时间：2023-08-15 17:23:48
关键词 课程即资源活化 分散系 课堂教学 项目任务 观念建构教学 化学观念
“课程即资源活化”理念要求教学设计既关注学习者的外在行为，又要关注学习者的内在体验；既关注用基础知识历练学习者思维的科学价值，又要关注有限知识与广泛知识外延有机融合的社会意义。
“课程即资源活化”是在项目任务的驱动下，充分利用物质、信息、人力等资源要素进行教学活动的课程理念，它是受多元智能理论和建构主义理论启发而提出来的。资源不仅局限于教材，更要挖掘生产生活中的合理要素并活化到课堂教学中去；人力资源不仅发挥教师的能动性，还要挖掘学生潜在的课程要素并活用到课堂中去。教学不是教教材，而是创意设计教学任务，把相关资源课程化、活动化。目的是开放课堂、发展学生思维、构建基本学科观念。课堂是否有效决定于教师怎样调动一切有利于学生全面发展和终身学习的资源，推动课程价值的最大化。
1 “分散系及其分类”教学内容分析与教学目标的确定
1.1 教学内容分析
高中化学课程标准在“常见无机物及其应用”中提及：能根据物质的组成和性质对物质进行分类；知道（认知性学习目标最低要求）胶体是一种常见的分散系；实验：氢氧化铁胶体的制备；实验：铝盐和铁盐的净水作用。显然，从知识与技能的角度，胶体是这部分教学的重点和难点，对于胶体的性质仅需学生知道丁达尔效应。但是，为了以后学习盐类水解的应用，应该让学生知道胶体的介稳性，但不要求系统分析胶体的聚沉。
“分散系及其分类”内容位于人教版《化学1》的第2章第1节第2课时部分。在章题“化学物质及其变化”的背景下，“分散系及其分类”是以分散系为载体介绍物质的分类方法，在纯净物分类的基础上，再研究混合物的分类思想，为学习各类物质的性质铺垫基础。该部分的教学中引导学生开展探究活动的价值在于帮助学生进一步构建分类观和变化观。胶体的知识与学生以前所学的知识有所不同，它研究的不是某种物质所特有的性质，而是物质的聚集状态的变化表现出的特有性质，这是学生通过分类思想来研究物质、观察物质新的切入点。
1.2 教学目标
根据教学内容的分析与学生已有基础的分析，确立该部分的教学目标为：
（1）知识与技能：知道分散系的定义及其分类，能够对常见混合物进行分类，如硫酸钠与水的混合物属于固液分散系，也可以归属于溶液；掌握胶体的本质特征，能够从分散质粒子直径的角度区分溶液、浊液和胶体；知道浊液分散质粒子不可以透过滤纸和半透膜，胶体粒子可以透过滤纸，不能透过半透膜。掌握丁达尔效应，知道运用丁达尔效应鉴别胶体和溶液；了解胶体的应用，如江河入海口三角洲的形成。
（2）过程与方法：通过对常见分散系的分类，知道对混合物进行分类是对纯净物分类思想延伸应用；通过研究同一物质在不同分散状态的性质，使学生知道从分散质粒子直径的角度进行分类是更本质的一种分类思想。通过过滤操作和联系生活素材使学生悟出胶体分散质的直径在1～100 nm。通过观察烟雾和各种分散系对光的反映，理解丁达尔效应的概念及应用。通过观察电泳现象和解读布朗运动，告知学生胶体的介稳定性。
（3）情感、态度、价值观：通过对混合物进行分类，使学生认同分类思想对高中化学学习以及生产生活的指导意义。通过制备不同的分散系并继续深入探究其性质，使学生感受实验研究的重要作用和乐趣。通过过滤操作和医药案例的阅读分析使学生建立物质结构决定性质的基本规律，从而掌握认识世界的基本法则。通过同一种分散质在不同的分散剂中呈现的结构和性质的差异，让学生体会化学的变化观和粒子观。
2 资源活化思路
学生能否牢固地、准确地、哪怕只是定性地建立起基本的化学观念，应当是中学化学教学的第一目标。活化相关课程资源，引导学生建立的基本观念有：（1）可以根据分散质粒子大小、分散质或分散剂的状态等对分散系进行分类，按照分散质粒子大小对分散系进行分类，是区分溶液、胶体和浊液的本质所在。（2）物质性质不仅与物质的组成和结构有关，还与物质微粒的聚集状态有关，胶体性质是物质微粒的一种聚集形态的体现。（3）同一分散质的不同类分散系在一定条件下可以相互转化。（4）同类分散系具有相似的性质，分散系中的分散质和分散剂同时也保持各自的相对独立性[4]。
