时间：2022-05-26 17:55:50
如何进行宫颈细胞学检查
进行宫颈细胞学检查，是用TCT配套的毛刷，取材的部位应在宫颈外口的移行带区域。取材后将毛刷置于TCT特殊的液体瓶里搅拌，尽量获得取材的脱落细胞。标本在实验室处理后由计算机阅片结合细胞学专家的鉴别，最后得出结论。
取材时要求患者24小时内无或清洗阴道：非月经期；停用阴道内抗生素或抗霉菌药1周后；在进行阴道双合诊检查前进行。对于绝经期前后或宫颈治疗等原因使鳞柱交界部上移，以及宫颈腺癌可能原发于宫颈管，可以同时加取宫颈管的涂片，以提高细胞学检查的阳性率。
如何评价宫颈细胞学检查结果
TCT的报告系统包括6个方面的内容，即：①标本量对诊断评价的意义，满意(>40％为满意)、不够满意或不满意。②诊断范围，正常、良性细胞改变或上皮细胞异常。③描述性诊断，包括伴有感染的良性细胞改变、反应性或修复性改变。④上皮细胞异常包括对诊断无决定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)。2001年Bethesda系统在ASC中除了ASC-US，另增加了不能除外高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞(ASC-H，high)。其高危性处于ASCUS与HSIL二者之间。⑤腺细胞异常，包括对诊断无决定意义的非典型腺细胞、子宫内膜细胞、宫颈内膜腺癌、子宫内膜腺癌和子宫外、非特异性腺癌。⑥激素评估(仅在阴道细胞涂片时使用)。
宫颈细胞涂片诊断的准确性，国外文献报道差异较大，为67％～92.9％。国内统计为84.3％～93.4％。总的说来，宫颈细胞学涂片诊断HSIL和浸润癌的特异性较高，但对于LSIL的特异性较低，目前虽无假阳性的具体统计，过度诊断的病例并不少见。宫颈细胞学涂片诊断的敏感性较低，国外统计其假阴性率可在20％左右，其发生主要与取材的技术和是否及时固定有关。
如何诊断、治疗及随诊宫颈细胞学异常的患者
鳞状细胞病变①ASCUS，有关非典型鳞状细胞的处理。《指南》推荐的对于ASCUS处理包括三种方案：重复两次宫颈细胞学涂片，立即阴道镜检查，以及对高危亚型HPV的DNA检测。a.如选择重复细胞学涂片的方法，应间隔4～6个月对患者进行重复的宫颈细胞学涂片。重复结果仍为ASCUS或更高等级的细胞异常，立即行阴道镜检查。连续2次重复结果均为正常，转入常规的细胞学筛查(见图1)。b.如选择立即阴道镜检查，未发现CIN者，随诊12个月时重复宫颈细胞学涂片。发现CIN则按相应原则处理(见图2)。c.如选择高危亚型HPV的DNA检测，对结果阴性者，随诊12个月时重复宫颈细胞学涂片。结果阳性者，则行阴道镜检查。如阴道镜下的活检未发现CIN，分别在随诊6个月和12个月时，重复宫颈细胞学涂片；或在12个月时重复高危亚型HPV的DNA检测。如重复出现ASCUS或更高等级的细胞异常，或HPV阳性，应重复阴道镜检查(见图3)。②ASCH：《指南》推荐的对于ASCH处理为阴道镜检查。阴道镜检查结果未发现病变，建议再次复习细胞学、阴道镜和组织学检查的结果，如与前不同，按相应的原则处理。如仍为ASC-H，分别在随诊6个月和12个月时，重复宫颈细胞学涂片：或在12个月时重复高危亚型HPV的DNA检测。如重复出现ASC-H或更高等级的细胞异常，或HPV阳性，应重复阴道镜检查。为了避免过度治疗，诊断性的电切(LEEP)不应常规用于缺乏组织学CIN证据的ASC-H治疗(见图4)。③LSIL：推荐阴道镜检查下的宫颈活检。如检查操作满意，移行带清晰，还应行宫颈管活检，特别对无肉眼可见病变的病例。对于未暴露出移行带的不满意阴道镜检查术，应行宫颈管活检。上述检查未发现CIN，分别在随诊6个月和12个月时，重复宫颈细胞学涂片：或在12个月时重复高危亚型HPV的DNA检测。如重复出现ASC-US或更高等级的细胞异常，或HPV阳性，应重复阴道镜检查。诊断性的电切(LEEP)不应常规用于缺乏组织学CIN证据的LSIL治疗。a.阴道镜检满意：见图5。b.阴道镜检不满意：颈管活检(一)――细胞学及HFV。④HSIL,对于高度鳞状上皮内病变(HSIL)的处理为阴道镜检查下的宫颈活检和宫颈管活检。对于组织学证实CIN的HSIL，按宫颈组织学异常的2001临床处理指南治疗。如阴道镜结果满意，活检仅为CIN Ⅰ，建议再次复习细胞学、阴道镜和组织学检查的结果。重复阅片的结果支持HSIL，或不能再次复习，对非孕期者建议行宫颈诊断性切除术。对于阴道镜检查也提示HSIL者，可首选宫颈诊断性切除。对这类患者可省略宫颈管活检。对于缺乏组织学CIN Ⅱ和Ⅲ证据的年青生育期妇女的HSIL，可以选择间隔4～6个月复查细胞学和阴道镜的方法随诊1年，如疾病进展再按相应的原则处理。
HSIL――阴道镜检及颈管活检。
腺细胞病变 推荐所有类型的AGC和AIS都应行阴道镜枪查和宫颈管活检。对于>35岁或不明原因阴道出血的年轻妇女，还应行子宫内膜活检。阴道镜检查未发现浸润癌，对于倾向恶性的AGC或AIS应采用冷刀锥切。阴道镜活检仍为非典型腺细胞，每4～6个月随诊宫颈细胞学涂片，连续4次阴性转入常规筛查。
【关键词】 浆细胞病； 骨髓细胞形态学； 分型； 预后
浆细胞病（Plasma cell dyscrasias，PCL）是指产生免疫球蛋白的细胞异常增生，并伴有单克隆免疫球蛋白或其多肽链亚单位合成及分泌增多的一组疾病。在临床上可由浆细胞恶性增生及所分泌的单克隆免疫球蛋白直接引起病变[1]。因其临床表现多种多样，给诊断带来一定困难，骨髓细胞形态学、X线以及单克隆蛋白检测是诊断的重要方法。笔者参照Greipp等制定的多发性骨髓瘤分型标准，对61例浆细胞病患者的骨髓细胞形态学检测结果及其生存期相关病历资料进行了分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择61例已确诊为浆细胞病的本院住院患者，其诊断标准一律参照张之南等编写的《血液病诊断及疗效标准》[2]。其中男29例，女32例，年龄33～78岁，中位年龄60岁。
1.2 方法 按常规方法行骨髓穿刺、涂片，选择头、体、尾清楚，薄厚适宜的骨髓涂片，干燥后经瑞氏染色。分类计数300个有核细胞，计算浆细胞的百分比，并对其进行分类、分型。
1.3 浆细胞分型 根据Greipp等制定的标准，将浆细胞病中可见浆细胞分为：（1）原始、幼稚浆细胞，其胞体、仁较正常大而明显，双核、多核易见。（2）成熟浆细胞形态正常，唯数量增加，常大于10%。（3）网状细胞样浆细胞胞体大，胞核圆形，染色质多网状结构，核仁常为1～2个，大而蓝，胞质边界呈模糊状，浆内含有颗粒。（4）火焰状浆细胞：胞浆呈显著的嗜酸性反应，尤其在胞质周边区域。（5）淋巴细胞样浆细胞，细胞似淋巴细胞，核质紧密，核偏位，在细胞外可见断离的小滴状细胞浆，细胞边缘不规则，同时淋巴细胞、浆细胞比例增高。
2 结果
2.1 骨髓细胞形态分型结果 61例PCL中原始、幼稚浆细胞型35例，占57.4%；成熟浆细胞型10例，占16.4%；网状样浆细胞2例，占3.3%；火焰状浆细胞型2例，占3.3%；淋巴细胞样浆细胞型3例，占4.9%；另有9例的骨髓细胞形态仅显示粒、红比例减低、增生性贫血、成熟浆细胞比例增高且大于5%，通过病理检查及细胞免疫组化确诊2例为肋骨的孤立性骨浆细胞瘤，1例为发生于阴道外阜的髓外浆细胞瘤。见表1。
2.2 生存情况 经过对61例浆细胞病患者的生存情况进行追踪观察，见表2。
2.3 5种骨髓细胞形态分别见下图1-5。
3 讨论
PCL虽然在临床上比较少见，其发病率约占血液系统恶性肿瘤的10%左右，占全身恶性肿瘤的的20%～30%，但在老年人群中其发病几率随年龄的增高而增加[3]。其在临床上分类较多，包括多发性骨髓瘤（MM）；浆细胞骨髓瘤变异型（不分泌型骨髓瘤、惰性骨髓瘤、冒烟性骨髓瘤、浆细胞白血病）；浆细胞瘤（孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤）；免疫球蛋白沉积病（原发性淀粉样变性、系统性轻/重链沉积病）；华氏巨球蛋白血症（WM）；骨硬化性骨髓瘤（POEMS综合征）；重链病（γHCD、μHCD、αHCD）；意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）等[4]。且不同种类其浆细胞又有各自的特点，骨髓形态学检查具有特异性诊断意义[5]，将临床特点和骨髓细胞形态学结合起来可以更早期、更准确诊断，其中MM、浆细胞白血病、惰性骨髓瘤（IMM）、冒烟型骨髓瘤（SMM）及不分泌型骨髓瘤表现为浆细胞恶性增生，可见骨髓瘤样细胞、原始及幼稚浆细胞或网状细胞样浆细胞见图1、图3、图4，甚至有双核、多核奇特形态的浆细胞；MGUS、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、原发性淀粉样变性、POEMS以及HCD这些疾病的骨髓中浆细胞增生程度受限，常5%
