时间：2024-04-02 11:46:59
关键词：教学模式；研究生；分子生物学
以团队为基础的教学（Team Based Learning，TBL）是在以问题为基础的教学（Problem-Based Learning，PBL）的基础上提出的一种新的教学方法。TBL以一个小型组织化的学习环境为条件，以引导学生自主探究、合作学习为抓手，以教师的有效教学和管理方式为手段，以提高学生的学习能力和综合素质为目标的一种学习模式[1]。高晓秋等[2]首次将TBL应用到西医外科学教学中。穆攀伟等[3]认为TBL教学适于现代医学教学的要求，值得在医学教育中引入和推广。宋京等[4]评价了TBL教学对医学生学习效果的影响，发现TBL教学对医学生学习有促进作用。作者在2014级研究生分子生物学教学中采用TBL教学进行了一些探讨，获得了一些体会，现总结如下。
1构建教学资源库
TBL教学模式是在PBL基础之上的以团队为基础的教学，是学生自我学习和团队合作为主导的教学模式。教师根据教学大纲安排教学内容，设计教学问题，学生根据教师设计的问题查阅资料和文献，寻求问题的答案。这就需要构建强大的学习资源库。鉴于研究生已经接触过一些分子生物学知识，我们没有选择一般的分子生物学教科书作为教材，而使用罗建红主编、科学出版社出版的《医学分子分子细胞生物学：研究策略与技术原理》作为教材，以学校图书馆提供的文本资料如中英文纸质教材和电子资源如中英文电子书与中英文文献数据库以及常用的分子生物学网站和精品课程网站链接作为学生学习的资料库，便于学生查阅和使用，全面培养学生的自学能力。
2设计教学主题
TBL教学需要学生具备分子生物学的一些基础理论知识，这样才有利于学生利用所掌握的知识去获取更多深层次的知识，学会运用这些知识去探索和解决分子生物学领域中的实际问题。根据研究生的分子生物学基础，设计八个主题进行TBL 教学，包括基因组学、基因克隆及表达技术、真核生物基因转录起始调控研究、非编码小RNA、蛋白质组学、动物基因修饰技术、肿瘤生物标志物的筛选策略、分子药物靶点的研究，结合教学主题设计教学内容和问题，保证教学的有序开展。
3教学的组织和实施
结合研究生的学习基础和专业将研究生分成8～10人为单元的学习小组，设组长一名。教师根据教学内容提前一周发放预习提纲和问题，组长根据组员特长对预习提纲和问题进行分工，各自自主学习，组长定期组织讨论，并各自写出读书报告。课堂教学中，学生先完成个人测试，教师再提出问题，由小组团队共同讨论完成，教师不直接提供答案。讨论完成后再发放测试卷，由教师评分，记录成绩。课堂结束前，教师总结学习情况和存在的问题，纠正错误的观念，补充学习的不足。
4教学评估
教学评估包括教师对教学效果的评估和学生对TBL教学模式的评估。教学效果的评估用期末测试来评估，学生评价采用问卷调查的形式进行。期末测试为闭卷考试，总分为100分。94名同学的平均成绩为（59.60±9.64）分，达到了教学的基本要求。学生问卷调查的结果见表1。由表1可知，TBL教学对增加习兴趣和加深知识掌握的效果一般，但对培养综合分析能力和自学能力、提高语言表达能力、促进学科间交流、加强师生间交流的效果好，提示TBL教学对培养学生的自学能力和创新思维是有效的。
5教学反思
分子生物学是我校医学研究生的公共必修课。学生来源于基础医学、临床医学、预防医学和护理学的各专业，均完成了全部本科医学课程的学习，并经历了临床实习甚至临床工作，有一定的知识储备和工作阅历，开展交流和讨论，可相互取长补短，实现教学相长[5]。通过师生的共同努力，取得了较好的效果。但其中还存在诸多的不足，需要我们改进和提高。首先，由于教师队伍经验不足，个别主题、问题和测试题选择欠科学；有必要加强知识储备，选择更合理的主题，提出合理的观点和思考题。其次，由于专业背景不同，就业方向不同，导致不同学生对分子生物学的感兴趣度也不一；部分学生学习目的不明确，对分子生物学重视程度低，对获取新知识的欲望不强，不喜欢合作学习讨论，参与的交流讨论少，还是依赖于老师的讲解和指导，以致学习效果不佳。在今后的教学中，教师应精心解读教材，熟练掌握教学内容，有的放矢地开展TBL教学，并适当补充传统的讲授式教学，保证教学质量的提高。另外，要在教学中强调课程学习的重要性，强化分子生物学在医学中的基础性地位，制作动画演示重要技术，增强内容的真实感，从而提高学生的学习兴趣，增强学生学习的主动性。相信随着TBL教学在分子生物学教学中的有序开展，通过老师们的不懈努力，该课程的教学质量将会不断得到提高。
总之，分子生物学是整个医学科学的基石，也是整个基础医学的前沿。张海波等[6]探讨了TBL教学法在实验教学中应当注意的问题，证实TBL教学法是医学分子生物学实验教学课程中值得推广的教学模式之一。TBL 教学能增强学生自主学习的能力，提高学生学习的积极性和主动性，培养学生的团队合作精神和科学思维能力[7]。本文通过在分子生物学课程中开展TBL教学，初步建立了分子生物学的TBL教学体系，积累了教学经验，学生的自学能力、综合分析能力、语言表达能力、交流能力和团队精神都得到了提高。但课程的教学改革任重道远，只要有一支高素质的教师队伍，认真开展多种形式的课堂教学，创新教学内容，注重学生基本理论和基本技能的培养，不断提高教学质量，相信能培养出具备坚实基础的复合型高级医学人才。
参考文献：
[1]Michaelsen L K，Sweet M，Parmelee D X.Team-based learning：small group learning's next big step[M].Jossey-Bass，2008.
[2]高晓秋，马武华.TBL教学法在西医外科学教学中的应用[J].中华医学教育探索杂志，2010，09（9）：1230-1231.
[3]穆攀伟，王庭槐，曾龙驿，等.在医学教育中引入以团队为基础的教学模式[J].中国高等医学教育，2011，25（1）：55-56.
[4]宋京，张东华，郭劲松，等.以团队为基础的教学模式对医学生学习效果影响的Meta分析[J].中国高等医学教育，2013（10）：65-66.
[5]斡保张佩.TBL教学法在研究生临床免疫学理论教学中的应用探索[J].中国免疫学杂志，2015（3）：408-409.
关键词:钾离子通道;结构;基因
离子通道(ion channe1)是跨膜蛋白,每个蛋白分子能以高达l08个/秒的速度进行离子的被动跨膜运输,离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输,不需要加入任何的自由能。一般来讲,离子通道具有两个显着特征:
一是离子通道是门控的,即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节,并通过开关应答相应的信号。根据门控机制,离子通道可分为电压门控、配体门控、压力激活离子通道。
二是通道对离子的选择性,离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度的选择性。根据通道可通过的不同离子,可将离子通道分为钾离子(potassium ion,K )通道、钠离子(natrium ion,Na )通道、钙离子(calcium ion,Ca2 )通道等。其中,K 通道是种类最多、家族最为多样化的离子通道,根据其对电势依赖性及离子流方向的不同,可把K 通道分为两类:①内向整流型K 通道(inward rectifier K channel;Kin),② 外向整流型K 通道(outward rectifier Khannel;K out)。K 是植物细胞中含量最为丰富的阳离子,也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子,它在植物生长发育过程中起着重要的作用,具有重要的生理功能。植物中可能存在K 通道,这一点早在20世纪6o年代植物营养学界就有人提出,而一直到80年代才被Schroeder等人[23证实,他们利用膜片钳(patch chmp)技术,首先在蚕豆(V/c/afaba)的保卫细胞中检测出了K 通道钾离子通道的结构单个钾离子通道是同源四聚体,4个亚基(subunit)对称的围成一个传导离子的中央孔道(pore),恰好让单个K 通过。对于不同的家族,4"亚基有不同数目的跨膜链(membrane。span。ning element)组成。两个跨膜链与它们之间的P回环(pore helix loop)是K 通道结构的标志2TM/P),不同家族的K 通道都有这样一个结目前从植物体中发现的K 通道几乎全是电压门控型的,如保卫细胞中的K 外向整流通道等,其结构模型如图2一a所示。离子通透过程中离子的选择性主要发生在狭窄的选择性过滤器(selectivity filter)中(图2一b),X射线晶体学显示选择性过滤器长1.2 nIll,孔径约nIll,K钾离子通道的作用.有关K 通道在植物体内的作用研究并不多。
从目前的结果来看,认为主要是与K 吸收和细胞中的信号传递(尤其是保卫细胞)有关。小麦根细胞中过极化激活的选择性内流K 通道的表观平衡常数Km值为8.8 mmol/L,与通常的低亲和吸收系统Km值相似[ 。近年来,大量K 通道基因的研究表明,K 通道是植物吸收转运钾离子的重要途径之一。保卫细胞中气孔的开闭与其液泡中的K 浓度有密切关系。质膜去极化激活的K 外向整流通道引起K 外流,胞质膨压降低,导致气孔的关闭。相反,质膜上H.ATPase激活的超极化(hyperpolarization)促使内向整流钾离子通道(K in)的打开,引起K 的内流,最终导致气孔的张开钾离子通道相关基因及其功能特征迄今,已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多种K 通道基因(图3),根据对其结构功能和DNA序列的分析,可以把它们分为5个大组:工,Ⅱ,Ⅳ组基因属于内向整流型通道;m组属于弱内向整流型通道(weakly inwardAKT1Arabidopsis K Transporter 1)是第一个克隆到的植物K 通道基因,采用酵母双突变体互补法从拟南芥cDNA文库中筛选出来cDNA序列分析表明,AKT1长2 649 bp,其中的阅读框为2 517 bp,编码838个氨基酸残基组成的多肽,相对分子质量约为95 400 Da。AKT1编码的K 通道,对K 有极高的选择性,其选择性依次是K >Rb >>Na >Li 。
Northern blot分析表明,AKT1组织特异性较强,主要在根组织中表达ZMK1(Zea mays K channel 1)是从玉米胚芽鞘中分离出的K 通道基因,在皮层表达。在卵母细胞中的表达表明,ZMK1编码的K 通道是通过外部酸化激活的。有研究表明,蓝光对ZMK1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影响[3 2l。1组KAT1组基因编码内向整流钾离子通道,其与AKT1组基因产物结构上的最大区别是在COOH端没有锚蛋白相关区(枷n—related do—main,ANKY)。KAT1组基因主要包括KAT1,KST1,SIRK,KZM1,KPT1等。KAT1(Arabidopsis inward rectifier K channel1)是与AKT1同时从拟南芥cDNA文库中筛选出来的植物K 通道基因。KAT1基因的阅读框含有2 031个核苷酸,编码的多肽由677个氨基酸残基组成,相分子质量约为78 000 Da。KAT1的表达具有组织特异性,KAT1在拟南芥植株中的主要表达部位是保卫细胞,在根和茎中也有少量的表达。人们认为KAT1通道可能参与了气孔开放,并向维管组织中转运K ,而不是直接从土壤中吸收KJ。
以KAT1为探针,又能从拟南芥cDNA文库中筛选出KAT2等功能类似的内向整流型K 通道基因通过基因工程技术,人们已相继开展了将KATI和AKTI基因导人到拟南芥、烟草和水稻的研究,并获得了一些转基因植株。比如,施卫明等利用根癌农杆菌介导法已成功地把KAT1和AKT1导人拟南芥和野生型烟草中,并获得了转基因植株及其纯合株系,发现转基因植株的吸钾速率和对K 的累积能力都比对照的有明显的提高,而且,经过分子检测,也证实711和AKT1基因在转基因植株中得到了整合和表达。因此,运用现代分子生物学手段和基因工程技术筛选高效利用钾的作物品种或利用现有的钾离子通道基因改良作物品种,从而提高作物本身的钾吸收利用能力应该是目前主要的研究方向。可以相信,随着分子生物学技术、基因工程技术和有关分析测试技术的发展和应用。随着研究工作的不断深入,有关钾离子通道基因的分离、克隆和利用会取得更大的进展。
参考文献:
1.J Langer K,Ache P,Geiger D,et a1.Polar potassiumⅡalIspclnerscapable of controlling Khomec~tasis and K 一dependent圳0gm—esislJJ,ThePlant Journal,2OO2,32:997—1009.
2 .Schroeder JI,Hedrich R.Potassium-selective single channels inguard cell protoplasts of Vicia ba[J].nature,1984,312:361— 363.
3 . Jacqueline MG,Declan AD.Potassium channel structures:do theycomform[J].Current Opinion in Structural Biology,20O4,14:440—446.
4 . Mackinnon R,Zhou YF.The occupancy of ions in the K selec—tivity filter:ch~se balance and coupling of ion binding to a proteinconformational change undedie hish conduction rates[J].JMB,2003,333:965—975.
5. Mackinnon R,Zhou M.A mutant KcsA K channel with alteredconduction properties and selectivity filter ion distribution[J].JMB,2O04,338:839—846.
