑制Noxa调节的Bcl2蛋白家族成员对线粒体膜的通透性改变作用，减少细胞色素C的释放，抑制Caspase的激活，从而改善海马CA1锥体细胞凋亡。李敏等［6］也得出同样结论，同时证实电针还可降低HO1蛋白的表达。HO与神经变性病有密切的关系， 目前已发现HO有两种同工酶：诱导型HOl和固生型HO2［7］。在缺氧缺血情况下，脑内HO2的表达并不被诱导增加，而只有HOl的表达增高。简而言之，HO1增多所导致的后果就是CO的产生增多。当大脑发生VD，严重缺血缺氧，诱导HOlmRNA表达增强，促进细胞坏死和凋亡，而电针能减少VD模型大鼠皮质和海马神经元细胞HOlmRNA表达，从而减少内源性CO的产生，减少神经细胞凋亡和坏死。
1.2 p53是一种肿瘤抑制因子，在调节细胞凋亡中起着重要的作用 DNA损伤、癌基因的激活等能激活p53。p53在VD大鼠发病机制中起重要作用，其机制可能主要有以下2个方面［8］：p53通过转录激活多种促凋亡基因，而导致细胞凋亡；p53直接激活线粒体凋亡途径而导致细胞凋亡。朱燕珍［9］电针血管性痴呆大鼠“百会”“大椎”证明电针治疗对神经元的保护作用。同时也证明了p53的表达在缺血导致血管性痴呆发病机制中促凋亡的作用。由于缺血引起血管性痴呆存在复杂的病理机制。 电针治疗如何作用于p53蛋白目前还不清楚，且p53对细胞凋亡的调节作用是复杂的、多层次的，并受多种因素影响。
1.3 cfos基因是即刻早期基因(immediate early genges，IEGs)家族的一员 参与细胞的生长、分化等一系列病理生理过程，起到第三信使的作用，并参与信号传递系统中各效应酶的转录过程，调控其他有多种基因表达的靶蛋白的合成。脑缺血后cfos和cjun相结合形成的二聚体可特异性地结合到DNA的AP1(转录激活蛋白1)位点上，使AP-1活性增加，诱导其它基因(迟发性基因)表达增加并参与对神经元凋亡的调控。Cfos表达后通过影响神经生长因子、过氧化物歧化酶等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用。赵建新等［10］电针刺激脑缺血VD小鼠鼠“肾俞”“膈腧”“百会”在各观察时点均可上调小鼠海马细胞cfos的表达，降低凋亡率，且疗效较喜得镇为优。对照药喜得镇(甲磺酸双氢麦角毒碱)是一种经典的促智能药，有研究表明，它可通过促进VD小鼠海马钙调素激酶mRNA、CHATmRNA及NMDA受体2B的表达，改善海马神经元代谢，改善智能［11～13］ 。故电针可起到抑制凋亡，保护神经元的作用，从而改善小鼠的学习记忆。推测电针通过上调VD小鼠海马细胞cfos的表达，有可能进一步影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、钙调素激酶Ⅱ、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用。
1.4 δ连环素是近年发现的突触后膜的一种重要蛋白质［14］ 海马神经元具有发达的树突，树突棘是神经元老化最早发生的部位，树突棘的数目和形态及其稳定性与δ连环素有关。研究发现δ连环素过度表达能诱导细胞形成树突状分支突起，并增加原代海马细胞中树突的形成，δ连环素基因敲除小鼠表现出严重的学习障碍［15］。因此，δ连环素对神经元形态与功能具有重要的影响。δ连环素属于神经细胞内的一种构架蛋白，它可以促进神经细胞的突起生长，维持神经细胞的突起和树突棘的数量平衡，还可以使神经细胞之间的细胞连接稳定。当神经细胞受到损伤时，δ 连环素表达出现下调，可能使其上述功能不能保持正常，从而导致神经功能的紊乱。钱长晖等［16］发现在脑缺血大鼠海马神经元δ连环素的表达下调，但电针“百会”“水沟”治疗后，大鼠海马神经元δ连环素的表达呈现上升，这一结果提示， 电针可能影响δ连环素的表达。一般认为，δ连环素主要在神经细胞表达，是神经细胞形态分化的重要蛋白质，它可促进神经细胞往终末方向发育和分化，并对神经元具有保护作用［17］。另有文献报道，用针刺对脑缺血损伤具有一定的保护作用［18］，它可使神经元中的某些抗凋亡因子的表达上调，从而对神经细胞产生保护作用。但是这种保护作用的具体机制是什么， 目前尚不清楚。