浆细胞形态幼稚、数量增多提示病情严重、预后不良[6]。本文资料，其平均生存期显示成熟浆细胞型>原始、幼稚浆细胞型>网状细胞样浆细胞型的规律，骨髓中的浆细胞数量、质量与生存期呈负相关。据报道[7] 对于浆细胞小于30%且以成熟浆细胞增多为主的浆细胞病者，平均生存期均高于浆细胞大于30%且有形态异常者。异常增生的浆细胞抑制正常浆细胞的成熟分化，使机体免疫力减低，极易继发感染。同时也使骨髓正常造血功能受抑，致使患者的一般状态再度恶化，对治疗的耐受力降低，从而影响生存期，可见骨髓中浆细胞的质和量可推测浆细胞病患者的预后。
据报道，约40.9%的患者从出现症状到确诊有不同程度延误，误诊时间平均12.7个月，误诊率在70%左右[8]。其中在血清中IgM单克隆增高的疾病中，WM占27%、髓外浆细胞瘤占3.0%、MGUS占30%，而MGUS以每年0.6%～3.0%的速率进展为MM[9]。MGUS的浆细胞数量异常但非肿瘤性（恶性），患者产生大量异常抗体但通常不引起明显临床表现，该病常可以稳定多年，一些患者长达25年，其中20%～30%的患者可发展成为浆细胞恶性肿瘤如MM，而WM也可以由MGUS发展而来。在随访中有2例孤立性骨浆细胞瘤和1例髓外浆细胞瘤进展为MM后死亡。随着近年对该类疾病的认识不断深化，逐渐积累了丰富的经验，对其诊断已经从单纯细胞形态学诊断演变为细胞生物学和临床医学结合的综合诊断模式[10]，故笔者认为若能对手段综合判断及早确诊，早期治疗，相当一部分患者能减轻症状，延长生命，特别是对于5%
参考文献
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【关键词】成骨细胞；破骨细胞；骨组织工程
近年来，组织工程学逐渐应用于骨组织再生和修复，而成骨细胞和破骨细胞在其中发挥着重要的作用，然而一些影响因素限制了其进一步应用，如何有效的控制影响因素，突破这些限制，使成骨细胞和破骨细胞在骨修复、骨重塑领域开拓更加广泛的应用空间。
1 成骨细胞（OB）
1.1 OB在骨组织工程学中的作用
OB是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。OB在维持骨架中起着至关重要的作用。OB负责着骨基质的沉积和对OC的调节。在分化期间，OB有活跃的分泌功能，能合成和分泌骨基质中的多种有机成分，包括Ⅰ型胶原蛋白、蛋白多糖、骨钙蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白等；还分泌胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ、成纤维细胞生长因子、白细胞介素-1和前列腺素等，他们对骨生长均有重要作用；此外，还分泌破骨细胞刺激因子、前胶原酶和纤溶酶原激活剂，他们能促进骨的吸收。
1.2 影响OB的因素
1.2.1 正性因素
（1）降钙素：刺激IGF-1、c-fos、Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达，刺激OB增殖和分化；（2）性激素：能够刺激OB，促进骨的形成；（3）胰岛素样生长因子（IGF）：可刺激OB的增殖和分化并作用于OB和OB前体，促进骨骼的更新；（4）骨形态发生蛋白（BMP）：可刺激原代OB或从骨组织中分离出的其他类型细胞分化为OB；（5）转移生长因子-β（TGF-β）：刺激非转化的OB的DNA合成及细胞增殖。
1.2.2 负性因素
（1）皮质类固醇：长期给予超量可以抑制OB的形成和功能。适当剂量能减少前成骨细胞转化为OB，使骨量减少；（2）糖皮质激素：导致成熟的具有分泌功能的OB和支撑OC产生的OB的数目减少。
1.2.3 双重作用因素
（1）瘦素（leptin）：它可以作用于中枢神经细胞来削弱OB的活动，或者直接结合于OB表面受体来促进骨的发育的作用；（2）血小板衍生生长因子（PDEF）：能显著促进OB的增殖，却部分抑制OB的分化。
2 破骨细胞（OC）
2.1 OC在骨组织工程学中的作用
破骨细胞是一种巨大的多核细胞，起源于骨髓中的造血干细胞。破骨细胞接触到骨基质，开始活化，细胞骨架发生重组、细胞极性开始形成并出现骨吸收特异性的膜区域。由于破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成处于动态平衡过程，使骨组织不断更新，因此维持了骨骼的硬度与弹性。除此之外，影响成骨细胞的活性，介导干细胞从骨髓到血液循环的迁移，也是破骨细胞的重要骨生理功能。
2.2 影响OC的因素：
2.2.1 正性因素
（1）TNF：促进T细胞产生M-CSF并刺激OB和其他细胞分泌RANKL，进而促进OC分化；（2）1，25-（OH）2D3：维生素的D3不能直接作用于成熟的破骨细胞，但可以诱导成骨细胞生成IL-1和IL-6促进骨吸收。
2.2.2 负性因素
（1）降钙素：降钙素能够明显抑制破骨细胞活性，减少骨吸收，广泛应用于治疗骨质疏松疾病；（2）雌激素：通过TGF-β、成骨细胞分泌产物、和ERKs磷酸化等途径的介导，促进破骨细胞的凋亡，亦能够通过促进OPG的产生和抑制C-MSF及TNF的产生来抑制OC产生。另外，雌激素也能通过抑制c-JNK的表达和、c-JUN的活性以及AP-1和启动子的结合来抑制RANKL诱导OC的产生；（3）OPG：成骨细胞分泌的骨保护素（OPG），是一种可溶性TNF受体家族成员，也是RANKL的受体，能与RANKL特异性结合，进而抑制破骨细胞的形成、活性和存活；（4）IL-4：能通过抑制IkB的磷酸化来抑制NF-κB的核转位，进而抑制NF-κB的DNA结合活性，从而完全抑制OC形成；（5）INF-γ：通过促进TRAF6的降解来抑制OC；（6）MLAA：RANKL诱导的OC前体细胞分泌的MLAA被认为是抑制OC形成的一种自身反馈调节机制。
2.2.3 双重作用因素
（1）TGF-β：低溶度TGF-β促进OC分化，而高溶度则反过来抑制其分化；（2）PG：在不同的培养系中，对于破骨细胞的形成和骨吸收具有促进或抑制的作用。
3 OB和OC的相互作用
OB与OC的相互作用从分子生物学层面来说，是驾于两种细胞跨膜蛋白的接触之上的。两者的相互作用从细胞水平层面来说分为内、外部因素：
3.1 内部因素
（1）OB有通过在前破骨细胞表面的受体激活子RANKL调节骨吸收、分化和融合的作用。同时，成骨细胞分泌一种可溶的骨保护素（OPG）通过与RANKL结合阻断RANK/RANKL交互作用，从而妨碍破骨细胞分化和激活。因此，RANKL和OPG的平衡又决定了破骨细胞的形成和功能。
（2）在骨吸收阶段，OB分泌的MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）等趋化因子可以刺激OC前体募集，促使OC活化。
（3）OB能够释放骨钙素，胎球蛋白-A，胶原蛋白I型等化学诱导因子，这些因子在骨形成过程中沉积于骨基质中，并能促进OC融合并包埋于骨基质中。
（4）骨吸收到骨形成过程中有一个过渡阶段，即OC诱导OB活化促进骨形成过程，在此过程中OC分泌偶联因子是OB活化的关键。
（5）伴随着骨吸收，OC溶解骨质并释放转化生长因子-B，骨形态发生蛋白（骨形成蛋白）和胰岛素样生长因子（IGF）-Ⅱ等细胞因子，从而激活OB。
3.2 外界因素
（1）皮质类固醇：长期给予超过生理剂量的皮质类固醇能够增加OC的活性和数量，又可以抑制OB的形成和功能。适当剂量可降低前成骨细胞对骨胶原的合成，还能减少前成骨细胞转化为OB，使骨量减少，增加发生骨质疏松性骨折的概率。
（2）甲状旁腺激素：由甲状旁腺主细胞和嗜酸性细胞合成，通过PKA和PKC信号转导通路介导来对OB和OC的功能进行调节，在骨代谢中具有促进骨形成和骨吸收的双重作用。
（3）IL-1：能促进OB分泌RANKL，促进OC形成。