关键词：松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）；分子生物学；基因克隆；基因表达；农药胁迫
中图分类号：S763.38；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1201-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.07.001
Reviews on Molecular Biology of Monochamus alternatus Hope
LIU Qi-si， CHEN Jing-xiang， LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）
Abstract： Monochamus alternatus is a major forest pest that damages trees such as Pinus massoniana and is the main medium of pine wood nematode. In the paper，the latest progresses in the field of molecular biology were reviewed from five aspects including fundamental research of molecular biology，molecular classification and identification，construction of cDNA library and transcriptome analyses，gene cloning and insecticides stress on gene expression of M. alternatus et al，which may provide new references for fundamental research and the control of M. alternatus.
Key words： Monochamus alternatus Hope； molecular biology； gene cloning； gene expression； pesticide stress
松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛、松天牛，`属于鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae）沟胫天牛亚科（Lamiinae），分布于中国的自治区以东，河北省以南、东至台湾省、南至广东省区域；国外分布于日本、朝鲜、老挝等[1]。主要危害马尾松（Pinus massoniana）、油松（P. tabulaeformis）、黑松（P. thunbergii）等生长衰弱的树木或新伐倒树木[2]，是中国南方松林的重要蛀干害虫。同时，它又是松树毁灭性病害松材线虫[Bursaphelenchus xy-lophilus（Steiner et Buhrer） Nicle]的主要媒介昆虫。在日本和中国，该病虫主要通过羽化后的松墨天牛成虫补充营养和产卵时造成的伤口侵入健康树木进行自然传播，给松树造成重大损失[3，4]。因其为害严重且防治困难已被许多国家列为检疫对象。近年来，松墨天牛分子生物学研究进展迅速，新的研究成果不断涌现，本文综述近3年来松墨天牛分子生物学研究的最新进展，以促进松墨天牛基础研究，并为探索松墨天牛安全有效的防治方法提供参考。
1 分子生物学基础研究
1.1 松墨天牛成虫标本保存方法
DNA作为生物体重要的遗传资源，包含着丰富的生物学信息，是生物进化史的重要记录者，获取高质量的基因组DNA是开展任何DNA下游工作的前提和基础。因此，研究昆虫标本的妥善保存方法，以及基因组DNA提取方法，阻止或延缓其基因组DNA的降解，对深入开展其分子生物学研究具有重要意义。曲良建等[5]采用SDS-蛋白酶K消化法对液氮中冷冻保存、无水乙醇-20 ℃冷冻保存、无水乙醇室温保存和干标本室温保存且保存时间在2年以上的松墨天牛成虫标本基因组DNA进行提取，并对不同保存方式提取的DNA样本进行了质量比较和分析。在上述常见的松墨天牛成虫标本4种保存方式中，以液氮中冷冻保存效果最佳，其次为无水乙醇 -20 ℃冷冻保存，插针干标本室温保藏效果最差。利用昆虫线粒体基因COⅠ和COⅡ的通用引物从上述DNA中均能够成功扩增出目的片段，测序结果证实扩增片段符合预期。研究结果表明液氮和无水乙醇-20 ℃冷冻保存适合松墨天牛成虫标本长期保存，且不影响后续的PCR扩增和测序。
1.2 松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定
实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）是分子生物学领域研究基因表达的最有效方法之一[6]。在RT-qPCR实验过程中，需要引入内参基因对数据进行校正和标准化处理。冯波等[7]从松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因（Actin，TUB，18S rRNA，RPS27A，RPS3，RPL10，AK，GAPDH和EFlA），其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定。结果显示最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因为GAPDH和TUB，并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。该研究结果为利用RT-qPCR技术分析松墨天牛化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了参考。但不同组织在不同条件下内参基因的选择还要视具体研究情况而定，需要进行实验验证。
2 分子分类方法及鉴定
2.1 核糖体28S rDNA基因和18S rDNA基因
张健等[8]对天牛科4亚科32种天牛的28S rDNA基因部分序列进行测定和分析，结果证明了天牛科各亚科的单系性以及异天牛亚科应为较原始类群，并认为28S rDNA序列是一种有效的解析天牛科高级分类阶元系统发育关系的分子标记。魏子涵等[9]采用18S rDNA（V4、V7区）分子标记，分析和测定了49种天牛基因序列，并对天牛总科3科6亚科的70种天牛基因序列构建进化树，结果显示沟胫天牛亚科（Lamiinae）、天牛亚科（Cerambycinae）、锯天牛亚科（Prioninae）和瘦天牛科（Disteniidae）为单系性进化群，这与传统形态学分类结果相似，证明18S rDNA（V4、V7区）是探讨天牛高级阶元分类有效的分子标记。在这两项研究的基础上魏子涵等[10]利用28S rDNA D2和D3区以及18S rDNA V4和V7区联合序列成功构建出了天牛总科高阶元的系统发育树，表明联合序列分析是探讨天牛高阶元分类的有效方法。
2.2 线粒体COⅠ基因和线粒体COⅡ基因
郑斯竹等[11]测定分析了11种墨天牛线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因（COⅠ），构建了墨天牛属的分子进化树，结果显示分子结果与形态分类结果相似，本段COⅠ基因可以为墨天牛属分类阶元关系提供依据。李京等[12]研究测得了沟胫天牛亚科部分种类的COⅡ序列，发现族、属、种各阶元间序列差异适中，具有广泛的适用性，并认为COⅡ基因是沟胫天牛亚科分子系统学研究的有效工具。
2.3 DNA条形码在墨天牛鉴定中的应用
为了对进境口岸截获的俄罗斯木材中的墨天牛属（非中国种）害虫进行嗜贰⒖焖俚募定，陈梦义等[13]利用DNA条码试剂盒检测技术，基于墨天牛线粒体COⅠ（线粒体细胞色素氧化酶亚基I）基因设计1对巢式引物，对截获墨天牛属中的8个种COⅠ进行扩增，将扩增序列上传至有害生物信息网站，依据碱基位点在不同种间的排列和组成的差异，获得不同种在相应位点上的特有碱基，即标记性碱基，以此作为区分墨天牛种的依据。通过这种墨天牛属DNA条码试剂盒检测技术，可为口岸检疫鉴定提供有效的技术手段。
3 转录组与cDNA文库
3.1 松墨天牛转录组
Lin等[14]通过Illumina测序和从头组装共获得48 787条Unigenes序列，平均长度为721 bp。NR注释的结果表明，78.1%的序列与赤拟谷盗的序列相似性最高。Unigenes的GO分类显示，共有13 485个转录本归属于至少一个GO条目，包括60个功能组，其中在生物过程中，“细胞过程”、“代谢过程”和“单生物过程”包含的基因较多；细胞学成分中，大多数基因集中在“细胞”、“细胞组分”或“细胞器”；在分子功能中，“催化活性”和“binding”中的基因最多。代谢通路分析结果显示在KEGG中可显著比对上18 915个Unigenes，归属于258个通路，代谢通路中的基因数量明显多于其他通路。在NR比对上的序列中有9 005条归属于COG中，25个COG类别中，与基础生理和代谢功能相关的基因最多。在此基础上，鉴定出与杀虫剂解毒和杀虫剂靶标酶相关的基因转录本。上述研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。
3.2 松墨天牛触角cDNA文库
高雄[15]挑取2 052个单克隆进行测序，得到1 133条Unigenes，其中多拷贝contigs有276个，单拷贝singlets有857个。通过预测开放阅读框，计算得到松褐天牛触角cDNA文库GC含量为41.8%。通过与COG功能比对350条Unigenes被分到了21个功能类群。
王娟[16]构建了松褐天牛触角转录组，共获得85 869条contigs序列，平均长度为297 bp；获得37 242条Unigenes序列，平均长度为669 bp。NR注释的结果表明，94.3%的Unigenes与赤拟谷盗[Tribolium castaneum（Herbst）]和中欧山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae Hopkins）的Unigenes相似性最高。对Unigenes按照COG功能注释，可分为25个功能群，其中一般功能预测类，复制、重组和修复类包含的Unigenes个数最多。进一步筛选比对共获得OBPs基因全长序列25条，片段序列4条；化学感受蛋白（CSPs）全长序列8条，片段序列4条；气味受体（ORs）全长序列1条，片段序列8条；1条感觉神经元膜蛋白（SNMPs）全长序列。上述研究结果为开展松褐天牛气味结合蛋白和嗅觉识别机制的研究奠定了基础。
4 基因克隆
4.1 气味结合蛋白基因
利用引诱剂可以有效地防治松褐天牛。为进一步加强引诱剂和天敌的应用研究，研究人员开展了关于松褐天牛气味结合蛋白的初步研究工作，以期通过对松褐天牛嗅觉识别机制的研究，为有效开发更加适合的引诱剂提供研究基础。
钱凯等[17]通过配体结合位点推测Minus-C OBP蛋白亚家族的MaltOBP2和MaltOBP6两个基因具有不同的生理功能；通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别，或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能。该研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础，为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件。
Gao等[18]克隆得到了松墨天牛4个OBPs基因MaltOBP2、MaltOBP3、MaltOBP4和MaltOBP5的全长，成功构建松褐天牛OBPs基因原核表达载体pGEX-6p-1-MaltOBPx，并通过竞争结合实验以1-NPN为探针研究MaltOBP3和MaltOBP5与17种挥发物的结合能力。结果表明，MaltOBP3和MaltOBP5能特异性地结合部分寄主挥发物，它们可能与松墨天牛的寄主选择和定位有关。但尚未涉及对其功能的研究[18]。
王娟[16]成功克隆了松褐天牛Malt OBP9、Malt OBP10、Malt OBP19、Malt OBP21、Malt OBP24基因，其中Malt OBP9和Malt OBP21属于Minus-C OBPs，Malt OBP10属于Classic OBPs，Malt OBP19和Malt OBP24属于Plus-C OBPs。利用荧光竞争结合实验测定这5个Malt OBPs在中性和酸性pH环境下与18种寄主植物挥发物单体的结合特性。结果显示5个Malt OBPs在中性pH环境下与挥发物的结合能力高于酸性pH环境。在中性条件下，Minus-C OBPs家族的2个Malt OBPs结合特性方面表现较为一致；Plus-C OBPs家族的2个Malt OBPs结合特性方面表现出较大差异。