2 对海马血管舒缩物质的影响
脑循环的神经调节主要是通过对脑血管舒缩功能的调节实现的。NPY（神经肽Y）是脑内含量最高的，发挥神经递质和血管调节活性作用的多肽［19］，具有强烈收缩脑血管和降低脑血流的效应。主要分布在大脑皮质，丘脑和脑干，尤以海马浓度最高。向大鼠颈内动脉注射NPY可使脑血流下降40%～98%［20］。临床发现脑出血患者血浆NPY浓度显著升高，且随病情好转而降低［21］。CGRP（降钙素基因相关肽）是一种较强舒血管的物质，其作用强度比乙酰胆碱大1000倍以上。在人和大鼠的神经系统中，CGRP在脊髓的含量最高而在小脑，大脑皮层和海马呈低密度分布［22］。杜艳军等［23］报告电针刺激脑缺血大鼠“水沟”能增加脑血流量，能调节脑出血大鼠海马区CGRP，NPY能神经的拮抗作用，即抑制NPY过度表达，降低NPY的缩血管功能，同时促进CGRP的表达，增强CGRP的扩血管功能，平衡两者对血管的舒缩调控作用。
3 电针对海马细胞因子的影响
细胞因子的分泌不仅见于免疫细胞，在中枢神经系统中也有分泌，有人提出中枢神经系统内的细胞因子是“神经调质”的概念［24］。以IL1β 和TNFα为代表的炎性细胞因子参与许多神经病理过程，包括脑缺血引起急性神经变性、老年性痴呆(AD)等的慢性神经变性。无论是炎性细胞因子过度表达，还是其诱发的其它活性物质的过度表达，都将使反应向不利于机体的方向发展。这些炎性细胞在健康成人脑内含量很低，只有在伴发炎症及免疫反应的病理情况下才明显表达增多。脑源性白介素可与中枢神经系统多种神经递质相互作用，影响动物的行为、学习记忆［25］。王黎等［26］电针刺激血管性痴呆大鼠模型“百会”“大椎”进行治疗。实验表明，电针干预后大鼠海马区IL1β、TNFα水平显著低于模型组，同时，能缩短模型大鼠水迷宫潜伏期，改善其学习记忆成绩，表明应用电针干预后抑制了血管性痴呆大鼠海马区炎性因子的产生，减轻了脑组织细胞损伤，从而减轻了大鼠认知功能的损害。在细胞因子中，内源性IL6生物活性在脑缺血中反应性大量增高及外源性IL6显著的神经元保护作用均提示IL6是脑缺血神经元死亡的一种重要内生拮抗剂。孔立红等［27］电针刺激脑缺血再灌注模型大鼠“内关”“大椎”能显著性提高大鼠缺血侧海马组织IL6含量。
4 电针对海马氨基酸递质改变的影响
谷氨酸(Glu)作为脑内的主要兴奋性氨基酸递质，不仅参与认知，学习记忆高级神经活动，同时又与老年痴呆，中风等神经疾病的发生和发展有关。谷氨酸对中枢神经系统所有神经元均有兴奋作用，作用快而强，并引起神经元去极化，产生兴奋性突触后电位（EPSP）。研究表明，突触后长时程增强（LTP）产生与谷氨酸有关［28］，Glu释放后通过激活NMDA受体，诱导LTP的形成，从而对学习记忆行为进行调节。Glu各型受体均不同程度地介入了学习记忆的形成和维持过程，其中NMDA受体被认为是学习记忆中的关键物质，对突触可塑性与学习记忆有密切关系。在正常突触传递时，海马CA1等区域锥体细胞的传人末梢释放的Glu递质只能使非NMDA受体激活；当一定频率和强度的刺激使突触后膜去极化到一定程度时，堵塞NMDA受体通道的镁离子被移开，Glu递质与NMDA受体结合，钙通道开放，使突触后膜内钙离子浓度升高，继而促发一系列生化反应，改变膜的性质，导致LTP产生 。γ氨基丁酸(GABA)是由脑内含量极高的谷氨酸经谷氨酸脱羧酶脱羧而成，为高级中枢的抑制性递质，具有减轻缺血时兴奋性氨基酸对神经细胞的兴奋毒性作用。在缺血性卒中急性期应用GABA类药物可以有效减轻出血灶周围脑水肿，而对神经细胞起到保护作用［29］。杜艳军等［30］电针刺激脑缺血大鼠“水沟”“内关”“足三里”，结果显示：电针可有效地下调双侧海马组织异常升高的Glu水平(但未能恢复到正常范围)，并上调双侧海马组织GABA的水平(仍低于正常水平)。
综上所述，目前电针对海马功能物质影响的研究对象主要是脑缺血大鼠模型，电针取穴主要选“水沟”“内关”“足三里”“大椎”等，实验结果表明，脑功能障碍大鼠经电针治疗后，海马区抑凋亡的物质增多，促凋亡物质减少；调节海马血管舒缩物质；抑制致炎因子的产生，减轻脑组织细胞损伤；调节Glu和GABA水平。