（4）M-CSF：T细胞产生的M-CSF，一方面刺激OB和其他细胞分泌RANKL，进而促进OC分化。另一方面，M-CSF可以通过激活破骨细胞内的信号传导通路，使成骨细胞的数目增多，说明了M-CSF使破骨细胞增殖而激活的信号传导通路间接影响了成骨细胞。
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表达第3类抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。
2.2 同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均CV值为 32.2％。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE／CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3％。
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD 34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3，4］。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，CV值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法［5］，建议双标记CD34-PE／CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群［5］。
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC［6］；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性［7］；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
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（1）说出细胞的分化与生物发育的关系，能说明细胞的分化。
（2）举例说明细胞分化的全能性及其在科学研究中的应用。
（3）搜集和分析有关干细胞研究进展与人类健康的资料，关注当今世界面临的人类健康问题。
2.教学重点
（1）细胞分化的概念和意义。
（2）细胞全能性的概念。
3.教学难点
（1）细胞分化的概念。
（2）细胞全能性的概念及实例。
4.教学流程
新课导入：
师：（利用电脑多媒体课件，真实生动的展示一个宝宝）同学们齐声读一下这个天使宝宝的疑问？
生：咦……我是怎么来的呢？（学生读的时候，充满了好奇与欣喜，旨在激发学生强烈的求知欲）
师：多媒体展示受精卵发育成一个完整胎儿的过程，最后再次展示刚刚天使宝宝，旁边附有一句话：“哦，我是这样来的！”
师：其实个体发育的整个过程是非常复杂的（展示从受精卵经过细胞分裂和分化形成体内各种各样的细胞的图）。
新课教学：
（1）细胞分化的概念及实质的学习。
①细胞分化的概念。
师：展示胎儿发育的部分过程图，学生讨论、交流依次解决下列一系列的问题。
个体发育的起点是什么？一个受精卵是如何形成如此多相同细胞的？这些细胞的遗传物质相同吗？为什么？由这一团完全相同的细胞形成各种不同的细胞、组织经过了什么过程？
师：通过讨论，同学们已经知道这些细胞都是受精卵增殖产生的后代，形成这些不同细胞的过程就是细胞分化。
教师展示红细胞和肌肉细胞的放大图片，提出问题：
同学们能否根据已学的知识分析这两种细胞在形态、结构和生理功能上有哪些差异？学生讨论、交流、总结。
师：通过讨论，我们知道了这些细胞在形态、结构和生理功能上存在着差异，但不管是红细胞还是肌肉细胞，它们最初都是由同一种细胞（受精卵）经过细胞分化而来的。同学们能否尝试说出什么是细胞分化呢？
师生共同归纳，提炼出细胞分化的概念。
②细胞分化的实质的学习。
师：就一个个体来说各种细胞应该具有相同的遗传信息。为什么它们的细胞形态，结构和功能却有很大的差异呢？（多媒体展示相关内容：红细胞中与血红蛋白有关的基因处于开启状态，所以合成了血红蛋白，在肌肉细胞中，合成肌动蛋白有关的基因也处于活跃的状态，所以合成了肌动蛋白）
学生分小组讨论、解决以下问题：
蛋白质的合成与基因的活动状态有关，红细胞中存在与血红蛋白合成有关的基因，那么有没有与肌动蛋白合成有关的基因呢？既然红细胞和肌肉细胞中都有这两种基因，为什么特定的细胞只能合成特定的蛋白质呢？同学们能否尝试着解释为什么在红细胞中没有合成肌动蛋白？在肌细胞中又没有合成血红蛋白？同学们能否归纳出细胞分化的实质是什么？（此处如此处理的理由旨在让学生在解决问题的过程中慢慢领悟在体细胞中存在着许多基因，但基因不一定都处于活跃状态，从而为学生理解细胞分化的实质：基因的选择性表达打下基础）
（2）细胞分化的特点及意义的学习。
①细胞分化的特点。
师：同学们能否通过分析下面两个资料，归纳出细胞分化的特点？
资料一：黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素；离体培养的上皮细胞始终保持为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。
资料二：受精卵胎儿成年人老年人。细胞分化发生在整个生命进程中，但在胚胎发育时期达到最大。
资料一、二说明细胞分化具有哪些特点？
②细胞分化的意义。
师：同学们想一想，现代社会中有多少种职业？如果没有职业分工，社会的运转状况会是怎样？你个人的生活会与现在有什么不同？
（设计意图：旨在强烈激发学生的积极参与课堂的兴趣，借助学生的想像空间让他们类推：若没有细胞分化，生物将不能完成正常的生命活动，为细胞分化意义的学习奠定基础）
师：那么大家现在可以做这样的一种猜想：假如没有细胞分化，人的身体会是什么样的？如果没有细胞分化个体能否形成各种组织器官？人体能否正常发育？细胞分化有什么意义？
（3）细胞的全能性及其应用的学习。
教师要求学生阅读教科书119页斯图尔德的胡萝卜组织培养图及相关内容讨论、交流（设计意图：培养学生识图、读图，提取信息、交流信息的能力）。
能否结合书本尝试说出实验的流程？斯图尔德这个实验了说明什么？已经分化的细胞的“潜能”在怎样的特定的条件下才能够将全能性发挥出来呢？
展示一张拍摄于峨眉山的珙桐照片，并介绍：珙桐是一千万年前留下来的孑遗植物，人称“植物活化石”，是我国的珍稀植物。如果科研部门想拯救这种珍稀的珙桐，科研人员应该怎么办呢？
学生进行小组讨论，然后代表汇报讨论结果（旨在通过具体情境问题的解决，让学生真正领会细胞全能性的运用）。
教师用多媒体演示多利的诞生过程：为什么不直接将动物乳腺细胞进行培养呢？多莉羊的诞生说明了什么？
师：从多利羊的诞生我们已经了解高度分化的动物细胞一般不能直接形成一个完整的动物体的原因之一。在动物和人体内有没有具有分裂和分化能力的细胞呢？教师展示齐鲁晚报上的一则新闻：一台湾同胞身患白血病，在世界各地骨髓中未找到合适的骨髓提供者，青岛市民听到这个消息纷纷参与造血干细胞采样，希望能为台湾同胞尽一份微薄之力。通过阅读资料你能说说为什么骨髓移植能治疗白血病呢？为什么目前人们这么惧怕白血病呢？
师：有没有比较好的途径来解决呢？展示资料：储存脐血，收获健康（脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。目前，脐带血主要用于治疗血液方面的疾病，尤其是对白血病、地中海贫血等有较大的作用）。为什么说储存脐血就能收获健康呢？（旨在计学生深刻体会生物知识与生活密切相关）
师：干细胞的研究还有哪些方面呢？请同学们课后收集有关干细胞的资料。
教师提供中国干细胞治疗网的网址（http//.cn/gxb/index_html）。
5.教学反思
教学过程中教师以一系列的由易到难、由浅入深的问题为主线将整节课串连，紧扣学生的认知特点，让学生在解决一系列问题的过程中了解细胞的分化与生物发育的关系以及细胞分化的全能性及其在科学研究中的应用。在师生共同解决问题的过程中培养学生分析比较的能力、灵活运用知识的能力。整堂课的思路非常清晰，学生对细胞分化的概念、意义、特点、实质以及对细胞的全能性有了较为全面的了解。在整节内容的教学过程中，笔者特别注重将学生的学习与生活联系起来，目的想让学生明白生物知识与生活息息相关，使学生领悟科研工作的重要品质之一：关注细节，注重积累，积极思考。