培养学生思考的能力，必须让学生面对相对比较真实的生活情境、丰富的信息资源环境和必须努力完成的项目任务，所以这节课设计了富于变化的实验、生活资讯情景，从医药案例和生活常识创设情境，激发学生的学习兴趣和求知欲，充分运用实验探究和列表对比的方法，层层推进，坚持课程即引领学生对资源价值的探究和以人为本的宗旨，注重对学生进行科学方法的训练和科学思维的培养，发展学生的逻辑推理能力以及分析问题、解决问题、总结规律的能力；变知识教学为理性思维主导的观念建构教学。
3 教学环节的设计及分析
3.1 明确概念、分类比较
[问题引入]①云蒸霞蔚壮观美景背后的科学道理是什么？
②氯化钠分散在酒精中还是溶液吗？
③大江大河人海口为什么都有三角洲？
[明确定义]把__物质分散在__物质中所得到的体系叫做分散系。某同学，把你扔进水里，你和水组成分散系了吗？笑答：没有，因为没有被“分散”。
[合作研讨]请利用交叉分类法将表1中的分散系进行分类。
[设计意图]通过学生对分散系的研讨，让学生发现自己身边有那么多的分散系，通过分类练习，体验分类思想在化学学习中的重要性。给学生提供挑战性的任务，迅速将生活资源课程化，增强学生注意力，渗透生活处处有化学的理念。
3.2 动手制作，辨析区别
[引导观察]小组合作制作3种常见的分散系，①将饱和氯化铁溶液滴加到沸水中，得到了红褐色的氢氧化铁胶体；②将饱和氯化铁溶液滴加到20mL冷水；③将饱和氯化铁溶液滴加到氢氧化钠溶液中。观察到什么现象，得到的3种混合物有什么异同？
[探究活动]分别过滤氢氧化铁胶体和氢氧化铁悬浊液（滤纸孔径约为100 nm，1 nm=10m）。观察实验现象，得出结论，并且进行解释分析。
[设计意图]通过亲身体验，学习胶体的一种制备方法，运用熟悉的过滤操作探究浊液和胶体分散质粒子直径的本质不同，把物质的分离实验方法运用于物质性质的探究当中，让学生感知化学作为实验科学的特性，在探究中学会区别胶体与浊液；另外对同一物质（三氯化铁）在不同分散情况下呈现出不同的性质进行研究，帮助学生从化学视角形成对“世界是普遍联系”的理解，加深学生对化学物质变化观的认识，体现实验资源活化基本观念的思想。
3.3 联系生活，分析胶体
[阅读医药资料，分析探讨]为什么重金属铋在人体中没有使人中毒，反而起到治疗胃病的效果？
[药品名称]通用名称：胶体果胶铋胶囊
[成份]胶体果胶铋，是一种果胶与铋生成的组成不定的复合物。
[性状]本品为胶囊剂，内容物为黄色粉末或颗粒。
[作用类别]本品为胃黏膜保护类非处方药药品。
[适应症]用于慢性胃炎……
[药物相互作用]1.不得与牛奶同服。2.如正在服用其他药品，使用本品前应咨询医师或药师。
备注：胶体果胶铋为胃肠黏膜隔离剂，在酸性胃液中形成稳定的胶体，对溃疡面有保护作用，促进溃疡愈合和炎症消失，杀灭幽门螺旋杆菌，适用于溃疡病、各种胃炎等。肠胃只能吸收小分子和离子（小分子或离子直径一般小于1 nm），不能吸收大于1 nm的颗粒物质，故肠胃黏膜可以称为“半透膜”，其他半透膜还有鸡蛋壳内膜、动物膀胱等。
[设计意图]将医药的常识与胶体性质建立联系，通过合作研究和对比分析，让学生总结出胶体分散质粒子直径在1～100 nm，使学生感知在生活中化学的应用价值，也是利用医药资源建构化学基本概念。在学生推理过程中，必然发展了学生的理性思维，因为化学是在分子原子水平上研究物质的，而理性思维属于思维，它是以微观物质思维宏观物质思维的。
3.4 类比归纳，探究异同
[提出问题]合作研讨各种分散系的区别，填写表2，进行小组汇报交流。
[设计意图]引导学生通过对类似物质性质进行比较和分析，增强分类观念，培养学生的综合分析能力。小组汇报的另一层用意是让学生及时归纳，发展学生的思维能力的同时培养学生利用图表表达信息的方法。教师的总结可以让学生对比自己的结论，查缺补漏，使知识系统化、条理化，意在利用化学表征资源提高思维能力。
3.5 聚焦胶体，探求特性
[提出问题]教师演示浓盐酸与浓氨水所生成的烟对光的散射实验，讲述丁达尔效应的光学原理，请同学们用自己的激光灯照射自己实验台上的各种分散系，如硫酸铜溶液、松香胶体、稀墨水、稀牛奶、氢氧化铁胶体、泥水、氯化钠与酒精组成的分散系等，小组合作分析什么分散系具有丁达尔效应？丁达尔效应能够用于区别什么分散系？
[总结提升]当光线通过胶体时，由于胶体粒子对光有__作用，所以从入射光的垂直方向（或从侧面）可以看到__。用途：鉴别__和__。