以上研究均在松墨天牛触角cDNA文库和转录组的构建基础上开展，为明确松褐天牛气味结合蛋白的功能，研制行为调节剂，以及明确气味结合蛋白在昆虫体内的功能奠定了重要基础。
4.2 肌钙蛋白基因与原肌球蛋白基因
肌钙蛋白（Troponin，Tn）是与骨骼肌和心肌收缩有关的调节蛋白，主要调节肌肉的收缩和舒张。由于昆虫飞行肌以很高的收缩频率运行，肌钙蛋白的激发和松弛的调节就发挥尤其重要的作用[19]。原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，在肌肉收缩中起重要调节作用。
吴华俊等[20]研究推测松墨天牛肌纤维中存在多种TnT转录本，它们与其他调控因子共同影响肌肉的收缩。但MaTnT有多少转录本，MaTnT转录的时空表达模式如何，以及MaTnT如何与原肌球蛋白互作等仍需要进一步研究。吴华俊等[21]还从已经构建的松墨天牛cDNA文库中筛选并鉴定了一个肌球蛋白轻链2基因，命名为MaMLC-2。软件预测发现MaMLC-2属于肌钙蛋白C超家族成员。该研究发现MLC-2蛋白具有保守地结合Ca2+的功能，其在成虫足中的表达量最高，这与足是主要的运动器官，含有丰富的肌肉蛋白有关。罗淋淋等[22]研究推测松墨天牛在取食松科植物的时候，原肌球蛋白能够促使松树产生诱导性防御。
4.3 其他基因
许雯等[23]分析了松墨天牛表皮蛋白（MoalICP）基因在幼虫各组织中的表达量，发现MoalICP在这些组织中均有表达，说明其表达产物可能参与相应器官的结构形成、蜕皮与变态，也可能与阻止外来物质（如农药）的侵入有关。研究还发现体壁中表皮蛋白基因表达量不是最高的，在脂肪体中的表达量更高，推测脂肪中的表皮蛋白基因参与表皮渗透能力更加显著，与抗药性的产生关系密切。罗淋淋等[24]在松墨天牛铁蛋白亚基中发现了1个糖基化位点。昆虫铁蛋白亚基在细胞内质网和血淋巴中，通常糖基化，这可能增强其稳定性，并且有助于在胞内靶向目标和受体结合[25]。蔡紫玲等[26]研究发现松墨天牛葡萄糖-6-磷酸异构酶（MaGP1）为亲水蛋白，含有活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肤结合位点5个功能位点，为进一步研究MaGPI的分子功能提供了依据。
5 农药胁迫λ赡天牛基因表达的影响
5.1 肌肉LIM蛋白基因
昆虫LIM蛋白具有许多类似于脊椎动物肌肉蛋白的特征，有调控昆虫飞行的作用。罗淋淋等[27]通过PT-qPCR方法研究在农药胁迫下松墨天牛LIM基因（MaLIM）的相对表达量，发现噻虫啉的抑制作用最大。研究推测，在农药亚致死剂量作用下，松墨天牛蛹期蜕皮过程和生长发育功能会受到显著影响。
5.2 延伸因子2（EF-2）基因
延伸因子（elongation factor，EF）是参与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，在所有多细胞生物体的新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用，它包括延伸因子EF-1和延伸因子EF-2[28]。EF-2的正常表达关系到机体细胞的生长及蛋白质的合成。罗淋淋等[29]检测了经农药胁迫后，EF-2 mRNA在松墨天牛成虫中的表达情况，结果显示该基因在啶虫脒作用后的相对表达量最高，其次是杀虫双，绿僵菌和白僵菌的胁迫作用无显著差异，毒死蜱和灭多威的作用效果较弱。不同杀虫剂作用下均导致该基因上调表达，这可能是松墨天牛产生的自我保护反应。
5.3 包囊蛋白基因
包囊是无脊椎动物对抗外源物质的主要防御反应，包囊蛋白（encapsulation-relating protein，ERP）是昆虫产生包囊反应时最先在外来物周围积聚的蛋白[30]。毛珊珊等[31]检测发现松墨天牛ERP（MaERP）经澳氰菊酷、磷化铝、Bt、印楠素、绿僵菌胁迫后，上调表达；经阿维菌素胁迫后，下调表达。该研究为进一步研究MaERP基因在松墨天牛防御过程中的作用奠定了基础，可为探索松墨天牛免疫系统与分子毒理互作关系提供参考。
5.4 核糖体蛋白（RPS15A）基因
核糖体（Ribosome）是细胞内负责蛋白质合成的重要细胞器。核糖体蛋白（Ribosomal protein，RP）和核糖体研究一直是遗传学研究的重要领域。罗淋淋等[32]利用RT-qPCR分析了松墨天牛成虫核糖体蛋白（RPS15A）基因在农药胁迫下的表达量，结果表明，仅溴氰菊酯处理组上调表达。但核糖体蛋白表达量与杀虫剂抗性的关系究竟如何，是通过核糖体蛋白与杀虫剂结合起作用，还是通过核糖体蛋白质间的作用而发挥抗性作用，抑或为其他作用机制还需进一步探究。
5.5 氯胺磷、吡虫啉、溴氰菊酯胁迫下对基因表达的影响
氯胺磷低毒、高效、安全，是中国具有自主知识产权的有机磷杀虫剂创新品种；吡虫啉是新烟碱类杀虫剂，已成为中国取代剧毒有机磷杀虫剂的骨干品种；溴氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂，能杀灭对有机磷农药等产生抗药性的害虫。Lin等[33-35]比较研究松墨天牛对这3种农药分子响应的差异，筛选出差异基因和分子靶标。研究结果表明，细胞色素氧化酶亚基I基因在解毒代谢中有特殊作用，表皮蛋白基因没有参与对这3种农药的抗性；ATP合酶亚基D基因、线粒体酰基载体蛋白1基因等氧化磷酸化通路基因下调，说明氧化磷酸化引发了毒理学变化，这些蛋白质磷酸化的影响可能是有机磷农药、吡虫啉、溴氰菊酯的毒性机制之一，改变昆虫磷酸化水平的蛋白质可能是这些杀虫剂的非传统靶标；吡虫啉、氯胺磷胁迫下，编码丝氨酸蛋白酶、细胞色素P450还原酶、保幼激素酯酶、过氧化物酶和硫氧还蛋白半胱氨酸蛋白酶的基因转录水平下降，表明这两种农药可延缓抗药性并阻碍松墨天牛的发育；GO富集比较分析表明，在3种农药胁迫下，分子功能中“催化活性”富集的基因最多，细胞成分中“细胞”和“细胞组分”富集的基因最多，而生物学过程中，3种农药富集的GO不一致，这表明3种农药在对松墨天牛的毒性机理上有较大差别。
上述研究使用基因芯片作为研究平台，具有集约化、系统化和高通量分析的优点，为鉴定新农药、确定农药的生物选择性奠定理论基础；对以不同类型农药的准确的分子靶标为基础和依据，科学、经济、合理地选用和交替使用不同杀虫机理的农药，有针对性地防治害虫，避免或延缓害虫的抗药性，提高防治效果等具有重要意义。
6 展望
近3年来，松墨天牛分子生物学领域的研究从个别基因的克隆发展到转录组水平，为高通量研究基因奠定了基础；从单纯的生物信息学分析发展到结合生理学、毒理学及化学生态学等综合研究，充分展示了分子生物学的研究优势。基因芯片作为一种研究平台，可用于分子毒理学研究，有助于新型杀虫剂的开发和推广应用。此外，借助于分子分类方法，可对传统形态分类学进行有益的佐证和完善；松墨天牛保存方法和RT-qPCR内参基因的筛选等基础研究对松墨天牛分子生物学起到一定的推动作用。
分子生物学既是一种研究手段，也是一个重要的研究方向。松墨天牛分子生物学的研究日益深入，必然会对松墨天牛生物学、生理生化、化学生态等起到重要的引领作用，并以此为基础，为松墨天牛的综合治理提供理论支撑和应用参考。
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关键词 研究生；分子生物学；实验教学；教学改革；师范院校
中图分类号 G40-056 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0336-01
分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的一门科学[1]。自20世纪50年代以来，分子生物学已发展成为当前生命科学发展的主流，是目前最具潜力、最迅速的生命学科之一，成为研究生物学及相关科学的一个有力工具[2-3]。加强分子生物学实验教学，不仅有利于培养学生掌握分子生物学的理论基础知识和实验操作技能，而且有利于培养学生形成正确的科学研究素养和创造思维精神，让学生更好地进入科学研究领域[4]。
1 面临的问题
师范院校研究生的分子生物学基础较为薄弱，学生大部分来源于省市级师范院校，“985”和“211”高校生源较少。师范类院校本科教育以培养中学教师为目的，更注重培养学生的理论知识，对学生的实验动手能力、创造性思维能力、科研素养等重视不够。同时，所读本科师范院校为省市级院校，学校师资、实验条件、资金等条件一般，较难进行系统规范的分子生物学实验教学。
当前师范院校硕士研究生培养时间为3年，学生进校第1年要进行文化课程学习，第3年要提前写毕业论文，做科研的时间相对较短。分子生物学是一门实践操作性很强的课程，大部分研究生的课题研究都需要用到。如何在较短的时间里提高学生的分子生物学理论知识水平，培养学生扎实的实验操作能力，增强分子生物学的科研素养，让学生更好地进入科学研究领域是分子生物学实验教学面临的最主要问题。
2 改革的主要内容
2.1 师资队伍
师资队伍是分子生物学实验教学首要环节。教师必须具备较强的科研素养，具有较长的分子生物学研究经历及不断获取国际先进技术和经验的能力。由于分子生物学的特殊性，教师最好具有在国外较有影响的分子生物学实验室学习工作的经历；同时，要承担有国家、省部级的科研课题。做为师范院校的学生，实验操作能力的提高是目前最为迫切的任务。分子生物学实验是非常细致的操作，因此具有较好的操作技能、未离开科研实验工作第一线的老师的实验演示对学生实验技能的掌握具有重要作用。同时，兴趣是最好的老师，教师对科研工作特别是对分子生物学的精到理解，对学生科研兴趣的培养尤为重要。具有较高造诣的分子生物学专任教师任教，有利于培养学生形成正确的科研精神和创新思维。要加大师资队伍建设，要让优秀的分子生物学专业且仍在科研实验工作第一线的教师投入到分子生物学实验教学的工作中。
2.2 实验平台
实验平台是分子生物学实验教学的重要保障。分子生物学实验要用到较多大型的实验仪器，如PCR仪、分光光度计、冷冻高速离心机、凝胶成像系统等，需要投入大量的资金购买必备的实验仪器。另外，分子生物学实验对实验场地的要求较高，为保证教学效果，每位学生基本要做到每人独立实验。因此，在加强实验平台的建设上，要加大资金投入，建立独立专门的研究生分子生物学实验室；要让实验仪器公开化、常态化，提高实验仪器的使用率；要让每一个学生都有足够的机会操作实验仪器，让每个学生都能熟练掌握常用的分子生物学实验仪器。
2.3 教材教学
教材教学是分子生物学实验教学的核心内容。师范院校研究生的生源不一，分子生物学基础差异较大，学生在研究生期间开展的课题对分子生物学掌握程度的要求又一样。因此，教材教学显得尤为重要。
2.3.1 科学研究与实验教学相结合。打破传统的固定化的教学模式，更新陈旧的教学内容，把科研素质培养放在实验教学的第一位。教师要把科学研究的思维灌注于整个分子生物学实验教学过程中，适时将任课老师的科研项目引入到实验课程中来。研究生进入学校后，都会较早地了解自己在研究生阶段即将开展的课题的大致方向，因此要把实验教学与科研项目和研究生各自的课题联系起来。教师要以科学研究的指导思想来引领和统筹开展实验教学。
2.3.2 教材讲授与专题讲座相结合。在教学内容上，教材讲授与新进展专题讲座相结合，注重科学研究的新发展，要适时邀请相关领域较有造诣的教授就某些专题进行报告。分子生物学是一门发展中的学科，注重科学研究的前沿讲授，让学生及时了解分子生物学的最新发展尤为重要。专题讲座有利于拓宽学生的科研视野，提高学生的科研思维能力，增强学生的科研素养，培养学生的科研兴趣，让学生及早由本科生的教材学习向研究生的科学研究过渡。
2.3.3 基础实验与研究实验相结合。基础实验包括质粒DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定、PCR技术、DNA的纯化、载体的构建、感受态细胞的制备、细胞转化、重组子鉴定、RNA提取等常规分子生物学实验。同时，让学生根据自己的课题科研需要，自主查阅资料设计实验，利用基础实验的常规技术进行研究实验。在实验过程中，任课老师可以定期组织学生汇报，也可附以邮件等方式及时解决实验问题。研究实验以上交毕业论文的形式进行考核，学生均要按照课题研究背景、研究目标、研究意义、实验方法、实验结果、分析讨论进行撰写论文，同时以小型答辩的形式让学生进行汇报，让学生参与讨论相互学习。基础实验培养学生的基本操作能力，研究实验提高学生运用分子生物学技术进行科学研究的能力和学生的科研创造力。
3 结语
分子生物学是研究生课程教学中一门重要而又相对难学的课程。随着分子生物学在生命科学领域的应用不断深入，分子生物学实验技能的熟练掌握、运用分子生物学技术的能力对学生科学研究越来越重要。只有通过分子生物学实验教学的不断改革，才能迅速提高学生的分子生物学实验操作能力、有效增强学生的科研素质，为研究生科学研究工作的迅速开展奠定基础。
4 参考文献
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【关键词】 肠道病毒 71型 基因型 分子流行病学
Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic， replication， diagnosis technology， EV type identification and molecular epidemic science.
Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science
近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。
1 病毒的一般特征
1.1 病毒颗粒结构及理化性质 肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员［1］。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPI.VP3上（见图1）。由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。
图1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构（略）
1.2 基因组结构［2］ EV71基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，腺嗓吟核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U=52.8)，病毒的的单链具有侵染性。基因组中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2193个氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，在其两侧分别为746个核苷酸的5’-非编码区(UTRs)和83个核苷酸的3’-非编码区。在3’-非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)，而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白编码IA(多肽VP4)、IB(多肽VP2)、IC(多肽VP3)、ID(多肽VP4)四个病毒外壳蛋白;P2前体蛋白编码ZA(特异性蛋白酶)、2B、2C;P3前体蛋白编码3A、VPg(5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组份)。病毒的单链RNA具有感染性。病毒RNA正链和负链的5’末端和3’末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号。VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS’末端的pUPU形成磷酸二酷键与基因组RNA结合。5’ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译的过程中发挥重要作用。此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。EV71病毒基因组3‘UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚。
2 病毒的复制
EV71基因组的复制类似于其它正链RNA的病毒。当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始进行复制。病毒基因组RNA首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用下合成负链RNA。后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。体外实验证实:病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋白VPg以及一种以上的宿主细胞蛋白。随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代毒粒的组装阶段。由于蛋白酶3C或3CD的增多以及活性的增强，加速了Pl前体蛋白的切割。其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg一阴A形成病毒子粒［2］。一般情况下，肠道病毒的原病毒毒粒无感染性，经过蛋白酶的再加工(水解切割P1，产生钾1一4多肽)才产生有感染性的病毒粒子［3］。
3 EV的诊断技术
3.1 核酸杂交技术 由于EV各型间存在序列高度保守区，利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大范围的EV诊断［4］。杂交技术已能成功地检测出可疑病例临床标本中的EV RNA［5］，而且原位杂交技术可以提供病毒感染的组织细胞分布及其与炎症和坏死之间的关系的信息［6］。但是核酸杂交技术过程较复杂，且敏感性不太高，特别当用于检测脑脊液中RNA时。
3.2 逆转录(RT)PCR技术 根据EV属特异性的高度保守序列设计其通用引物，为提高其检测敏感性，进行套式PCR能够检出包括无法进行细胞培养和定型的大部分EV分离物，还可直接从临床标本中检测EV核酸，整个过程一般在5h左右完成［7］。周世力［8］利用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因，经序列测定证实后，构建重组表达质粒VP1/pPIC9K，转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115，以MycTag多克隆抗体作为一抗，利用双层滤膜法筛选酵母转化子，甲醇诱导表达。SDSPAGE分析显示:表达产物的分子量约为30 000，与天然VP1大小一致;表明，表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应，表明重组蛋白VP1具有免疫原性。
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4 EV型别鉴定
诊断后其型别鉴定的方法主要有:将PCR结合细胞培养进行型别鉴定或者对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析或进行单链构象多态性分析(PCRSSCP)或进行基因序列测定与遗传性分析等来定型分类。而在结构蛋白编码区，据Oberste等研究，VP1区核酸序列与决定血清型的抗原决定因子密切相关，根据VP1区序列进行分型结果与中和试验鉴定结果一致性较好，与血清型相关性较其它结构蛋白编码区高［9］。但也有研究表明VP4的分型结果与血清也较一致，且因其核酸序列较短(VP4207nt，而VP1834～951nt)，应用更为便利［10］。Oberste等根据对EV遗传性分析的结果，提出根据VP1基因全长或部分序列同源性大小进行型别判定的标准。将被检序列与含所有EV血清型参考株序列的数据库(如Genbank)进行比对，如果被检株序列与某一型参考株同源性最高且>75%，同时与同源性位居其次的另一型参考株同源性
图2 重组表达载体pGEX5x1/VP1结构（略）
图3 SOSPAGE电泳分析表达（略）
图4 Western Blot鉴定原核表达的EV71 VP1蛋白（略）
5 分子流行病学
目前EV71分子流行病学主要研究内容是VPI基因、VP4基因和5’价R区的变异。其中，VPl基因最具研究价值，这是因为:(1)VPI蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性(Oberste等，1999);(2)VPI基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性;它不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。周世力［14］对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(台湾98年、日本99年、及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的结构蛋白基因进行遗传进化分析。方法在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上，利用DNASTAR软件对结构蛋白基因进行遗传进化分析。结果SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近，而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。结论我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年EV71大规模流行时的毒株。崔爱利［15］2002～2003年从上海市和重庆市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒，其中上海9株，重庆1株。利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物，用RTPCR方法对病毒进行初步鉴别。根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同，可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别。提示，上海分离到的9株病毒中，有2株为EV71，其余7株病毒为Cox.A16;重庆分离到的1株病毒为EV71。10株病毒的RTPCR产物经序列测定和分析证实，PCR定型结果正确，说明PCR法具有很高的特异性，可作为EV71初步鉴定的首选方法。对所分离的3株EV71病毒进行VP1区编码基因全序列的测定和遗传学分析，通过同源性比较和构建系统发生树发现，此3株EV71病毒和中国大陆已发表的7株EV71病毒(SHZH03、SHZH98、SHF1、SHF2、SHH25、SHH26和CHN87)全部属于C基因型，与该型代表株比较，同源性为89.3%～94.6%;与A、B基因型代表株比较，同源性为81.3%～84.0%，差异较大。在C基因型中，此3株EV71病毒和中国大陆先前分离的6株病毒(SHZH03、SHZH98、SHF1、SHF2、SHH25、SHH26)的同源性较高，在94.5%～100%范围内。在系统发生树上，这9株病毒形成一个较独立的分支。与CHN87株的同源性在92.1%～93.6%之间。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较，同源性在89.3%～92.9%，差异≥7%，因此认为可将这9株病毒划分为C4亚型。上海、重庆和深圳的EV71病毒有较高的同源性，提示该病毒EV71C4亚型在中国大陆1998～2003年间有较广泛的传播。杨帆［16］对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHzH98基因组建立了覆盖全基因组的5个首尾重叠的克隆，并在此基础上进行了全基因组(未包括多聚腺普酸尾)7408个碱基的核普酸序列测定。数据分析表明，SHZH98株与其他EV71毒株相比，5‘UTR和3’UTR的长度和序列有一定的差异。同源性分析发现，与免疫源性密切相关的PI结构蛋白基因与台湾流行株的同源性最高，与欧美流行株的同源性较低，PZ，P3区非结构蛋白基因的同源性与CoxsakiEVirusA16及MS，BrCr株较高，而与台湾流行株相比则较低。遗传进化分析发现，SHZH98株结构蛋白基因与台湾流行株亲缘关系较近，而非结构蛋白基因与CoxsakiEVirusA16及MS，BrCr株的亲缘关系较近。见图5。
图5 EV71 SHZH98株基因结构示意图（略）
综上所述，目前EV71感染仍然是全球威胁性较大的病毒性疾病之一，尤其在东南亚其危险性更大，但到目前为止，病毒的变异较大，其不同型别或同一型别在不同时间、不同地区乃至不同个体引起了不同的临床表现，EV71众多的病毒型别是怎么形成的，其基因组测序的结构的差别和病毒功能的关系是什么尚不清楚。目前不同型别病毒全基因测序在增多，病毒基因结构和功能的关系应是当前的热点。
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末端端粒的长度，随着年龄的变化而变化。因此，可以用分子生物学方法准确推测年龄。
【关键词】d型／l型天冬氨酸，碱基加合物和正常碱基，端粒，分子生物学，年龄
【中图分类号】13919．2；075
【文献标识码l a
【文章编号】1007—9297(20__)01—0040—02
在法医学实践中，经常需要对无名尸体、组织碎块进行
年龄估计。一般情况下应用法医人类学方法对牙齿、骨骼
等检材估计个体年龄。而在很多情况下，现场仅有组织碎
块存在，或者有的部位的骨骼不适合精确估计年龄，在这种
情况下用分子生物学方法估计年龄，尤为重要。体内的许
多物质随着年龄的变化而发生改变，目前有几种物质随着
年龄的改变而发生变化，一种是质的变化，一种是量的变
化。
胶质原存在于人体的各种组织、器官中，胶质原含有d
型、l型天冬氨酸。尤其在牙釉质、牙本质中，d型、l型天
冬氨酸的含量随着年龄的增加会发生改变，d型天冬氨酸
随着年龄的增加而增加，而l型天冬氨酸随着年龄的增加
而发生消旋作用，转变为d型天冬氨酸而含量下降。d型／
l型天冬氨酸的比值随着年龄的增加而增加。在牙本质中
这种变化较稳定，适合于用d型／l型天冬氨酸估计个体的
年龄_1 j。国外许多学者建立了利用天冬氨酸的消旋作用
推测年龄的方法。20__年，pilin等利用此方法计算15～95
岁之间的样本，年龄与d／l型天冬氨酸的比值的关系，其
相关系数达到0．93。此方法的优点在于当牙齿的形态遭到
严重破坏时，可以利用牙本质中天冬氨酸的稳定性来估计
个体年龄。此方法在实际应用中，水解蛋白质和手性分离、
检测氨基酸的衍生物尤为重要，影响结果的准确性，可应用
gc、hplc、毛细管电泳进行手性分离和检测ll 。
随着年龄的增长，人体的体细胞线粒体产生的自由基
增多，自由基的增多会对dna产生损伤。尤其活性氧弓l起
的dna氧化性损伤，导致碱基结构的损伤，进而引起dna
在体内复制时发生突变。自由基对核dna和线粒体dna
都会产生损伤，由于线粒体dna没有组蛋白和hmg蛋白
的保护，更容易产生损伤【6-8 。活性氧对dna的损伤，表
现在dna的碱基形成加合物，在复制过程中，这些碱基产
生错配，导致突变。活性氧是结构最简单、稳定性最差、氧
化性最强、与四种碱基的反应活性最强的自由基，因此在细
胞中最多见的是活性氧导致的碱基损伤，活性氧攻击碱基
的不饱和键形成碱基加合物。人体也存在抗自由基损伤的
修复能力，但随着年龄的增加，修复能力下降。活性氧可和
碱基形成8一oh—g、5一oh—dg、5一oh—du、8一oxo
— da，dug、2一oh—da碱基加合物_6 j。通过对动物细
胞和体外培养细胞的研究，发现随着年龄的增长细胞的碱
基加合物含量会增加，其中8一oh—da、8一oh—g含量
最多。检测碱基加合物和正常碱基的含量，可用于推测个
体的年龄，但这种方法只能粗略估计年龄，适合于组织碎块
的年龄估计。
在人类染色体的末端存在端粒，端粒由蛋白质和dna
组成，真核生物的线型染色体都存在端粒。端粒dna不存
在蛋白质编码基因，端粒基本由六核苷酸核心重复单位
(111aggg)组成，其中有的重复单位存在变异，重复序列问
亦存在一些插人序列。端粒虽然不存在功能基因，但端粒
起着稳固基因组、保护染色体末端、决定核内染色体定位作
用及调控体细胞复制作用l9 。由于端粒调控着体细胞
的分裂、复制，体细胞分裂、复制有一定复制生命周期，端粒
决定体细胞分裂次数，可以说是细胞分裂的“生物钟”，因为
端粒不能进行半保留复制，其复制依赖于端粒酶的存在。
大部分体细胞不存在端粒酶，体细胞每分裂一次，端粒就丢
失一段，随着细胞分裂而不断缩短，因而端粒的长度反映细
胞复制历史。也可以说端粒长度随着个体的年龄变化而缩
短，反映生物个体的年龄变化。而端粒长度的变化不受体
法律与医学杂志20__年第1o卷(第1期)
外因素的影响。细胞每分裂一次，不同的细胞缩短的长度
不同，因此端粒长度可以作为推断年龄的一个理想标
记[1卜15]。
端粒长度的检测方法目前有trf(末端限制性片段
法)、fish(荧光原位杂交法)、 a(杂交保护法)等。这些
方法检测都是46条染色体端粒的平均长度，而不同染色体
的端粒长度存在差别，以及同一染色体的两个端粒亦存在
差别[16]。通过检测平均长度而推测年龄，误差较大。如果
能准确检测一个端粒的长度，推测年龄准确性将大大提高。