如在进行细胞分化的概念和实质教学时，笔者先通过展示红细胞和肌肉细胞的放大图片，让学生结合一系列的问题根据已学的知识讨论交流，共同归纳、提炼出细胞分化的概念和实质。再引导学生结合书本，发挥想像：假如没有细胞分化，人会是什么样的？这样激发了学生积极参与课堂的兴趣，并借助学生的想像空间让他们类推出：若没有细胞分化，生物将不能完成正常的生命活动。
关键词：细胞呼吸；课堂教学；实验探究
细胞呼吸是生物界普遍存在的最重要的代谢活动之一，也是高考必考的考点。在过去的教学中总感觉学生对细胞呼吸的过程掌握起来有很大的难度，针对这种现象我在设计课堂教学环节时做了大胆的尝试，利用学生的好奇心，我把探究实验运用到课堂教学过程中，取得了很好的教学效果。下面我来谈一谈这节课的教学设计过程及课后的反思。
1 明确新课标要求，把握好教材的内容
根据新课标的要求，对细胞的了解，将有助于学生较深入地认识生命的物质基础和结构基础，理解生命活动中物质的变化、能量的转换和信息的传递；领悟观察、实验、比较、分析和综合等科学方法及其在科学研究过程中的应用；科学地理解生命的本质，形成辩证唯物主义自然观。本节课主要以探究的方式来学习细胞呼吸的过程，掌握细胞呼吸原理，了解细胞呼吸在实际生活中的应用。通过培养学生观察、比较、分析和综合等科学方法，提高学生的生物科学素养。
2 精心设计导学案调动学生学习的主动性，利用探究实验突破教学的难点
细胞呼吸（导学案）
【教学目标】
1.通过学习，进一步认识线粒体的结构和功能，理解线粒体是有氧呼吸的主要场所；
2.通过探究学习，理解细胞进行有氧呼吸和无氧呼吸的过程；
3.通过比较和讨论，理解细胞有氧呼吸和无氧呼吸的异同；
4.联系实际，了解细胞呼吸原理在实践中的应用；
【教学重点和难点】
1.教学重点 有氧呼吸的过程及原理。
2.教学难点 细胞呼吸的原理。
【教学理念】尊重学生的认识规律，以学生为主体，以教师为主导，以问题为主线，由浅入深，层层深入，通过不断探究认识事物的本质。注重知识的生成过程，及时训练、归纳、比较、再现，紧密联系生活实际学有所用，注重学习兴趣的培养，及时肯定学生的优点指正不足，尊重客观规律，培养学生的辩证思维能力，注重科学素养的培养。
【课前延伸】生物在生命活动中所需的能量直接来源于ATP的水解，ATP是生命活动的直接供能者，ATP在生物体细胞中是怎样合成的哪？
【设问】导入新课。
问题一：复习提问“ADP合成ATP的能量来源何处？”
【板书】第5章 第3节 ATP的主要来源―细胞呼吸
问题二：分析细胞呼吸现象说明理由，激发学生的学习兴趣。（见课件）
【板书】细胞呼吸的方式：有氧呼吸和无氧呼吸
【学生预习】预习课本P 93～94页有氧呼吸的内容，完成学案内容。
【板书】简绘真核细胞图，画出细胞核和线粒体。
【设问】思考：为什么说线粒体是有氧呼吸的主要场所哪？
细胞呼吸最常利用的是葡萄糖，我们以葡萄糖为例来共同探究一下它的氧化场所。
二、无氧呼吸的过程：
1.条件：________________条件下。
2.场所：___________________
3.过程：
（1）第一阶段：与有氧呼吸的第一个阶段完全相同。
（2）第二阶段：
4.化学反应式：
【板书】无氧呼吸的场所及反应表达式。
三、细胞呼吸原理的应用
【利用课件】通过图片介绍细胞呼吸在农业生产，工业生产和生活中的应用。
小结：通过板书比较有氧呼吸和无氧呼吸的过程，总结细胞呼吸的过程；了解细胞呼吸的应用；明白学习的目的是为了应用和创造。
【学科思想教育】比较有氧呼吸和无氧呼吸过程的复杂程度，结合原始大气的成分缺少氧和原核细胞没有线粒体的知识，请你推测细胞呼吸的进化历程（进化的观点）。在细胞中代谢旺盛的部位线粒体数量比较多（结构与功能相适应）
【当堂检测】略
课后作业：
1、请你设计一个表格比较有氧呼吸和无氧呼吸
2、预习第4节能量之源-------光与光合作用
【板书设计】：认真设计，突出重点。
3 归纳总结课程设计理念，形成完整的课堂设计体系
1、课前预习 明确目的
课前学生通过自主学习完成导学案，了解所学内容，独立完成对基础知识的学习，明确重点、难点，为课上针对性学习奠定基础。
2、联系生活 激发兴趣
利用生活实例激发兴趣导入新课。（苹果、豆芽）
3、复习提问 强本固基
复习性提问，澄清认识盲点，掌握线粒体的结构，为下一步教学铺平道路。
4、分析实验 探究学习，本环节是本节课的核心部分。
为了调动学生的主体性，施展教师的主导作用， 运用实验探究，分组讨论问题，探究细胞呼吸过程，以训练学生分析解决问题的能力------突破难点。通过小组讨论，引导学生观察、思考、探究、分析、综合得出结论。边探讨边指导学生板书细胞呼吸过程。
5、精心总结 形成体系
通过多媒体总结有氧呼吸过程，使学生形成完整的知识体系。
6、归纳类比 培养能力
让学生通过归纳得出有氧呼吸的概念，并理解其内涵。通过类比推理完成无氧呼吸的概念。
7、及时训练 强化记忆
通过设置不同难度的练习，检验学生对知识的掌握情况，巩固所学内容，强化记忆。
8、联系生活 解决问题
通过对实际问题的分析，让学生掌握有关细胞呼吸在生产生活中的应用，学以致用，进一步激发学生的学习兴趣。
9、思维拓展 知识延续
通过精心设问，激发学生思考，（探讨细胞呼吸进化历程）培养进化的观点，提高学生生物学素养。
4 通过课后反思总结不足提高教师的能力，实现教学相长
没有反思和修正就不会有提高，反思是提升我们业务水平和教学能力的重要途径。 针对于本节课的教学我将从以下三个方面进行反思：
1、本节课的成功之处。在教学过程中，我能够充分调动学生的主动性，培养学生主动获取知识的能力；通过本节教学初步培养了学生观察、实验、比较、分析和综合等科学方法；探究实验过程使小组内充分讨论，分工合作，自主学习掌握知识，促进了学生之间的交流与合作；课前准备充分，对教材、学生、教法和学法都很熟悉，保证了课堂教学顺利、高效的实施。
Networks in Cell Biology
2010，272pp
Hardback
ISBN9780521882736
Mark Buchanan等著
本书由剑桥大学出版社出版，详细地阐述了细胞生物学中关键的生物网络：转录调控网络、蛋白相互作用网络以及代谢网络的理论基础和实验方法。
研究细胞中生物学网络的目的在于全面、系统地描述某个时刻在一个活细胞内的所有功能分子以及它们的相互作用，并找到细胞能够准确、有序地调控这些分子参与到如信号转导、新陈代谢等生物学过程的机制。作为一部关联细胞生物学与网络科学的图书，本书首先概述了细胞中存在的生物学网络，而后分别从生物学实验角度和数学建模角度对每个生物学网络进行了详细的介绍，并形象地向读者展示了在研究这些网络时所采用的方法和值得注意的问题。
本书内容共分为8章，各章内容如下：1. 细胞中的生物学网络概述以及这些网络与细胞功能之间的联系；2. 真核生物和原核生物中的转录调控网络以及它们的结构和进化；3. 真核生物的启动子结构以及启动子转录因子相互作用介导的基因调控网络；4. 鉴定蛋白质相互作用的实验方法：亲和纯化法、质谱检验法、芯片检验法以及这些方法之间的比较；5. 蛋白相互作用网络的建模：蛋白蛋白相互作用的预测方法；6. 代谢网络的动力学及演化；7. 代谢网络中的分层建模；8. 化学信号在信号网络中的作用以及不同信号通路之间相互作用的研究方法。
本书是一部介绍细胞生物学中网络研究的专著，由多名作者合作编写而成，他们都在各自领域中从事多年的研究工作，例如：Mark Buchanan从事物理学研究并为Nature physics杂志撰写专栏文章；Guido Caldarelli是统计学方面的专家；Paolo De Los Rios从事生物物理学研究。
本书配以大量的实例，深入浅出地为读者讲解了在处理细胞生物学网络问题中的生物学及数学方法，可为细胞生物学、生物信息学及相关学科的研究人员提供参考。
孙海汐，博士生
（中国科学院遗传与发育生物学研究所）
【关键词】 免疫细胞化学 形态学分析 腹水 腺肿瘤 胸腔积液
0 引言
胸腹腔积液是常见的临床征象，病因复杂. 对积液进行脱落细胞学检查，可以判定疾病的性质，但普通染色片有时对高分化腺癌和增生性间皮细胞不易鉴别. 应用免疫细胞化学对积液中脱落细胞进行标记，并结合细胞形态学定量分析，在二者鉴别诊断中有较高的应用价值［1-2］. 我们对我院近年来良恶性胸腹水各30例采用免疫细胞化学SP法标记和计算机形态学定量分析，探讨免疫细胞化学和形态学观察在胸腹腔积液细胞学诊断和鉴别诊断中的意义.