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关键词: 宝宝乐口服液 下丘脑腹内侧核 膜电位 膜片钳
小儿厌食是常见的摄食行为异常，发生率约为12%～34%，对儿童生长发育影响较大，对小儿厌食发生发展及其特效疗法的深入研究将有助于推动人类对摄食生理调控机制的进一步认识和提高儿童健康水平［1］。近20年来，国内学者广泛使用以恢复脾胃运转之机，使脾胃调和、脾运复健为主要目的的运脾法为治则，治疗小儿厌食取得很好疗效，并系统研究了运脾法对消化吸收功能的影响，在外周水平上证实运脾法对胃肠道的运动和分泌有显著的调节作用［2］。在以往的研究中，我们采用病因模拟法成功制作了幼龄大鼠厌食模型［3］，并就运脾复方对该模型中枢和外周胃肠激素的调节作用［4］、对厌食大鼠下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nuclui，VMN）神经元外周摄食负反馈信息的敏感性的影响进行了研究，取得了一些成果［5］。为进一步探讨小儿厌食症的发病机制和运脾复方的作用机制，观察了运脾复方宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
日龄35～40 d的SD大鼠45只，平均体质量(60±10)g（第四军医大学实验动物中心提供），合格证号SCXK（军）200707。随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只。所有动物均单笼饲养，自由进食水。
1.2 模型制备和药物治疗
按文献方法［3］ 制做厌食大鼠模型。即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组和治疗组大鼠。1周后特制饲料喂养的大鼠日摄食量下降30%以上，体质量下降15%以上，表明模型制备成功。从实验第8天开始，治疗组大鼠用运脾复方宝宝乐口服液（第四军医大学科西京医院药剂科提供，药物组成：苍术、焦山楂、黄芪、党参、陈皮各10 g,白芍、决明子、煅龙骨、煅牡蛎各20 g）灌胃，每日1次，剂量为3.76 g/100 g(为临床2倍等效量)，同时给予对照组和模型组大鼠等容积生理盐水灌胃，连续3周。
1.3 膜片钳记录
大鼠腹腔注射10%(φ)水合氯醛（0.33 mL/100 g），麻醉后断头取脑，迅速置于冰水混合的细胞外液（NaCl 126，KCl 2.5，Na2HPO4 1.2， NaHCO3 24，Glucose 11.1，MgSO4 1.2，CaCl2 2.4，单位mmol·L-1，pH7.2～7.4，渗透压浓度299 mOsm）中充氧（95%O2和5%CO2，下同）1 min，移至振动切片机（机槽内注满持续充氧的冰水细胞外液）做200 μm厚的横切面脑片，置入28 ℃持续充氧的细胞外液中孵育1 h，然后在正置纤维镜（Axoskop I；Zeiss，Thornwood，NY）水浸镜头下进行可视膜片钳记录，膜片钳放大器使用MultiClamp 700B（Axon Instruments，美国）。pClamp8软件（Axon Instrument，Foster City，CA）用来记录和分析数据。
全细胞记录（whole cell patch）使用的电极内液成分(单位:mmol·L-1)为：Kgluconate132.3，NaCl 4，CaCl2 0.5，Hepes 10，EGTA 5，ATPMg 4，GTPNa 0.5，Phosphocretin 10，pH 7.2～7.3，渗透压280 mOsm，充灌电极后的电极电阻为6～8 MΩ。电极尖端与细胞膜形成高阻封接（达1～10 GΩ），然后吸破细胞膜，在电流钳gapfree状态下持续记录膜电位，观察瘦素（Leptin，50 nmol·L-1）对VMN神经元膜电位的影响，取给药前5 min的基础膜电位与给药最后1min的膜电位进行比较。
所有的化学试剂和药理试剂均购自Sigma公司。
1.4 统计学处理
实验数据采用均数±标准差(±s) 表示,采用t检验和χ2检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