随着分子生物学和分子遗传学及相关技术的发展，用
分子生物学方法可以准确推测个体的年龄。
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【摘要】 在文献检索的基础上，对近10年来在中药作用机理中主要应用的分子生物学技术——核酸分子杂交技术、反转录-聚合酶链式反应技术、差异显示PCR技术和DNA阵列技术的基本原理、应用实例、优势与不足做了概述，并对未来的中药机理研究技术、方向和前景做了展望。
【关键词】 分子生物学技术；中药；作用机理
中药自古以来就是我国人民防治疾病的主要武器，对中华民族的生存与繁衍起着不可忽视的作用，长期的医疗实践累积了宝贵而丰富的经验，并与中医学共同形成了一套完整独特的理论体系。但如何用现代科学技术语言阐释其作用机理，提供科学依据，使其广为世界接受是一重大难题。近年来，分子生物学技术的发展，不仅根本性地改变了生命科学的研究方式，也为中药的作用机理研究提供了有力工具和良好的发展契机，使得中药基因转录水平的机理研究成为可能。笔者对近10年来有关分子生物学技术在中药基因转录水平作用机理研究中的应用综述如下。
1 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一，基本原理是具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针。其中将核酸提取分离后在体外与探针杂交的是印迹杂交，直接在组织细胞内进行的是原位杂交。
中药作用机理研究中较早常用的有RNA印迹杂交(Northern blot)，点杂交（dot blot）和原位杂交。二仙汤是治疗妇女更年期综合征、抗衰老的名方，具温补肾阳、泻相火、调冲任功能。廖柏松等［1］采用Northern blot对18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行研究，结果表明，二仙汤组β内啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平明显升高，达到未衰老前水平。沈小珩等［2］则从衰老过程抗氧化酶活性降低，且酶活性降低与其蛋白质基因表达水平降低平行的现象出发，采用分子杂交等技术考察二仙汤及其拆方对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶基因表达水平及其活性的影响。结果表明，抗氧化酶活性显著升高，且与其mRNA表达水平升高呈平行关系，提示二仙汤抗衰老是通过增强抗氧化酶基因表达水平而实现的。海风藤有祛风除湿、通经活络的功效。韩恩吉等［3］采用Northern blot观察它对人类神经母细胞瘤细胞系列淀粉样前体蛋白(βamyloid precursor protein ，βAPP) 基因表达的抑制作用。结果发现，海风藤选择性地抑制βAPP基因表达，为其防治阿尔茨海默病提供了一定依据。郑钦岳等［4］应用dot blot研究了补血和血方四物汤对白细胞介素6（interleukin6，IL6）mRNA表达的影响，实验表明，四物汤在0.01～1.00 ng/mL 浓度内可使IL6 mRNA的表达明显增加。保心丸具有降脂、降低血浆内皮素、抑制血小板聚集等作用。 为进一步阐明保心丸抗实验性动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）的机理， 樊永平等［5］用原位杂交技术研究内皮素（endothelin，ET）和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase， NOS) 在AS家兔主动脉壁的基因表达。 结果证实，保心丸组ET1mRNA 的表达较模型组低， 而NOS mRNA 较模型组高， 提示保心丸调节血管内源性NO和ET之间的平衡可能是其抗实验性AS的机理之一。精制血府胶囊是血府逐瘀汤的化裁精简方，其抗心肌缺血疗效明显优于原方，为揭示其作用机制，证实其疗效，王伟等［6，7］分别采用Northern blot和原位杂交等技术，研究其对于心肌缺血密切相关基因表达的影响，前者结果表明精制血府胶囊显著提高缺血缺糖心肌细胞NOS mRNA表达水平，后者的精制血府胶囊组，ET1和内皮素转换酶（endothelinconverting enzyme，ECE）1的mRNA表达较其它组明显减少，且心肌细胞损伤也较其它组显著减轻。因而推测精制血府胶囊可能是通过提高NOS表达、促进NO生成及抑制ET1、ECE1的基因表达，减少ET1生成，减轻其对心肌细胞的直接损伤，发挥保护心肌细胞的作用。
Northern blot 是用来测量真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法，并可从大量RNA样本中同时获得这些信息，但需要大量的材料，受RNA降解影响大，敏感性低。dot blot的不足之处在于点于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定，且一般要用纯化的RNA样品。原位杂交的优势在于可对组织细胞中的核酸进行精确定位。核酸分子杂交是分子生物学基本技术，随着反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）技术、差异显示PCR （differential displayPCR ，DDPCR）、DNA阵列等优势技术的出现、逐渐成熟而应用渐增，近5年应用基本的分子杂交技术研究中药作用机理的报道已少见。
2 RTPCR技术
PCR是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，RTPCR是从RNA扩增cDNA拷贝的方法，即先将RNA反转录成cDNA，再用PCR扩增，使其敏感性大大提高，解决了dot blot或Northern blot中目的mRNA含量太低的问题，是目前中药机理研究中最常用的分子生物学技术，从发表的文献数量可以反映出来。
这方面的研究报道包括有Gumiganghwaltang (GMGHT)抗炎机制的研究， KIM S J 等［8］研究其在小鼠腹膜巨噬细胞中的抗炎机制，结果显示，GMGHT以剂量依赖的方式降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha ，TNFα），IL6和环氧酶2 mRNA表达水平，推测这是GMGHT减少炎症的重要分子机制之一。为了阐释二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理，郑小伟等［9］考察了二仙汤不同时间对肾阳虚大鼠垂体促肾上腺皮质激素(adrenocortico trophic hormone，ACTH) 基因表达的影响。结果是二仙汤可以上调垂体组织ACTH基因表达，且表达量随用药时间延长而增加，提示上调ACTH mRNA表达是二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理之一。β地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血病，补肾生血方具有补肾、益髓、生血作用，用于治疗杂合子患者疗效明显。为揭示其分子机理，吴志奎等［10］采用RTPCR等技术考察了用药者的α、β和γ珠蛋白mRNA转录水平。结果发现，补肾生血胶囊能明显提高β地中海贫血患者血红蛋白（hemoglobin，Hb）和抗碱血红蛋白（hemoglobin F），Hb珠蛋白链比增加，γ珠蛋白mRNA转录水平相应升高，说明补肾生血药具有促进γ珠蛋白转录和表达，诱导HbF合成作用，代偿了β珠蛋白基因的缺陷。益髓生血颗粒是补肾生血方的颗粒剂，易杰等［11］研究了其对β地中海贫血患者造血刺激因子干细胞因子（Stem cell factor，SCF）及人红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）mRNA表达的影响。结果显示，治疗后，外周血EPOR、SCFmRNA表达明显增强，因此推测益髓生血颗粒可能是通过影响SCF以及EPOR mBNA表达来促进骨髓造血，提高Hb、红细胞的水平，达到治疗β地中海贫血的目的。陈智松等［12-14］从此方的抗衰老及中医肾生髓理论的角度出发，分别研究其对骨髓有核细胞中诱导细胞凋亡、促使机体衰老的原癌基因cmyc、抑制细胞凋亡的原癌基因Bcl2和造血刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimutaing factor，GMCSF)基因表达的影响。结果表明，衰老时高表达的骨髓cmyc，明显降低的Bcl2 和GMCSF，用药后，前者表达水平明显下降甚至不表达，后两者表达明显提高。因此认为补肾生血方通过抑制cmyc的表达，促进Bcl2表达，从而抑制骨髓细胞凋亡，延长细胞寿命，延缓了衰老，并结合有关的医学成果，认为Bcl2 和GMCSF是肾生髓的本质相关基因。凌云彪等［15］研究清热活血补益方(肝纤方)对大鼠肝脏Ⅰ型前胶原mRNA 的表达和胶原酶活性的影响。结果表明，以清热活血补益方制备的含药血清抑制了Ⅰ型前胶原mRNA 的表达，胶原酶的活性增加。提示此方抑制Ⅰ型前胶原mRNA 的表达，减少胶原的合成，同时提高胶原酶的活性促进胶原的降解，可能是其抗肝纤维化的部分机制。此外，蔡晶等［16］通过检测雌激素受体(estrogen receptor，ER)α和βmRNA 表达量，考察了补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子对雄性大鼠杏仁核和皮质顶叶ER mRNA的调节表达差异，结果显示，两用药组大鼠杏仁核、皮质顶叶ERαmRNA表达量无明显变化， ERβmRNA 表达量都上调，且淫羊藿组高于女贞子组，说明补肾中药可能是通过对ERβ的调节来发挥作用。
转贴于
RTPCR的独特优势在于RNA纯度不必很高，仅少量RNA模板即能满足实验所需，尽管实践中RTPCR还远达不到理论上能检测到单一拷贝的RNA样品的敏感度，但远高于Northern blot。尤其适用于可获得的mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时测定基因表达的强度。只是扩增步骤中样品间扩增效率的微小差异将极大地影响信号强度，使用内参照可以减少这一问题，但无法彻底排除［17］。总的来说，RTPCR是测量RNA样品中低丰度mRNA时的最佳方法。
3 DDPCR技术
1992年，梁鹏等建立了一种对不同来源的mRNA样品用PCR技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法，即DDPCR。该方法依赖2套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。最后通过比较不同来源的扩增cDNA产物的电泳带谱，能够发现差异表达的基因。
中药作用机理研究中应用DDPCR的报道有唐发清等［18］对有抗鼻咽癌作用的益气解毒片干预鼻咽癌细胞基因表达的研究，旨在从基因选择性表达水平探讨其抗鼻咽癌的机理。结果表明， 益气解毒片在体外能抑制鼻咽癌细胞基因的表达， 同时诱导一些特异基因的表达， 从而抑制鼻咽癌细胞的增殖。
相比以往的方法，DDPCR技术提供了几方面理论上的优势，如理论上能够灵敏地检测组织或细胞中表达量极低的mRNA样品的差异表达，能鉴别特定组织或细胞来源样品之间转录水平的mRNA定性和定量变化。这种优势同样可体现在中药机理研究中，可同时显示中药作用后对多种基因转录的不同影响，将有影响的靶基因条带回收，再扩增、克隆、测序，查询确定是什么基因，是已知或未知序列，这样就可以确定中药起效可能源于影响那些基因转录。但这些优势目前部分还停留在理论上，还有许多技术问题有待解决，如经DDPCR鉴定出来的超过半数的cDNA是假阳性条带，靶细胞的总mRNA中的一部分不能被高水平扩增、造成丢失等［17］。尽管目前DDPCR应用在中药基因转录水平的机理研究报道还很少，但毋庸置疑，其潜力巨大。
4 DNA阵列技术
DNA阵列技术是新发展起来的可同时分析数千个基因表达谱的技术。其原理同核酸分子杂交。在不同的文献中的称谓不尽相同，如基因芯片、DNA芯片、微阵列等，目前没有明确区分，通常混用。
目前有零散的采用商用或自制微阵列研究中药基因表达水平的报道。如周联等［19］采用含2 048个基因的小鼠基因表达谱芯片检测黄连解毒汤及其成分黄芩苷和盐酸小檗碱对LPS造型的小鼠脾细胞基因表达的影响，结果复方的作用明显优于有效成分的作用，但对具体基因表达影响的分析存在一定难度。王广良等［20］用自制的包含24个细胞周期相关基因的cDNA微阵列，对抑制肝癌细胞增殖的4种中药乌药、青蒿、紫草和黄芪的抗肿瘤分子机制研究表明，4种中药对细胞周期基因和损伤检测点基因均有不同程度改变，表现为部分上调，部分下调，通过分子生物学技术进一步验证了用其治疗癌症的合理性。
在中药作用机理研究中，DNA阵列技术可以同时对使用中药前后的数千个基因表达情况进行比较和差异分析；且具有所需样品的用量极少、自动化程度高、被测目标DNA密度高的优点。但目前微阵列技术也存在许多问题，如其小型化和高通量的特点使得对外界和内部的变动都很敏感，因此宜采用取平均值并标准化操作的办法，但目前尚无普遍认可的规则和标准来指导微阵列实验，数据采集和分析方法及操作系统也存在很大不同［17］。此外，基因表达与调控研究的滞后，使得中药机理研究中获得的很多信息难于解释；昂贵的制作费用也是一个限制因素。
5 展望
总体来讲，中药的作用机理研究应是多水平的，不仅包括基因转录水平，也包括转录后、蛋白质翻译及翻译后水平的调控上，对每个特定的中药/中药复方，可能不一定在各水平上都有影响，基因转录水平的机理研究主要就是考察对相关靶基因mRNA水平的改变，也是目前分子生物学技术在中药机理研究中的主要应用范畴。中药尤其是中药复方的多成分多功效决定了其很可能对基因转录水平有影响，已完成的研究结果已证明了这一点。
中药的机理研究通过应用分子生物学技术已深入到几乎是最根本的基因转录水平，并在该水平上对中药的疗效获得了一定解释，但整体上还处于探索阶段。已有的研究主要是应用如核酸分子杂交、RTPCR技术等考察“单基因”的技术，应用如DDPCR、DNA阵列等研究多基因的技术的报道较少。中药调节机体平衡的特点决定了对基因转录的影响很可能是对多基因的协同影响，如对补肾生血方的系列研究已表明此方的功效与影响EPOR、SCF、cmyc、Bcl2、GMCSF基因表达有关。因此，应用研究多基因表达的技术考察对多基因的协同影响将是未来中药基因转录水平作用机理研究的主要方向。相信随着现有技术的不断发展和完善、新技术的出现及多种技术相结合加上疾病细胞分子水平研究的深入，复杂的中药作用机理会逐步得到阐释，中药的疗效和可能发现的新功效将从机理上获得科学依据，为中药获得像西药一样的市场准入权提供有力的支撑。 参考文献
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[关键词] 早期宫颈癌；复发；分子生物学
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-39-03
宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。宫颈癌死亡率每年大约26万，其中80%发生在发展中国家，HPV16和18是最常见的两种致宫颈癌的病毒，70%的宫颈癌由这两种病毒引起[1]。近年来采用阴道脱落细胞图片检查的普及，使不少宫颈癌患者能早期发现、早期治疗，提高了患者的生存期。但临床发现宫颈癌年轻化倾向明显，25～54岁人群发病率不降反升[2]。导致早期宫颈癌复发的因素较多，许多国内外学者对早期宫颈癌的各方面进行了大量的研究分析，得出了很多与早期宫颈癌复发有关的原因。本资料通过对国内外最近五年相关文献资料的研究学习，总结导致早期宫颈癌复发的分子生物学因素。
1 宫颈上皮细胞间质转化
大量的研究表明宫颈上皮细胞间质转化（EMT）与宫颈癌的形成和转移复发有密切关系。
1.1 上皮细胞间质转化（EMT）