1材料和方法
1.1材料
良性组(A组)30例，其中18例结核性胸水，胸部CT检查诊断为结核，痰中结核杆菌阳性;12例肝硬化腹水，腹部B超诊断为肝硬化，肝功谷草转氨酶升高，乙肝系列表面抗原阳性.男15例，女15例，年龄18~71（平均45.4）岁.恶性组(B组)30例，其中15例血性胸水，支气管镜或胸膜活检病理证实为肺腺癌;15例腹水，胃镜或B超诊断为胃癌或卵巢癌.男21例，女9例，年龄39~79（平均59.7）岁.
1.2方法
新鲜胸腹水沉淀5 min后，留取沉淀部分约10 mL，在自动涂片离心机(日本樱花精密机械有限公司产品)离心10 min (2100 r/min)，弃上清液，将沉淀在载玻片上的细胞均匀涂在常规HE染色的玻片，每例一张，在抹有APES载玻片上涂片，每例3张，稍干后，一张常规涂片放入950 mL/L乙醇中固定15 min，HE染色. 对其所示细胞在CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航天大学图像中心与空军总医院图像开发组产品，CMIAS型，WINDOW98软件)下测细胞核、浆的面积，核浆比例，细胞周长，平均直径，圆度，形状因子.置于40倍镜下观察，选择细胞密集重叠较少的区域采图，分割，编辑，统计，获得脱落细胞形态学原始数据. 对重叠细胞、红细胞或淋巴细胞予以弃除. 在同一制片、同种染色及光照条件下，每例测定分析细胞50个，校正因子1.1. 抹有APES的涂片稍干后，即放入乙醚乙醇液(1∶1)中固定15 min，水洗. 固定后的涂片先用蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗3次后，滴加A液(50 mL/L正常羊血清)适量，在室温、湿盒内各封闭10 min，37℃孵育1 h，PBS冲洗，每次5 min，再依次滴加BC液(二抗及SP液)，室温放置30 min. 免疫细胞化学染色采用SP法，一抗及其工作浓度分别为CEA(1∶350)，EMA (1∶150)，vimentin(1∶40)(均购自北京中山生物技术公司). PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性胸腹水涂片作阳性对照. 结果按照每张涂片的阳性细胞比例及着色深浅计分进行判定分析. 阳性细胞所占比例判断，无着色0分，1/3以下着色为1分，1/3~2/3为2分，2/3以上为3分. 阳性强度，无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 2项相乘0分为-，1~3分为+，4~6分为2+，7~9分为3+；将-视为阴性、+视为弱阳性、2+视为阳性、3+视为强阳性.
统计学处理：数据用x±s表示，计数资料组间比较采用χ2检验，计量组间比较采用t检验，所有统计学分析均用SPSS8.0软件完成.
2结果
A组涂片中以增生性间皮细胞和淋巴细胞为主，间皮细胞单个散在或成片排列，大小略不一致，细胞核呈圆或卵圆形、多居中，核膜清楚，染色质匀细，有小核仁，胞质丰富，淡伊红色. B组涂片，癌细胞呈团、腺样、乳头样或散在（图1），细胞大小不一，互相拥挤，核大，大小形状不一致，核膜厚，染色质粗且分布不均匀，核仁明显，胞质较少，内可见空泡. 可有病理性核分裂像. 免疫细胞化学染色结果A，B两组有差别（图2，3，表1）， A，B两组细胞形态学定量分析测定结果也有差别（表2）.表1良性和恶性两组免疫细胞化学SP法阳性表达（略）表2良性和恶性两组细胞形态学定量分析(略)
3讨论
癌胚抗原（CEA）是一组酸性糖蛋白. 广泛存在于各种上皮源性肿瘤，尤其是各种腺癌细胞中表达阳性，体腔间皮细胞中不含CEA，因而是鉴别腺癌和增生性间皮细胞的重要生物学标记物［3-4］. 上皮膜抗原（EMA）在腺癌中呈阳性表达，间皮细胞呈弱阳性可配合其他指标鉴别诊断. 波形蛋白（vimentin）是间叶源性肿瘤标记物，绝大多数上皮源性肿瘤为阴性表达，间皮细胞为阳性. 因而可区分腺癌与增生性间皮细胞. 我们的实验结果与文献报告一致［5］. 说明选用一组组织特异性抗体进行免疫细胞化学表达，在胸腹水中腺癌细胞和增生性间皮细胞鉴别诊断方面有重要作用. 新近研究认为［6］，CEA蛋白在胸腹水鉴别诊断的价值有差异，对良、恶性胸水鉴别有重要价值，而对良、恶性腹水鉴别价值较低. 其中原因可能有：①恶性腹水多由肝癌、卵巢癌等引起，而CEA在这些肿瘤中表达较低. ②部分恶性腹水是因静脉或淋巴回流受阻以及肿瘤而引起的低蛋白血症，而无肿瘤细胞浸润腹腔. 本文B组15例恶性胸水和15例恶性腹水中癌细胞对CEA表达均为阳性，其阳性率高于文献报道［5-6］，可能因观察例数较少. vimentin在间皮细胞中表达率较低，可能与离心等对细胞质影响有关. EMA在腺癌中呈阳性表达，而间皮细胞则为弱阳性，因此，免疫细胞化学用于良、恶性胸腹水的鉴别诊断，提高了阳性诊断率.
传统细胞学诊断主要依据细胞的大小、形态、结构、细胞的产物（如粘液）等. 恶性细胞有细胞核的改变（如核增大、深染、核浆比失调，染色质分布不均匀等），细胞互相拥挤等. 有一定的主观性. 信息技术的发展为细胞学诊断的数字化客观评价提供了可能. 本研究以胸腹水中脱落细胞为对象，定量测定其中细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子，发现恶性胸腹水中腺癌细胞明显高于良性胸腹水中的增生性间皮细胞，具有统计学意义(P0.05)，可能与图像预处理(如分割等)，灰度等原因有关.由于高分化腺癌与增生性间皮细胞的形态学参数阈值缺乏统一标准，尚待进一步研究，因此，图像分析对良恶性胸腹水的鉴别仅提供参考，仍需结合光镜下细胞的形态特点和免疫细胞化学结果. 总之，免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要价值，形态学定量分析可提供参考，二者综合分析对鉴别腺癌和增生性间皮细胞具有重要作用，是提高胸腹水阳性诊断率的有效途径之一.
【参考文献】
［1］Gong Y， Sun X， Michael CW， et al.Immunocytochemistry of serous effusion speeimens: A comparison of Thinprep vs cell block［J］.Diagn Cytopathol，2003，28(1):1-5.
［2］徐炜. 形态学定量分析在胸腔积液诊断中的应用价值［J］.诊断病理学杂志，2002，9(5):311-312.
［3］免疫组织化学方法在良恶性胸腹水鉴别诊断中的意义［J］. 实用医学杂志，2004，4(20):374-375.
［4］Villena V， LopezEncuentra A， EchaveSustaeta J，et al.Diagnostic value of CA549 in pleural fluid.Comparison with CEA， CA15.3 and CA72.4［J］. Lung Cancer，2003，40(3):289-294.
【关键词】留学生；医学细胞生物学；实验教学
随着我国教学体系的不断完善以及国际交流的深入，我国高校招收了来自不同国家的留学生。医学细胞生物学作为留学生入校以后接触的第一门专业基础课，在整个医学院校教育中显得尤为重要。教好“医学细胞生物学”不仅能提高留学生这方面的知识，还可以为他们以后学习的众多专业基础课程奠定基础。
医学细胞生物学是一门以显微，亚显微和分子等不同的水平对细胞的结构，功能以及其他生命活动进行研究的学科，可以看出这门课是一门实验性很强的课程[1]。理论课知识需要实验课能为其做一些直观方面的解释。所以要利用好实验课这方面的优势，让学生从中获得更多的益处。本文主要从以下几个方面探讨留学生“医学细胞生物学”实验教学过程中积累的经验体会。
1. 教师应具备较高的专业知识和英语水平
从事留学生教学跟高校其他层次教学的最主要区别在于留学生是全英文教学。这就要求讲课老师不但要具备扎实的专业知识，还应该有较高的英语听写读说等能力。况且来自不同国家的留学生因受其母语的影响，会有不同程度的口音。实验课不像理论课一样以老师的讲解为主，整个实验课过程中老师和学生会有很多次交流的机会。这些种种问题就由老师不断地学习和探索，提高自己的英文水平来得以解决。
2.从学生感兴趣的领域出发，以便提高教学效果
我们在从事留学生“医学细胞生物学”实验教学过程中发现，留学生对实验课很感兴趣。特别是在“动物细胞基本形态和结构的观察”实验中，学生会有亲手处死蟾蜍，制作临时玻片标本等机会。留学生在此实验中，往往表现出他们对动物实验的浓厚兴趣和较强的动手能力。带教老师应该运用好这样的机会给学生讲授更多相关的知识，把实验课内容与理论课完美地结合起来，以便学生加深映像。
3.加强多媒体教学手段
“医学细胞生物学”实验课内容包括细胞整体形态和结构的观察，细胞器的超微结构的观察，还有细胞不同分裂方式的镜下观察等。这些内容就要求带教老师充分利用图片和动画兼备的多媒体教学手段。这给学生的理解带来了方便，是提高教学效果的有效方法。
4.及时听取学生的意见和评价
留学生应受其从小接受的教育模式和其国家背景的影响，具备课堂气氛活跃和敢于表达主见的特点[2]。带教老师要把握留学生这个特点，要及时跟他们交流课堂教学。听取学生对老师的意见、建议还有对实验课的要求和评价。这样老师可以从学生的角度出发，有利于较快地提高教学效果。
总之，在留学生“医学细胞生物学”实验教学中，要从学生本身的特点出发，抓住学生所感兴趣的环节，从而讲授相关的知识，以便学生们主动，乐意的接收新知识。要给学生充分的动手机会和自我表现的空间。实验流程中要及时地引导学生，以便学生顺利地完成实验内容。有效利用多媒体教学手段的优越性，启发和引导学生掌握相关的知识。最后还要注重听取学生对自己和课程提出的宝贵意见和建议，取长补短，努力提高自己专业知识和英语水平，以便提高教学质量。
参考文献：
通讯作者：姜玲
【摘要】 目的 分析尿沉渣镜检法与干化学法检测尿液中红细胞及白细胞结果的相关性，探讨两种方法联合应用的临床价值。方法 采用尿沉渣镜检法和干化学法检测490例患者尿液中红细胞和白细胞，比对分析两种方法的结果。结果 干化学法红细胞阳性率略高于尿沉渣镜检法，但差异无统计学意义。尿沉渣镜检法白细胞阳性率略高于干化学法，但差异无统计学意义。两种方法检测红细胞和白细胞阴性、阳性结果之间均互有交叉现象。结论 尿沉渣镜检法与干化学法检测尿液中红细胞及白细胞各有优缺点，联合应用沉渣镜检法和干化学法测定尿液红细胞及白细胞有利于临床疾患的诊断与治疗。
【关键词】 尿沉渣镜检法 尿液干化学分析法 红细胞 白细胞
Urinary erythrocytes and leucocytes analyzed by urinary sediment microscopy and dry chemical method JIANG Ling， CHENG Guang-min，JIANG Shu-hui.Chongyang People's Hospital， Chongyang 437500，China
【Abstract】 Objective To study the associativity between the results of urinary erythrocytes and leucocytes analyzed by dry chemical method and urinary sediment microscopy.Methods Urinary erythrocytes and leucocytes of 490 patients were detected by dry chemical method and urinary sediment microscopy.Results The positive rate of erythrocytes analyzed by urinary sediment microscopy was little lower than that by dry chemical method，but there was no statistical significance between the two methods （P＞0.05）.The positive rate of leucocytes analyzed by urinary sediment microscopy was little higher than that by dry chemical method，but there was no statistical significance between the two methods （P＞0.05）.There all existed crossover phenomena in the negative and positive results of erythrocytes and leucocytes analyzed by the two methods.Conclusion Combined application of dry chemical method and urinary sediment microscopy in the detection of urinary erythrocytes and leucocytes could make for the clinical diagnosis and treatment.
【Key words】 Urinary sediment microscopy； Dry chemical method； Erythrocyte； Leucocytes
近年来，随着全自动尿液分析仪在大多数医院检验科的广泛使用，干化学法检测红细胞和白细胞已成为尿液常规检查项目，大大减轻了一线检验人员的工作负担；但是全自动尿液分析仪的检测原理是采用物理和化学的方法检测尿液中的理化成分的变化，因此仪器并不能有效识别红细胞和白细胞等有形成分，任何对物理或化学检测过程产生影响的因素都可能导致异常结果，造成患者的误诊或漏诊。检验师在显微镜下直接观察计数尿液中红细胞和白细胞，其结果可靠性高，但若由于某些原因造成红细胞和白细胞破环溶解，镜下也不能观察到此类有形成分，造成漏诊。显然这两种方法互有优缺点，为探讨其联合应用价值，笔者分别使用两种方法检测了490例尿液标本，结果如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择来本院门诊就诊的490例患者为研究对象，年龄21～50岁，中位年龄为31.5岁。其中女338例，男152例。
1.2 试剂和仪器 MA-4280尿液分析仪及其配套试剂，XS-213光学显微镜，尿沉渣刻度离心管。
1.3 方法
1.3.1 干化学法检测尿液红细胞和白细胞：留取新鲜尿液标本约10 ml，充分混匀，将试纸条浸入尿液中约2～3 s，立即取出并拭去多余尿液，将试纸条放于样本台上，自动完成分析过程。红细胞和白细胞均结果报告为：－、±、＋、2＋、3＋、4＋。检测结果大于等于“＋”为阳性。
1.3.2 沉渣镜检法检测尿液红细胞和白细胞：在尿沉渣刻度离心管中加入10 ml新鲜混匀尿液标本，1500 r/min离心5～10 min，小心倒掉上清液，留取尿沉渣约0.2 ml。充分混匀后取一滴在高倍镜下镜检，以红细胞数＞3/HPF为阳性，白细胞数＞5/HPF为阳性［1］。
1.4 统计学处理 统计学分析采用SAS 8.0软件包，两种检测方法结果比较采用配对四格表χ2检验，检验水准为α0.05。
2 结果
2.1 两种方法检测尿液红细胞结果比较 490例尿液标本沉渣镜检法和干化学法检测红细胞结果如表1所示。沉渣镜检法检测红细胞阳性率为12.7%，干化学法检测红细胞阳性率为13.5%，后者阳性率略高于前者，统计结果显示两种方法差异无统计学意义（χ20.2813，P＝0.5959＞0.05）。两种方法结果均为阳性的标本为9.8%，均为阴性为83.7%；两种方法的结果互有交叉现象，镜检阳性而干化学法阴性为2.9%，镜检阴性而干化学法阳性为3.7%。
表1 两种方法检测490例尿液红细胞结果
2.2 两种方法检测尿液白细胞结果比较 490例尿液标本尿沉渣镜检法和干化学法检测白细胞结果如表2所示。沉渣镜检法检测白细胞阳性率为13.3%，干化学法检测白细胞阳性率为12.2%，后者阳性率略低于前者，χ2＝0.4103，P＝0.5218＞0.05，统计结果显示两种方法无统计学意义。两种方法结果均为阳性的标本为10%，均为阴性为83.3%。同红细胞检测一样，两种方法的结果互有交叉现象，镜检阳性而干化学法阴性为4.5%，镜检阴性而干化学法阳性为3.5%。
表2 两种方法检测490例尿液白细胞结果
3 讨论