正常的上皮细胞靠专门的细胞间粘附力紧密连接在一起，而且具有顶-基底极性。间质细胞形似纺锤体，连接松散，流动性强，具有前-后极性。上皮细胞通过复杂的程序转变成间质细胞的过程称为上皮细胞间质转化。上皮细胞转变为间质细胞后会失去原来的特性，中间会形成一种亚稳定的细胞既有上皮细胞又有间质细胞的特性，这是一种很多肿瘤都有的过程[3]。上皮细胞间质转化有3种类型，其中第3型存在于肿瘤的侵袭与转移中[4]。宫颈上皮细胞通过EMT过程，形成上皮样的癌细胞失去极性，不稳定，但是还具有上皮细胞的其他特性，经恶化和分化形成具有转移、侵袭能力的癌细胞。癌细胞离开原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管随血液转移到另一个地方形成转移灶。在这过程中，还有以下因素参与，干细胞机制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、药物抗性等。
1.2 EMT的分子生物学
上皮细胞间质转化的标志性分子变化主要有：（1）E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调。E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调与早期宫颈癌的组织学分化、转移和复发成正相关[7]。（2）N-钙粘着糖蛋白、纤维连接蛋白以及波形蛋白的上调表达。波形蛋白的上调表达与早期宫颈癌的转移、复发成正相关[7]。（3）Rho GTP酶介导的细胞骨架重排。RhoC在正常宫颈组织、CIN 组织和宫颈癌组织中的表达逐渐增高，在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移组织，同时RhoC的沉默可以明显降低SiHa细胞的体外粘附能力和侵袭、迁移能力[8]。（4）调控EMT的基因转录因子的上调和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-钙粘蛋白的表达以及调节其它基因功能诱导EMT过程[9]。
1.3 EMT的信号通路
上皮间质转化的信号通路有转化生长因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。这些通路相互作用，共同调节EMT的过程[10]。
1.3.1 TGF-β信号通路 TGF-β是一组具有广泛生物活性的多肽，哺乳动物中有三种亚型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相关的致瘤作用研究的重点，TGF-β1在肿瘤细胞中是上调的[11]。TGF-β通过细胞膜表面具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ结合形成复合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3种受体，TβR Ⅱ只有一种受体。TGF-β与TβR Ⅱ结合形成复合物使TβR Ⅰ磷酸化，随之smads被磷酸化，诱导该复合物进入细胞核；这一信号通路受到干扰发生异常，与肿瘤的发生有重要关系[12]。与TGF-β信号通路影响细胞核内转录的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1与宫颈癌的发生发展、临床分期、侵润和淋巴结转移相关[13]。Stephanie等[14]的研究发现TGF-β信号通路在EMT过程中起着重要作用，从而导致癌细胞具有侵袭和转移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV诱导的宫颈癌中发现TGF-β通路的破坏与宫颈恶性进展有很大关系；在宫颈上皮样瘤变到宫颈癌的过程中TGF-β1表达减少；同时TGF-β1受体基因表达也下降。
1.3.2 Wnt信号通路 Wnt信号通路有经典的Wnt信号通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中经典通路最重要，通过β-catenin激活基因转录；其机理概括为WntFzdDshβ-catenin降解复合体解聚β-catenin入核TCF/LEF基因转录[16]。参与Wnt信号通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信号通路受到刺激后，APC基因突变使β-catenin降解复合物合成障碍，以及β-catenin基因突变使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，从而使β-catenin降解障碍，胞浆内游离的β-catenin聚集，进入核内激活Cyclin D1、C-myc等基因转录，导致肿瘤发生。细胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影响宫颈癌的复发和转移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白对早期宫颈癌复发的影响中发现，三者在早期宫颈癌中的表达明显升高，并且三者共表达时与临床分期、病理分级有关；Survivin、Cyclin D1表达与早期宫颈癌复发有关，二者共同表达与盆腔淋巴结转移有关[18]。
1.3.3 Notch信号通路 Notch信号通路是肿瘤血管生成和转移的一个关键因素[19]。Notch信号通路由Notch、Notch配体（Jagged）、受体等组成，其中配体有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受体有Notch1、2、3、4，Notch信号通路在不同的肿瘤以及不同的阶段作用不同。Notch信号通路概括为DeltaNotch酶切ICN细胞核CLS/ICN复合体基因转录[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路径、Notch1-PI3K-PKB-Akt路径、Notch1-IKK-NF-κB路径共同相互影响宫颈癌的发生发展[20]。Bajaj等[21]研究发现CD66+细胞中Notch信号通路对宫颈癌有重要作用。免疫组织化学分析显示Notch3在宫颈鳞癌中过度表达，Notch阳性表达的宫颈癌患者比阴性表达的患者的生存率小[22]。
1.3.4 NF-κB信号通路 基本的NF-κB信号通路包括受体、受体近端信号衔接蛋白、IκB 激酶复合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚体。受到刺激后IκB 激酶复合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚体释放修饰后进入细胞核内，进行基因转录。NF-κB一般情况下位于细胞胞浆内，由两个功能亚单位P65和P50组成，与其抑制因子IκB-α和IκKB-β结合在一起。宫颈癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α减少，从而NF-κB的P65进入细胞核内[23]，参与细胞核内基因的表达调控。NF-κB激活对肿瘤的促进作用主要有：（1）①NF-κB激活对宫颈癌的转移有明显促进作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表达下调使肿瘤细胞逃避凋亡；（3）NF-κB上调Cyclin D1等，促进肿瘤细胞生长。NF-κB的P65和c-IAP2的过度表达和caspase-3的下调，是宫颈癌发生发展的重要因素[24]。
2 小结
目前国内外对早期宫颈癌治疗后复发的因素研究较多，都认为复发是由于多方面、多路径的因素共同作用的结果。发现复发转移的关键因素，提高患者的生存率，减轻患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信号通路、notch信号通路等，是否可以发现更多关键的分子生物学层面的相关因素，使早期宫颈癌能更早的发现，得到早期治疗，阻断关键的分子生物路径，减少复发率。
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关键词：创新能力 分子生物学 高等教育 综合素质
中图分类号：G642.0 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.19.003
研究生教育的目标是培养具有独立从事科学研究，在科学或专门技术上作出创造性成果的高级人才。与本科生相比，研究生注重的是创新能力的培养，特别是原始创新能力[1]。分子生物学在医学领域的日新月异的发展，使人类对疾病的认识、预防、诊断和治疗发生了深刻的变革，医学科学已从整体、细胞水平逐步深入到了分子水平。在教学过程中如何培养研究生的创新能力是一个重要的课题。本文拟阐述理论和实验教学相结合方式提高研究生创新能力的几点体会。
1 理论教学中，精炼理论知识，引入科学前沿，提高创新意识
1.1 精炼理论知识，为创新提供理论基础
基本知识是创新的根基，我们通过精炼理论知识使学生形成扎实的知识结构，系统的掌握基础理论[1]。分子生物学内容繁杂，随着新知识的加入，导致内容越来越多，因此，在教学过程中，除了让学生掌握基础知识外，还要让学生了解知识发展、演变的过程，懂得知识创新的基本途径。在理论课程讲授过程中要把素质教育贯穿于整个过程之中，培养学生探索真理的科学精神、求知欲望和创新精神。
1.2 引入最新研究成果，培养学生的创新意识
随着科学技术的发展，知识更新的周期越来越短。因而，在分子生物学的教学过程中增加最新研究成果的讲授，让学生了解本学科的发展动态[2]。这不仅能使学生掌握书本以外的知识，提出尚未完全阐明的问题，激发其创新欲望；而且还能在把学生引领到学科前沿的同时，将最新的成果转化为教学内容，推动学科的发展。对进展较快的内容，如蛋白质组学、代谢组学等内容则作为专题讲授，保证教学内容与时俱进的同时也激发研究生对科研的兴趣。
1.3 将科研成果应用于教学中，让学生感受科研的魅力
科研成果运用到分子生物学的教学中，要根据内容和学时，恰当运用，使抽象理论具体化，帮助学生理解[3]。同时也能调动研究生的学习兴趣，让他们在学习中感受科研，培养其对科研的兴趣。通过该方式既可以增加学生对技术重要性的理解，也激发了他们探索新课题的欲望。
2 改革分子生物学实验教学，提高学生的创新能力
传统的验证性分子生物学实验教学，在操作过程中存在以下缺陷[4]：①研究生不参加实验前的准备，这导致其独自科研时，不知道准备哪些东西。②从实验教学看，实验理论讲解不能使学生对实验有直观认识。③从结果分析看，教师分析结果，使得学生失去了求知的动力。④从整体看，传统实验教学缺乏连续性，不能培养学生的创新能力。因此，通过教学改革提高其创新能力势在必行。
2.1 强化动手能力
既往分子生物学实验，材料准备和试剂配制都是老师准备的，学生只是依照实验指导，完成操作，进行现象观察。为了培养研究生的动手能力和操作技能，应该让其积极参与实验准备，提高其动手能力。
2.2 注重操作，小班授课
分子生物学实验是研究生的必修课，根据研究生数量少的特点，实行小班授课，让每一个研究生都能完整的进行实验操作[5]，掌握分子生物学技术，为科研工作打下基础。
2.3 培养创新能力
实验教学对培养研究生的创新能力至关重要，但既往开设的验证性实验已不能满足科技发展对创新能力的要求，更新教学内容，探索实验教学与应用教学结合的模式，增加RNA提取、基因克隆、蛋白质表达、纯化于一体的综合性实验，既可以培养创新能力，又可激发其学习的主动性。
2.4 培养结果分析能力
实验结果分析是非常重要的，它决定实验的思路、进度以及成果。实验中最重要的不是结果好坏，而是教会研究生如何分析实验结果，告诉其分析方法，并将结果分析做成实验报告上交，要求他们将实验中出现的问题做出阐述。在以后的工作中他们在结果分析的过程中发现、提出和解决问题，并探寻解决问题的途径，使学生在积累知识的同时培养创新能力，学会创造性的思考和分析问题[5]。
2.5 留出空间，提高科学思维能力
随着科学技术的发展，分子生物学的研究领域不断拓展，新技术、新方法更是不断涌现。要跟上时代的需求，就要求研究生不断学习进步，有科学的思维能力，善于思考。所以在实验课上，要充分调动研究生的主动性，针对一些问题公开讨论，畅所欲言，让学生们乐于动手，勤于动脑，锻炼科学思维能力。通过这种教学方式，既复习巩固了以前的学习内容，又学习了新知识。
3 运用现代化教学手段，增强教学效果
现代化教学手段的使用已经成为现代教学的标志。从原来的教学录相、投影仪的使用到配备精良的多媒体教室[6]。利用多媒体将教学内容转变为以图象、动画、文字和声音等多种信息的综合，优化了教学环境，提高了学生的学习兴趣。利用计算机辅助教学，可节省时间，提高课堂效率，有利于教学内容的更新。
4 改革考核和成绩评定方法，注重创新能力培养
传统的闭卷考试，可促使学生临考前好好复习，巩固基础知识，但该方式反映的是学生对知识的掌握，不能合理地评价学生。在医学分子生物学教学中，我们应强调实验技能的培养，规范实验操作，通过撰写综合性实验设计的论文考察学生的选题、查阅资料、对知识的理解，分析和综合应用能力，能更真实的反映学生的自学能力，综合运用知识、分析和表达能力。故采用闭卷考试与课题论文相结合的考核方式更能促进研究生创新能力的形成。
综上所述，通过优化教学内容为研究生创新能力的形成打下坚实的基础；利用实验课的实践性和探索性，激发学生对科研的兴趣，培养研究生的创新思维；通过使用先进的教学手段和改革考核办法促进研究生的主动学习、独立思考能力，培养出既具有扎实理论基础又具有创新能力的高级人才。
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关键词：分子生理学；实验室；安全管理
作者简介：梁宏伟（1976-），男，蒙古族，内蒙古赤峰人，三峡大学生物技术研究中心，讲师；王玉兵（1977-），男，湖北恩施人，三峡大学生物技术研究中心，讲师。（湖北宜昌443002）
基金项目：本文系“地方综合性高校生物类专业实用创新人才培养模式的构建与实践”项目（项目编号：2009192）资助的研究成果。
中图分类号：G482 文献标识码：A 文章编号：1007-0079（2012）07-0092-02
随着生命科学的迅速发展，越来越多的科研机构和高校设立分子生物学实验室及进行这方面的研究工作，它已经成为生物、医学等领域的重要实验基地。分子生物学是一门非常强调实验技术和技能的学科，以大量的实验为基础，涉及的贵重仪器设备和有毒有害生化试剂种类繁多。目前，大部分分子生物学实验室都缺乏专职的技术人员进行管理、维护，分子生物学实验室安全问题已经迫切地摆在人们面前。加强分子生物学实验的安全管理以及充分发挥研究生在其中的作用对整个实验室的可持续发展、科研工作的顺利开展都是十分必要和重要的。
一、实验室安全管理的必要性
分子生物学实验室作为高校生命科学人才培养和现代生物技术产业化的孵化器，其安全正常运转与否直接关系到教师、学生的生命安全和学校的公共财产安全。加强实验室安全管理与教育培训是分子生物学学科健康发展的重要保证之一。近年来，随着我国高校办学规模的扩大及生命科学研究的蓬勃发展，分子生物学实验室对外开放力度的加大，实验室的使用、人员流动和内部管理都产生了许多新情况，这些都要求我们认真分析实验室安全管理的新形势，预防安全事故的发生。国外一些著名高校和研究机构在多年前就制定了严格规范的生物安全制度和相应的管理机构。世界卫生组织早在1983年第一版《实验室生物安全手册》，对实验室生物安全、仪器设备安全使用及生化试剂、水电安全进行详细阐述，随后在新版本中不断进行补充和完善更新。为加强我国实验室的生物安全管理，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会在2009年7月1日开始实施新版《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008），该标准对实验室生物安全设施、设备等硬件和安全管理体系、组织、文件等软件管理做出通用性强制性国家标准。这一法规性文件的实施对实验室生物安全的认可和生物安全管理工作的开展将发挥重要的指导和规范作用。
尽管高校实验室安全管理一直是人们关注的热点，随着一系列政策法规的出台，人们的环保和安全意识也在不断增强，但仍有很多问题存在。如有些师生实验室安全意识薄弱、规章制度未能获得有效执行、实验垃圾和生活垃圾混放、将食物带进实验室等。再者实验室生物安全管理基础建设投入不足，很多高校尚未对分子生物学实验中产生的废弃物进行无害化处理，甚至对于产生的废弃物不知该如何处理而丢入普通垃圾桶或倾倒入下水道。就此我们提出了一些关于分子生物学实验室的安全管理措施来和大家共同探讨，使其能够安全、高效地为生命科学的教学和科研工作提供服务。
二、分子生物实验室存在的安全问题及对策
1.有毒有害生化试剂的使用及废弃处理