尿液红细胞和白细胞检测对肾出血、尿路感染和泌尿系统疾病有重要诊断价值，是尿液分析中不可缺少的重要检查项目，有“体外肾活检”之称［2］。全自动仪器干化学法检测红细胞和白细胞在尿液检测筛查中具有快速简便的特点，而沉渣镜检法具有客观、准确和具体的特点，能直接定量分析尿液红细胞和白细胞数量和形态，这种形态学分析是干化学法不可能替代的。尿液分析结果的准确性直接影响临床诊断与鉴别诊断，干化学法和镜检法是两种不同的原理的方法，因此有时可能出现不同的结果［3］。
干化学法试剂条红细胞模块中含有联苯胺的衍生物，可与血红蛋白中亚铁血红素反应，产生新生态的氧，氧化指示剂，使指示剂显色，显色强度反应红细胞含量［4］。因此，干化学法检测的是尿液中的血红蛋白，而不是红细胞。尿液中任何对氧化还原反应有干扰的因素均有可能导致错误的红细胞测定结果，大量维生素C等还原性成分可竞争性抑制氧化还原反应导致干化学法产生假阴性结果，而肌红蛋白、菌尿或对热不稳定酶等氧化性成分则可能导致干化学法产生假阳性结果。
干化学法试剂条白细胞模块中含有吲哚酚酯和重氮盐，吲哚酚酯在尿液中白细胞的胞浆内粒细胞酯酶作用下可游离出吲哚酚，吲哚酚与重氮盐发生重氮反应形成紫色缩合物，其颜色深浅与粒细胞数量呈正比例关系。粒细胞酯酶主要存在于粒细胞，同时也少量存在于单核细胞，而淋巴细胞中无此类酶，显然干化学法检测的白细胞主要是粒细胞［5］。尿液中任何对粒细胞酯酶活性有影响的因素都会导致错误的白细胞测定结果：大于5 g/L的蛋白尿、大量先锋Ⅳ、庆大霉素、深棕色尿或乳糜尿均可导致尿白细胞阳性减弱或为假阴性结果；而采用甲醛防腐尿液，以及应用呋喃坦啶等某些药物时，可导致假阳性结果，此外，上皮细胞含有与粒细胞相似的酯酶，也可能造成假阳性结果［6］。肾移植术后排斥反应和多种免疫性疾病患者尿液中白细胞常以淋巴细胞为主，由于淋巴细胞不含粒细胞酯酶常常而出现假阴性结果。
沉渣镜检法可定量分析尿液红细胞数量和形态，既可避免尿液中过氧化物酶类似物造成的假阳性结果，又可避免尿液中大量还原性物质造成的假阴性结果。沉渣镜检法亦可定量分析尿液白细胞数量和形态，既可避免尿液中不含粒细胞酯酶的淋巴细胞和酶活性低的单核细胞不与试纸条膜块化学成分发生反应而造成的假阴性结果，也可避免因上皮细胞造成的假阳性结果。然而，由于沉渣镜检法须在显微镜下直接找到红细胞和白细胞，因此当渗透压或pH值变化等因素溶解破坏红细胞和白细胞时，将导致假阴性结果［7，8］。
本实验总检测490例标本，两种方法红细胞阳性率比较，干化学法略高于尿沉渣镜检法，其中干化学法阴性而镜检阳性标本14例，占总标本量的2.9%，干化学法阳性而镜检阴性标本18例，占总标本量的3.7%，两种方法无统计学差异。其中4例干化学法菌尿阳性标本红细胞也为阳性，而镜检则为阴性。另有2例临床诊断为阵发性睡眠型血红蛋白尿患者尿液为酱油色，干化学法阳性而镜下未见红细胞。由此可见，干化学法既可检测完整的红细胞，又能测定红细胞破坏后游离的血红蛋白；而镜检法只能检测完整的红细胞。尿液比密过低或PH偏高均易造成红细胞溶解破坏，造成所谓红细胞干化学检查的“假阳性”结果。
同时，两种方法白细胞阳性率比较，干化学法略低于尿沉渣镜检法，其中镜检阳性而干化学法阴性为22例，占总标本量的4.5%，镜检阴性而干化学法阳性为17例，占总标本量的3.5%。8例女性患者尿液可能被阴道分泌物污染，镜检发现较多上皮细胞，吩咐患者重新留取中段尿，再次测定时干化学法为阴性结果；另有6例患者干化学法阳性，而镜下未见粒细胞，推测可能由于某些因素破坏了粒细胞，其特异性酯酶仍然可被试纸条检测，但镜检则为阴性，此类患者很容易被镜检法漏诊。
综上所述，由于干化学法和尿沉渣镜检法采用不同的检测原理，对红细胞和白细胞的检测效能也不一样，因此在临床工作中应将干化学法和尿沉渣镜检法结合起来，从而可能获得准确可靠的实验结果。
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【关键词】 白色念珠菌；β-葡聚糖；生物学活性；提取分析；免疫药理作用
【Abstract】 Objective To study the pharmacological effect of the basic β-glucan，acidic β-glucan and insoluble β-glucan extracts of Candida albicans on the leukocytopoiesis-promoting in the leukopenia mice.Methods Mice of each group except the untreated control group were administered cyclophosphamide intraperitoneally ［100 mg/(kg·d) for three days］ to develop leucopenia.The experimental group were administered three kinds of Candida albicans β-glucan intravenously for six days separately.The peripherial leukocytes of all mice were counted before treated CTX，and 1，3，5，7 days after treated CTX.Results Three kinds of Candida albicans β-glucan can increase the numbers of leukocytes，neutrophilic granulocytes and monocytes in the peripheral blood.The spleen index in each group animal are increased，and megakaryocytes are increased in spleen and marrow.Conclusion Candida albicans β-glucan specially insoluble β-glucans is a kind of immunomodulator which can increase the numbers of leukocytes in the peripheral blood.
【Key words】 β-glucan；Candida albicans；leukocyte；immunomodulator
β-葡聚糖（β-glucan）是白色念珠菌细胞壁中含量最高的多糖。作为一类条件致病真菌多糖，白色念珠菌β-葡聚糖有着多种生物学活性和免疫药理学作用，在抗炎、抗肿瘤、刺激造血等方面都有很高的药效学作用［1］，但有关不同性质的白色念珠菌β-葡聚糖升白细胞作用的研究甚少。本研究制备三种溶解性的β-葡聚糖，观察其对环磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白细胞减少的回升作用，为进一步确证白色念珠菌β-葡聚糖刺激造血系统使白细胞升高的作用机制，和进一步研究白色念珠菌β-葡聚糖有效成分或有效因子，为确立药物质量控制标准和量－效关系提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂 昆明种小白鼠，4～6周龄，体重20±2g，昆明医学院动物科（云南省实验质量合格证0000481号）。沙氏液体培养基（Sabouraud’s dextrose agar）：蛋白胨10g、葡萄糖40g、溶于1000ml蒸馏水，高压灭菌后备用；α淀粉酶：分子量～9600，酶活力：50μ/mg（上海伯奥生物科技有限公司）；白色念珠菌碱溶性β-葡聚糖（Candida albicans basic β-glucan， CABBG）、酸溶性β-葡聚糖（Candida albicans acidic β-glucan， CAABG)和不溶性β-葡聚糖（Candida albicans insoluble β-glucan， CAIBG）：均按文献方法制备［2］。
1.2 仪器 LRH-250Z型震荡培养箱（广东医疗器械厂）；81-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）。
1.3 白念珠菌的培养和三种白色念珠菌β-葡聚糖的制备 取少量保存于密封无菌容器中的纯白色念珠菌菌落，接种于沙氏液体培养基，接种后37℃恒温摇床160次/min震荡培养6～7天，3000rpm离心30min，收集菌体，冷冻保存。提取β葡聚糖的流程，见图1。
1.4 小鼠白细胞减少模型的建立 除空白对照组外，各组小鼠腹腔注射CTX 100mg/(kg·d)，连续3天，建立小鼠外周血白细胞减少模型。
1.5 确定三组β-葡聚糖的给药剂量 参照急性毒性实验摸索LD50值，各组给药剂量最后如表1。
1.6 统计学处理 急性毒性学实验结果采用Bliss法计算LD50值。药效学实验采用SPSS11.5统计软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。
图1 从白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意图
Table 1 Dose design of experiment
2 结果
2.1 急性毒性学实验 通过急性毒性实验得到LD50值分别为：CABBG 36.8937mg/kg，CAABG 89.23549mg/kg，CAIBG 767.7753mg/kg；95%可信区间分别为CABBG组32.0052～42.5289mg/kg，CAABG组76.7182～103.8025mg/kg，CAIBG组663.748～888.106mg/kg。各实验组小鼠肉眼观察，除肝脏增大外未见明显变化，病理HE切片显示肝细胞有不同程度的肿胀和空泡变。