分子生物学实验室所用到的生化试剂大多具有挥发性、强毒性、腐蚀性、致癌性等，如氯仿（CHCl3）、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴化乙锭（EB）、丙烯酰胺、NN-亚甲双丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯（DEPC）、IPTG、Trizol、二甲基亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）、四甲基乙二胺（TEMED）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、过硫酸铵等。这类物品不仅对实验操作人员毒性大、危险性高，而且对环境的危害和影响也极大。在取用这类生化试剂时应佩戴合适的手套、口罩、护目镜等个人防护装备，在化学通风橱内完成相关操作，防止试剂溢洒并接触皮肤，防止挥发性、粉末试剂吸入呼吸道及对眼睛黏膜造成毒害。对用完和废弃的有毒有害试剂要及时进行无害化或净化处理，然后使用专用容器盛放并做醒目标识，防止对他人造成毒害和环境污染。如溴化乙锭（EB）是强诱变剂，具有高致癌性，实验结束后应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置。对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，先用水稀释至浓度低于0.5mg/ml，加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，小心混匀后再加入等量的2.5mol/L HCl，混匀后置室温数小时，再加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，小心混匀后可丢弃。[1]DMSO存在严重的毒性，使用时要避免其挥发，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及1%～5%稀氨水洗涤。丙烯酰胺和NN-亚甲双丙烯酰胺具神经毒性，操作时戴手套在通风橱内进行，聚合后的聚丙烯酰胺凝胶没有毒性，可随普通垃圾一起扔掉。
2.生物安全及其防护
在实验室安全管理中人们通常只关注到有毒有害生化药品、防火及水电安全，往往忽视生物安全的管理。这是因为人们普遍认为实验室不太可能发生感染，即使感染也没有很严重的后果。虽然从事高致病性病原微生物研究的实验室不多，但实验室感染是客观存在的现象。尤其是从事致病性或高致病性病原微生物的实验室和研究人员，本身就存在很大的风险。如2004年4月中国疾病预防控制中心病毒所实验室由SARS冠状病毒引起实验人员的感染；近期报道的2010年东北农业大学28名师生因活体动物实验而被布鲁氏杆菌感染等。从事致病性或高致病性病原微生物研究的实验人员应经专项培训，建立健康监测制度，配备适当水平的个人防护装备；对此类实验室建立相应的生物安全防护等级，配备相应级别的生物安全柜等专用设备，并按照正确的程序和方法进行操作。普通分子生物学实验室中常用的菌株往往具有抗生素抗性，在药物存在的情况下也能正常生长。在微生物相关试验中首先要做好个人的安全防护，实验结束后要及时对菌体进行灭活处理，防止对人身造成感染及环境污染。试验中用到的动植物材料也可能携带致病源，在实验完成后要及时进行妥善处理，否则可能会造成病菌和疾病的传播。对于转基因动植物材料应严格控制其栽培或养殖环境，防止基因飘移扩散对生态环境造成潜在危害。
3.仪器设备的安全使用及水火电的安全
在分子生物学实验室常用到高速离心机、高温高压灭菌容器、紫外光源、烘箱、微波炉、超声波处理器等仪器设备。首先要保证不同规格型号仪器的用电安全性、线路荷载承受能力；其次要经常检查各种仪器的自动控制装置是否运转正常。如对高速离心机的使用一定要确保转子上离心管的配平，否则会导致设备损坏甚至转子飞出伤人；对高温高压灭菌容器应定期检查其压力和温度控制、定时装置是否正常，对非全自动压力灭菌容器在运转时应全程看护；对烘箱除确认自动控温装置是否可靠，同时还需要人工检测温度，以免温度过高，在使用时严禁把易燃易爆溶剂及物品送入烘箱或微波炉中。紫外光或紫外线可损伤眼视网膜，皮肤过度暴露在紫外线下导致损伤及诱发皮肤癌，切勿用裸眼观察和使用没有防护装置的紫外光源，在紫外光下操作时要戴合适的防护性手套。对经常接触有毒有害生化试剂的仪器设备（如凝胶电泳系统）应划定专用操作区，同时还要防止在操作观察中与其他设备的交叉污染。
分子生物学实验室在设立之初应进行严格的规划设计，遵照国际通用及国家对实验室安全管理通用要求进行合理的布局安排。尤其应当注意的是，实验室内严禁乱接电线、电源，动力电源和普通照明电源分开使用。要经常检修、维护线路以及通风、防火设备等；在实验结束时，要及时切断电源、火源、水源等。
4.个人防护装备及求助对象
个人防护装备（Personal protective equipment，PPE）是指用于防止工作人员受到物理、化学和生物等有害因子伤害的器材和用品。在生物安全实验室中，这些器材和用品主要是保护实验人员免于暴露于生物危害物质（气溶胶、喷溅物以及意外接种等），避免实验室相关感染。[2]有毒有害试剂及感染性材料在实验操作过程中难免溢洒，从而可能发生身体接触，此时个人防护就是保证安全的关键所在。需要注意的是，任何物理防护设备的保护功能都有一定限度，都不是绝对的。
需要防护的身体部位主要包括眼睛、头面部、呼吸道、手、躯体、耳（听力）等。对于眼睛的防护采用护目镜，实验室配备的洗眼装置应安装在明显和易取的地方，并保持洗眼水管的通畅，便于工作人员紧急时使用。对头面部及呼吸道保护主要是口罩、防毒面罩及帽子，装有过滤器的防毒面具可以保护佩戴者免受气体、蒸汽、颗粒和微生物以及气溶胶损害的影响。[3]对躯体的保护采用实验服、防护服，对手部的保护需要配备手套等，如取用有毒试剂的一次性手套、高温高压灭菌器及焚烧炉上卸载物品的隔热手套等。对耳的保护主要采用听力保护器，如对超声波处理时产生的分频谐波对听力的伤害。
此外，实验室内应配备国际通用的急救箱和急救手册，在醒目的位置标明就近的急救中心位置及联系方式。
三、研究生在实验安全管理中的作用
分子生物学实验室的安全管理最终要落实到具体的实验操作人员上，而研究生作为实验室的重要组成部分，在实验室安全管理中可以发挥重要的作用。研究生的毕业论文都在实验室完成，日常的学习和科学研究活动当中要使用实验室的各种生化试剂和仪器设备，其对实验室的了解程度和待在实验室的时间在一定程度上都超过了教师。如果他们缺乏高度的安全防范意识和责任意识，不能正确使用仪器设备与生化药品，这些仪器设备与药品的潜在危险性将会被诱发出来，并有可能导致安全事故。因此，实验室应制订合理的研究生安全管理体制，充分调动研究生参与安全管理的积极性，从而确保实验室安全正常运转。
1.安全组织和培训
在分子生物学实验室中应定期举办安全知识和生物防护培训演练，提高师生的安全防范意识。包括对实验室生物安全通用要求、实验室生物安全手册、实验室安全管理的各项规章制度、各类仪器设备操作手册的学习、实验室安全紧急状况的处理和应急程序的演练，如洗眼装置的正确使用、紧急逃生能力等，创建实验室的安全文化。只有师生的安全防护意识得到提高才能更有效地避免实验室安全事故的发生。要确保每一名进入实验室学习和开展科研工作的学生受到良好的安全意识培训。实验室中还应定期组织实验技能的培训、仪器设备的安全正确的操作及有毒有害试剂的取用等方面的培训。熟练的操作技能和正确的操作方法也是避免安全事故发生的有效手段。
2.建立制度约束、利益基础的安全管理制度
研究生可以协助导师对实验室的各种仪器设备、生化试剂及水电暖等设备进行日常管理和隐患排查。针对实验室的具体情况建立切实可行的研究生安全管理制度，根据不同研究生的研究方向侧重点和不同的工作阶段，可以指定一名研究生对特定仪器设备等进行具体的管理和维护，这样将实验室的各种仪器设备、有毒有害试剂以及水火电的安全管理分别委派到具体的研究生。遵循谁主管谁负责的原则，具体的负责人应熟悉该仪器设备或试剂的操作方法及销售维修人员的联系方式，其他研究生在进行相关实验前都必须找该负责人进行登记和咨询。此外，还要充分发挥高年级研究生对低年级研究生的“传帮带”作用，帮助导师指导、监督师弟师妹的学习和科研工作。
研究生参与到实验室的安全管理中无疑增加了他们的学业负担，为使研究生的管理作用得以充分的发挥，激励措施是不可或缺的手段。院系可以在实验室设立研究生助管岗位，提供一定的经费作为其劳动报酬，以充分尊重学生的劳动付出。[4]导师也应对参与实验室安全管理的研究生给予一定的补助，以提高其工作积极性。还应把物质激励和精神激励相结合，对工作出色的研究生在评优过程中予以加分，从而充分调动他们的主观能动性和工作积极性，做好实验室安全管理工作。
四、结束语
总之，实验室的安全管理是高校的一项重要工作，对整个高校的安全和稳定至关重要。要针对分子生物学实验室安全特点和现状来制订切实可行的安全管理制度，并严谨认真地遵照执行，就一定能做好实验室的安全管理工作，确保研究生科研工作的顺利开展。
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摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要经济意义的一种丝状真菌，作为工业生产菌株生产多种水解酶类已有多年历史。本文报道了用基因工程手段对瑞氏木霉进行遗传改造，构造具新性状的重组菌株，用以过量产生同源和异源蛋白类物质的分子生物学研究进展。包括利用CBHI基因的强启动子在瑞氏木霉中过量表达瑞氏木霉内切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗体片段、哈茨木霉几丁质酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和异源蛋白以及利用在葡萄糖上强表达的启动子生产纤维素酶等遗传工程进行情况。
关键词瑞氏木霉；遗传改造；基因定位置换整合；重组蛋白
1 前言
多年以来，丝状真菌及其产生的酶类已广泛用于食品和食品加工业。由于其在工业上的巨大应用潜力，促进了大规模发酵工程、下游加工工程和对菌株的遗传改造的发展，其结果有助于将丝状真菌进一步应用于当今的工业生产。大多数情况下，自然发生的菌株产生我们所需蛋白的水平很低，以至不能在商业上加以利用。因此，为了得到所需的目的蛋白，需对自发菌株进行遗传改造。随着分子遗传技术和真菌基因转移系统的发展，利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造，已以成为可能。
丝状真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多细胞的真核微生物，其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。瑞氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由单拷贝基因编码，其产量可达瑞氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%[1]。由此可见，cbh1启动子是很强的启动子。因此在对瑞氏木霉的遗传改造中，常利用cbh1的启动子与终止子序列构建载体，并利用cbh1的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。瑞氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对瑞氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。
瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的瑞氏木霉重组菌株是安全无害的[3]。
2 过量生产同源蛋白一纤维素酶与木聚糖酶的生产
纤维素酶广泛用于淀粉加工、谷物酒精发酵、麦芽制备和酿造、动物饲养以及青贮饮料加工、果汁和蔬菜汁的提取等诸多方面，近年来被应用于纺织、造纸、制浆等工业。由于纤维素酶应用范围极其广泛，使得开发和改造纤维素酶生产菌株具有极强的现实意义。瑞氏木霉具有降解纤维素的完全酶系，所分泌的纤维素酶混合物通常包括内切葡聚糖酶等多种酶活力。
1990年，Harkki等报道，通过基因定位置换整合使编码CBHI的基因失活，结果EGI的产量提高，不再产生CBHI[4]（见图1）。1993年，Karhunen等报道，将编码EGI的基因置于强启动子cbh1的控制之下，用此表达盒替换染色体的cbh1位点之后，EGI的产量是通常强纤维素分解菌所得CBHI量的2倍或者与其一样多[5]。其他人也曾报道过类似的情况。瑞氏木霉的一个或几个纤维素酶基因经基因位定位置换整合而失活[6，7]。这些菌株提供了一系列令人感兴趣的新酶混合物，即可用于工业生产，又可用于研究不同酶组分对各种纤维底物的分解作用。
但是，基因失活和基因置换的方法，可能不适用于需极高特异和必须去除非必需酶活力的酶制剂。这是因为用于酶生产的培养基，可能会诱导产生大量其它水解酶类。而要使编码这些酶的基因都失活，在实际当中几乎是不可能的。为了防止这类问题的产生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后报道从瑞氏木霉中分离了非纤维素酶基因的启动子，包括pgk启动子、pkiA启动子、tefl启动子和一个在葡萄糖培养基上强表达但未知的cDNA1的启动子，这些启动子可以在葡萄糖培养基上启动合成所需要的纤维素酶，产生的酶制剂基本上没有其它纤维素酶活力。在cDNA1启动子控制下所合成的纤维二糖水解酶和内切葡聚酶产量最高可达50-100mg/L，占分泌蛋白总量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等构建了能在葡萄糖培养基上生长的瑞氏木霉的重组菌株，其携带的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ结构基因是在内源丙酮酸激酶基因（pkil）表达信号的控制之下表达。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫染色，发现这两种类型的转化体在葡萄糖培养基上生长时，能分别分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。对于木霉糖酶来说，最好的转化体产生的特异性酶活力为76U/mg；而对于木霉糖酶Ⅱ来说，则为145U/mg；都大大高出于自发菌株所产生的26U/mg[9]。
3 异源蛋白的生产
3.1真菌酶蛋白类
将Trichoderma harzianum P1染色体上的内切几丁质酶基因分离，导入丝状真菌瑞氏木霉，并在cbh1启动子过量表达。出发菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何内切几丁质酶活力。T·harzianum内切几丁质酶基因编码区前的区段的瑞氏木霉中能正确发挥功能。摇瓶培养产生130mg/L有活力的几丁质酶，比T·harzianum产生的内切几丁质酶活力提高大约20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受内切几丁质酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另据B.Cubero等（1997）报道，在瑞氏木霉组成型启动子ki和cbh2终止子的控制之下构建了两种载体，分别含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的开放阅读框（chit33编码一种内切几丁质酶，bgn16.2编码一种外切葡萄糖淀粉酶），并获得了稳定的拷贝转化体。对转化体bng16.2来说，整合到基因组中的基因拷贝数与mRNA和蛋白质的积累量和在葡萄糖阻遏或几丁质酶诱导条件下的胞外牧特性酶活力之间均呈正相关。该菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生长。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下，其产生的胞外几丁质酶活力是野生菌株的10倍[11]。