2.2 外周血白细胞变化 实验第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠外周血白细胞数、中性粒细胞数、单核细胞数均显著增高，其中第7天、第9天，CAIBG组白细胞数、单核细胞数较阳性对照组rhG-CSF升高，差异有显著性。
Table 2 Numbers of leukocyte of peripheral blood in each group animal (x±s)
注：Note：*P＜0.05，compared with the normal control；**P＜0.05，compared with the positive control
Table 3 Numbers of neutrophilic granulocyte of peripheral blood in each group animal (x±s)
注：Note：*P＜0.05，compared with the normal control；**P＜0.05，compared with the positive control
Table 4 Numbers of monocyte of peripheral blood in each group animal (x±s)
注：Note：*P＜0.05，compared with the positive control
2.3 脾脏、胸腺指数变化 实验第5、7、9天，各组小鼠胸腺指数比较，差异无显著性(P＞0.05)。各组小鼠给药后，脾脏指数均增加。
Table 5 The effect of β-glucan on the spleen index in each group animal (x±s)
注：Note：*P＜0.05，compared with the positive control
2.4 药效学实验病理组织学改变 脾脏：白髓、红髓分界不甚清楚，红髓内细胞数增多，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG组脾窦出现较多的巨核细胞；骨髓：实验组小鼠骨髓细胞增生活跃，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG组的巨核细胞数增多，提示巨核细胞系增生活跃。
3 讨论
多能造血干细胞具有多向分化的潜能，成年小鼠体内的多能造血干细胞主要分布在脾脏和骨髓［3］。本研究显示，实验第7天时，各实验组白细胞总数、中性粒细胞数都较rhG-CSF高(P＜0.05)；实验第7天、第9天，CAIBG升高外周血白细胞、单核细胞数明显高于CABBG、CAABG和rhG-CSF(P＜0.05)，说明β-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液系统白细胞、中性粒细胞、单核细胞数不同程度的升高。实验第7天，CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠脾脏指数均与rhG-CSF差异有显著性(P＜0.05)；第9天，CAIBG脾脏指数较rhG-CSF、CABBG、CAABG组高，统计学表明差异均具有显著性(P＜0.05)。与成年小鼠体内造血干细胞的分布一致，实验发现CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠的组织病理学改变主要体现在骨髓和脾脏。与空白对照组比较，三组小鼠脾脏、骨髓巨核细胞数增多，CAIBG组要更明显。因此，综合外周血细胞数、脾脏指数、组织改变，我们推测β-葡聚糖在刺激小鼠外周血白细胞总数升高的过程中可能与刺激CFU-S增殖，向粒系、巨核系组细胞分化，进而生成粒细胞、单核细胞。
造血器官中基质细胞是造血微环境中重要的成分，与造血有关的基质细胞涉及到巨噬细胞、成纤维细胞、网状细胞、淋巴细胞、内皮细胞和载脂肪细胞。其中，巨噬细胞被证明是在造血发生过程中有重要作用的一个微环境因素。巨噬细胞可通过细胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，调节所有四系血细胞的生长和分化［4］。以往研究证实念珠菌多糖可刺激巨噬细胞释放细胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等［5，6］。这些细胞因子可调控造血细胞的增殖活动：IL-1、TNF可刺激内皮细胞产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF 和GM-CSF是使粒细胞和单核细胞的母细胞增殖分化的特异性诱导剂，并能刺激骨髓向外周血液释放成熟的中性粒细胞，缩短中性粒细胞的成熟期［7］。同时，CSF可作用于粒-单系祖细胞（CFU-GM），诱导其增殖分化。IL-1还能激活干细胞从G0期进入增殖周期，扩大干细胞池；可为早期干细胞对CSF起反应做准备，并诱导辅助细胞产生CSF及其他CK，从而间接调节造血。
β-葡聚糖是念珠菌重要的抗原决定簇［8］，单核细胞、巨噬细胞上都存在β-葡聚糖的特异性受体［9］。白色念珠菌的三种溶解性的β-葡聚糖，在结构上都是符合单核细胞、巨噬细胞上β-葡聚糖受体对于配体的要求，即能被特异识别β-（13）和β-（16）糖苷键［10］。巨噬细胞作为一类抗原递呈细胞（APC）摄取β-葡聚糖抗原，随后诱导性的表达高水平MHC，MHC与Th细胞上的TCR和CD4相互作用。使Th细胞功能增强，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T细胞的存活与增殖Th细胞被激活后刺激B细胞分化、增殖［11］。实验中，小鼠脾脏指数的明显增加、脾脏、骨髓细胞增生，说明了β-葡聚糖在升高外周血白细胞的同时，也对激活机体的整个免疫系统活性产生影响。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞和单核细胞的作用可能与各组β-葡聚糖能不同程度的被单核、巨噬细胞识别从而产生一系列细胞因子，刺激造血系统和促进中性粒细胞增殖有关。
免疫调节剂作为一种免疫治疗的药物已经广泛应用于临床。多糖作为一类免疫调节剂，不仅毒副作用小，资源丰富，而且具有明显的调节机体免疫系统的作用。本研究说明白色念珠菌β-葡聚糖尤其是不溶性的β-葡聚糖能显著增加小鼠脾重，并能对抗由CTX所致的小鼠脾脏萎缩及白细胞水平降低，是一种较好的免疫增强物质。
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关键词：液基薄层细胞学；常规细胞涂片；诊断；胸腹腔积液
随着我国的癌症发生率逐年增高，及早发现和准确诊断成为预防癌症进一步恶化的主要手段。目前，文献报道资料[1]较多的是胸腹腔积液细胞学检查。我院病理科于2013年3月～2014年12月检验胸腹腔积液样本96份，现报告分析如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 我院病理科于2013年3月～2014年12月检验胸腹腔积液样本96份，随机分为液基薄层细胞学组（A组）和常规细胞涂片组（B组），每组48例。其中男50例，女46例，年龄32～78岁，平均年龄（54.2±2.5）岁，胸腔积液44份，腹腔积液52份，两组患者的性别、年龄、胸腹腔积液分类均无显著性差异（P>0.05），具有可比性。
1.2检验方法A组检验方法为液基薄层细胞学法，具体方法：将收集的胸腹腔积液充分混匀后静置30min，将试管左右震荡20s，将其导入离心管中再加入清洁液，开始离心操作，转速为1000～2000r/min，时间为4～8min。待静置分层后，将上清液弃去，加入5ml缓冲液继续震荡20s，进行二次离心。将上清液再次弃去，静置15min，将离心管边缘的残液吸干，将标本滴于载玻片上，制片并染色后观察结果。B组通过常规细胞涂片法检验，方法如下：将收集的胸腹腔积液置于载玻片上，用棉签将多余的液体刮去，再取一干净棉签将其拉成大小为1.1*3.2cm，厚度为2cm的液体，于95%乙醇中固定，晾干后进行染色，观察结果。
1.3评级标准[2] 比较分析两种方法的细胞学检查结果，包括阴性率、阳性率，阳性率包括确诊癌发生率和可疑癌发生率。阴性诊断标准：涂片内不存在异性或不正常的细胞，或虽有异性细胞，但未出现恶性证据的迹象。阳性诊断标准：有可以恶性肿瘤细胞，但未加以确定，有高度可疑性或肯定可疑恶性肿瘤细胞。
1.4统计学处理 用SPSS15.0软件分析表中数据，计数资料用χ2检验分析，计量资料用平x±s表示，并且用t检验进行分析，有统计学意义的标准是P
2结果
见表1，A组的阴性率明显低于B组，而A组的阳性率包括确诊癌发生率和可疑癌发生率均高于B组，两组比较后差异显著（P
3讨论
近年来全球恶性肿瘤的发病率和死亡率居于所有疾病之首。而胸腹腔积液的检查显得尤为重要，是临床上较为常见的诊断方法，也是快速、可靠并且经济的途径。最早报道的方法是传统的细胞涂片法，液基薄层细胞学法被应用的越来越广泛[3]。
液基薄层细胞学源于妇科标本中的病理检查，现今，该技术主要应用于恶性肿瘤的检查。目前，较为常见的技术包括新柏氏TCT技术、超柏氏LCT技术以及利普液基细胞学LPT技术。液基薄层细胞学与传统的细胞涂片法相比具有独特的优势，主要体现在以下几点：①具有较低的漏诊率，而细胞涂片法漏诊率高的原因包括两方面，①由于恶性肿瘤的细胞分子量较大，挤压后容易靠近边缘，不易显示出来，②由于晾干时间过长导致细胞发生变性；②涂片质量提高，避免了大量红细胞、炎性渗出物以及黏液混杂在一起，使其观察结果更加清晰，涂片更佳均匀；③去除大量杂质，使细胞完整无损[4～6]。
本研究课题结果可知：细胞学检查结果显示，A组的阴性率明显低于B组，而A组的阳性率包括确诊癌发生率和可疑癌发生率均高于B组，两组比较后差异显著（P
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