Joutsjoki VV(1994)报道，构建了两种一步基因置换载体。一种载体含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因组基因（gamP），另一种含有相应的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1启动子控制下表达。这些载体经转化后置换瑞氏木霉的cbh1基因。在这两种载体中，cbh1启动子都能精确地连接到gamP蛋白质编码区上游，指导瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。这表明gamP基因中内含子序列在瑞氏木霉中得到了正确的加工。研究结果表明，含有gamP cDNA的最优转化体能分泌大约700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中产量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因组基因置换的瑞氏木霉转化体，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷贝cDNA的转化体。对瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究结果表明，自然状态未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作为一种有效的分泌信号，所产生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信号肽作为分泌信号时的情况[13]。
酵母基因在瑞氏木霉中表达的一例是：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的编码区插入到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。在pFG1质粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化。然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了4倍[14]。
除以上蛋白外，被表达的真菌蛋白还包括肌醇六磷酸酶等。这些酶都是在cbh1启动子下表达，摇瓶培养产量达100mg/L水平。发酵培养中，产量为每升几克。在cbh1启动子的控制之下，来自担子菌纲的真菌Phlebia radiate的氧化还原酶（如：漆酶）的产量也达到中等水平
3.2哺乳动物蛋白
瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生产。利用cbh1启动子和终止子，通过共转化外源基因与来自构巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。测量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相应的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2个数量级。这表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表达受到了转录限制。但是，所获得的40mg/L的水平，与典型的在构巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，还是一个可喜的进步[15，16]。
另外，据文献报道，利用其它丝状真菌生产的几种人体蛋白是：表皮生长因子（hEGF），生产激素（hGH），白细胞介素6，组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。
Fab分子是由抗体完整的轻链和重链的Fd部分，由链间二硫链连接在一起。这种分子曾由木霉成功地生产出来，并用于研究其分泌过程。利用cbh1启动子和信号序列，分别构建了表达轻链和重链的表达盒。首先构建的是只产生轻链的菌株，然后用2种不同的重链表达载体进行再转化。这两种载体分别指导Fd链或者与CBHI核心-连接区融合在Fd链的表达。只产生轻链的菌株分泌的轻链水平很低（0.2mg/L）。对前一种重链载体的转化体来说，在摇瓶培养中，分泌的有可能的Fab分子为1mg/L。在具有cbh1-Fd融合结构的转化体菌株中，观察到产量有显著增长。最优菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在发酵培养中，水平增长到150mg/L.然而，没有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍为1mg/L。有趣的是，一种未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特异去除2个氨基酸，能产生少量的Fab分子。释放的Fab分子表现出免疫活性和对抗原的亲和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。对分离到的抗体链进行定量测定表明，分泌出的所有轻链都和重链组装在一起。CBHI-Fab产物的上清液中，含有显著数量（800mg/L）的CBHI核心-连接区肽，它们来自CBHI-Fd融合分子。这样，CBHI-Fd的产生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）装配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，释放的Fab分子）。这表明轻链的产生可能是限制性因素[17，18]。
4 总结
丝状真菌瑞氏木霉已被成功地用于生产同源和异源蛋白。利用基因工程构建具新生状的菌株，在蛋白类物质的生产方面已取得重要进展。其中，在提高丝状真菌异原蛋白产量的过程中，基因融合的方法特别值得注意。典型作法是，将编码有目的蛋白的基因融合到自然情况下分泌性良好的内源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纤维二糖水解酶基因的下游。这种方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白细胞介素6的过程中，被证明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，当外源蛋白整合到CBHI核心-连接区上时，产量能够提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，产量提高3-5倍；就抗体片段而言，产量提高50多倍（Nyysonen等地993）。
由上可见，在瑞氏木霉中已发现出多种分子系统，采用不同的策略用于同源和异源蛋白的生产。为了提高产量，使用强表达和有效分泌纤维素酶CBHI基因的不同部分，已被证明是一种有效的方法。虽然在基因组的分区段也可获得外源基因的有效表达，但cbh1启动子很强，而且cbh1位点对于表达似乎也有益。将外源蛋白融合到CBHI的核心-连接区，能够恢复对高水平表达起重要作用的区段，如：翻译起始位点、信号肽序列及其作用位点。通过基因工程和发醇培养生产同源和异源蛋白，需要进一步地改进。对于不同的培养条件，包括含葡萄糖的培养基，应该发展出不同的生产策略，策略和技术的发展将会拓宽瑞氏木霉生产重组蛋白的范围。由于瑞氏木霉在大规模生产条件中（高达360m2发酵液）的良好表现，所以它特别适于所需大量蛋白的生产[19]。遗憾的是，目前国内在这方面的研究尚未见报导。山东大学微生物技术国家重点实验室正在开展对于瑞氏木霉的分子生物学研究，已克隆到瑞氏木霉进行菌株改造，通过基因定位置换整合，破坏其木糖醇脱氢酶基因，从而构建木糖醇生产菌。
随着瑞氏木霉分子生物学研究的开展及基因工程的瑞氏木霉的应用，使我们构建多种具有良好商业潜力的菌株成为可能。我们相信利用木霉大量生产多种酶和药用产品，将不断被证明是行之有效的。
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Advane of Molecular Biology in the Production of Recombinant Proteins by Filamentous Fungus Trichoderma reesei
非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以无过量饮酒史(酒精摄入量＜20 g/d)以及肝细胞脂肪变性、气球样变、弥散性肝小叶轻度炎症和(或)肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积等为临床病理特点的慢性肝脏疾病［1］，它包括单纯性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcohlic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝硬化(fatty liver cirrhosis，FLC)三种类型。NAFLD已成为导致转氨酶异常的首要病因，并且有部分患者进展到终末期肝病，部分患者甚至与肝脏肿瘤有关。目前我地区NAFLD的发病正在逐渐上升［2］，本病的发病原因尚不完全清楚，认为其发生与胰岛素抵抗、氧应激反应和脂质过氧化物质的代谢失衡有关［3］。本文就该病近几年来其分子生物学方面的一些研究进展综述如下。
1.氧自由基对肝细胞的损害作用
患者由于甘油三脂在肝细胞内蓄积，大量的游离脂肪酸（FFA）在线粒体内氧化，产生了过多的超氧阴离子和活性氧物质 (reactive oxygen species，ROS)，使抗氧化物质耗竭，过量的过氧化氢 (H2O2)和氢氧根离子 (OH)损伤肝脏细胞的线粒体和细胞膜，使肝细胞正常生长停滞，炎症变性，最终导致肝细胞变性坏死而引起临床症状［4］。氧是生物维持活性的必要元素，但其在代谢过程中形成的中间产物ROS，与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多价不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应，结果使细胞膜的流动性和通透性发生障碍，引起细胞功能失调甚至破裂、死亡。机体在正常生理状态下，具有完善的抗氧化机制，包括超氧化物歧化酶(SOD)等酶类和谷胱甘肽(GSH)等非酶类活性氧清除剂。现代研究认为，活性氧增多和活性氧清除剂减少是NAFLD的重要发病机制［5］。线粒体是脂肪酸进行β氧化和三羧酸循环、ATP合成和ROS形成的主要场所，线粒体在氧化脂肪和其他燃料供给大多数细胞 ATP时，快速形成 ROS，尽管在这一过程中部分电子可与呼吸链上的半醌自由基反应形成超氧阴离子(O2)、过氧化氢 (H2O2 )和氢氧根离子 (OH)等氧自由基，其中超氧阴离子是最重要的毒性氧类产物，但细胞内的抗氧化剂可以清除之，避免其所致的氧化应激和脂质过氧化［7］。线粒体是 ROS形成的主要部位，线粒体电子转运系统可消耗细胞90％的氧。大量的ROS可直接或间接通过改变线粒体膜通透性转变孔 (MPTP)的开关，导致细胞凋亡和坏死［8］。 ROS可氧化不饱和脂肪酸导致脂质过氧化，所形成的脂质过氧化物 (LPO)可使部分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者发生 mtRNA缺失、复制错误、修复障碍和断裂，并造成其呼吸链复合物活性降低［4］。DNA对氧应激很敏感，线粒体的DNA(mtRNA)的氧化损伤敏感性比核DNA高达10～16倍，这是由于mtRNA缺乏组蛋白保护、线粒体修复程序不完整以及 mtRNA相似呼吸链(该链是细胞内 ROS的主要来源)的缺乏［6］。研究发现，大部分NAFLD患者的大部分肝脏 mtRNA均有缺损，造成呼吸链复合物活性降低，同时，线粒体缺乏过氧化氢酶，该酶是唯一作用于GSH过氧化氢毒性作用的酶，线粒体不仅是氧应激的源头，而且是 ROS作用的靶，大量的ROS促成线粒体功能障碍［8］。LPO还可与线粒体蛋白反应形成复合物，抑制电子沿着呼吸链的传递，使氧自由基形成显著增多，进而加重线粒体损伤［6］。
2.肿瘤坏死因子(TNFα) 与NAFLD
机体的氧应激反应产生过多的TNFα可以诱导肝脏成纤维细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、粒细胞和巨噬细胞产生集落刺激因子(GMCSF)，从而影响机体的炎症反应和脂质代谢［9］。TNFα与早期非酒精性脂肪性肝病损伤有密切关系。有报道，NAFLD患者循环中TNFα水平增高，且TNFα与肝脏损伤的生化指数相关［10］。人们应用逆转录聚合酶链反应在大鼠非酒精性肝病模型的研究中发现，肝内TNFα mRNA增高的水平与肝脏病理损伤的程度相关，同时发现，抗TNFα抗体可以明显减轻非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝脏炎症和肝细胞坏死病变，但对肝脂肪变性无影响［11］。对离体人肝胚细胞瘤细胞进行细胞毒性实验发现，TNFα可以使该细胞生存力下降，这种作用与TNFα抗体引起细胞凋亡有关，抗TNFα抗体可以减轻TNFα的细胞毒性作用［12］。以上研究说明，TNFα在NAFLD的发病中起一定作用。
3.白介素(Interleuldn，IL) 与NAFLD
近年来有研究表明，不同的枯否氏细胞的功能状态可加重或减轻NAFLD的肝损伤，因此认为其在NAFLD的发病中起重要作用，为此，枯否氏细胞的功能状态在NASH发病机制中的作用也日益受到关注。人们发现NAFLD不但循环中 ILla和 IL6水平显著增高，而且两者的浓度与肝脏损伤的严重程度呈高度相关趋势［13］。采用逆转录聚合酶链反应研究发现，给大鼠过量的脂肪灌胃2周或 4周，其肝脏内 ILla mRNA水平增高。喂饲过量的脂肪16周的大鼠肝内枯否氏细胞产生的 IL6 mRNA水平较对照组增加4倍。因此认为NAFLD中ILla和IL6的增高可能与 ILla、IL6转录水平增高有关［14］。IL6可以刺激培养的人皮肤纤维母细胞合成胶原。有人发现，枯否氏细胞 IL6 mRNA表达的增高与NAFLD纤维化形成有关，提示NAFLD中枯否氏细胞起源程序 IL6可能有促进胶原形成的作用［13］。另外，离体的 ILla、IL6细胞毒性实验发现，单独或联合将 ILla或(和)IL6作用于肝炎细胞不会引起细胞毒性反应［14］。目前，关于 ILla、IL6在NAFLD发病中的作用途径还在研究中。
4.转化生长因子β(TGFβ)与NAFLD
TGFβ广泛存在于哺育动物所有组织中，以血小板和骨组织中表达水平最高。在人体内存在 TGFβ1、2、3三种异构体。TGFβ起着调节细胞生长和分化的作用［15］。NAFLD患者，肝内TGFβ主要来源于枯否氏细胞。目前认为，TGFβ在NAFLD的主要作用是通过诱导细胞外基质的形成，抑制细胞外基质降解，导致肝纤维化形成［16］。从脂肪性肝纤维化大鼠肝脏分离得到的枯否氏细胞作用于肝星状细胞，可以发现肝星状细胞产生胶原。为了进一步证实TGFβ的作用，将抗TGFβ IgG预先与枯否氏细胞一起培养，然后去除多余的IgG，此时枯否氏细胞刺激肝星状细胞产生胶原的作用被抑制，表明脂肪性肝损伤中枯否细胞产生TGFβ是促进胶原形成的重要细胞因子［17］。另外，离体培养的肝窦内皮细胞上的受体可与TGFβ快速结合。肝窦内皮细胞上这种高亲和力受体的存在可能是TGFβ作用的重要途径［18］。研究显示，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体，停滞于G1／S期的肝窦内皮细胞数量与NAFLD的严重程度明显相关。TGFβ通过与肝窦内皮细胞受体结合抑制其增殖，使其分化为平滑肌样细胞，后者在肝纤维化中起一定的作用。肝窦内皮细胞增殖抑制还可能通过产生另一些中间介质刺激肝星状细胞分泌细胞外基质。人体内三种形式的TGFβ在NAFLD中均增高，并且随病变严重程度而增加，其mRNA表达水平明显增高。肝内TGFβ二聚体具有生物活性，还原剂可使二聚体分离，活性完全丧失，酸性微环境对于激活TGFβ有着重要意义。枯否氏细胞可能首先分泌非活性TGFβ，后者在细胞外或靶细胞表面激活，转化为活性形式的TGFβ而发挥作用［19］。
此外，本病还受遗传、环境、免疫和药物等因素影响，总之，NAFLD的发病机制具有多样性，仍有广阔的研究空间。我们坚信随着对本病研究的不断深入，其发病机制将会得到进一步的阐明，并为其有效的防治提供措施。
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