[设计意图]丁达尔效应是胶体作为分散系整体表现的系统属性，分散系中的分散质和分散剂保持混合前的相对独立性。让学生置身不同胶体丁达尔效应的情境之中，寓情趣生思维，充分调动人的能动性，从而掌握规律，提高对胶体的整体认识，用填空方式引导学生思维活动，有利于突出重点和准确表征。
[演示实验，展示实例]教师向学生演示胶体的电泳现象和布朗运动的动画，展示静电除尘图片，请学生分析讨论，电泳现象说明了为什么胶粒会定向运动？联系静电除尘说明了胶粒什么特点？胶体为什么比较稳定？
[总结提升]观看电泳现象，联系静电除尘分析胶体稳定存在的原因：（1）胶体粒子因吸附离子而带有__，同种胶体粒子电性__，它们之间的相互__阻碍胶体粒子变大，使胶体粒子不易聚集，这是胶体稳定的主要原因。（2）__使胶体粒子不容易聚集成质量较大的颗粒而沉降下来，这是胶体稳定的次要原因。
[设计意图]从实物分析中得出胶体中胶粒吸附离子而带电的事实，进而说明胶体稳定的基本原因，提出胶体介稳性；属于告知内容，适于点到为止，为课后延伸探究学习留下悬念。
[灵活运用]教师安排学生将自己实验台上的氯化钠溶液倒入氢氧化铁胶体中，观察胶体介稳性，组织学生讨论江河人海口三角洲的成因？
[回归主题]教师要求学生独立思考，运用当堂所学知识特别是分类的思想给胶体下一个准确的定义。
胶体是一种分散质粒子直径在1～100 nm的分散系。
[设计意图]运用所学解释自然现象，使学生体验化学微粒的变化观念。通过探究胶体的本质特征和主要性质，再回到分类思想的高度给胶体下一个严谨规范的定义，信任并利用学生的信息整合能力。
4 教学反思
该教学设计经过实施后，取得了较好的教学效果。学生从内心喜欢上了对物质进行分类的研究，对分散系的认识比较深入，完全能够自主建构胶体概念，较好地落实了三维教学目标，激发了学生进一步的学习热情，他们主动查阅资料分析了“雾霾”、“云蒸霞蔚”、氯化钠在乙醇中等与胶体知识的关系。
蜂胶的营养价值
从蜂胶中已经分析出20大类300余种化学成分，其中主要有黄酮类化合物75种；芳香族类化合物50种；萜烯类化合物31种；甾体类化合物9种；大分子烃类化合物27种；各种有机酸、酚、醇、醛、醚类43种；脂肪酸及酯类化合物51种；氨基酸类化合物25种；多糖类9种；维生素A、维生素B、维生素C、阿魏酸以及各种微量元素41种。可以说其营养价值丰富，各种成分组成科学合理。
蜂胶的生理功能
近几十年来，国内外许多医药学、营养学家对蜂胶的有益成分、药理作用和保健功能进行了大量研究，证实蜂胶对人体的许多疾病有良好的治疗和保健作用。
保护心脑血管系统蜂胶中的黄酮类化合物多种活性成分，可以改善血管的弹性和渗透性，舒张血管，清除血管内壁积存物，净化血液，降低血液黏稠度，改善血液循环状态和造血机能等。这类物质抗氧化性很强，是对付自由基的有力武器，能够保护血管不过早变脆、变硬、失去弹性，因而有利于改善血液循环、防止心脑血管并发症，对高血压、冠心病、脑血栓、动脉硬化等患者有着特殊的医疗保健作用。日本著名医学博士木下繁太郎曾报道过蜂胶对高血压、低血压、白血病症奏效的实例。中国预防医学科学院营养局卫生研究所表明，蜂胶中的黄酮类化合物等能明显降低血液中胆固醇、甘油三酯的含量，因而可用于预防高血脂症，以及由此引起的心脑血管疾病。所以蜂胶又有血管清道夫的美称。
抗癌作用近年来世界各国的研究人员，通过采用不同肿瘤细胞株对蜂胶中很多成分进行了大量试验，发现这些成分对肿瘤细胞有一定程度的抑制作用。
亚硝胺和黄曲霉素是目前了解的具有高致癌性的物质。蜂胶中的酚、酸类化合物可以阻断体内亚硝胺的合成。蜂胶中的黄酮可以诱导机体分泌苯比芘羟化酶，可以解除黄曲霉素等致癌物的毒害作用。人们观察到一个事实：全世界的养蜂人绝少出现癌症。美国的蜂胶抗癌研究资料显示，蜂胶有超级抗原，从蜂胶中提取的PRCA超级抗原，使癌基因死亡密码被破解。PRCA被世界卫生组织称为诱导癌细胞凋亡反应因子，它可以直接攻击癌细胞的DNA，破坏癌基因，使癌细胞在3个月至一年内全部失去活性。
治疗糖尿病的作用蜂胶治疗糖尿病的最大意义不仅仅是蜂胶的降糖作用，而是蜂胶对糖尿病患者的综合治疗作用。目前国内外上百名科学家经数十年实验结果表明，蜂胶具有独特的抗生能力和识别能力，可以区别有害菌和有益菌（如细菌、真菌、病菌、病原微生物等）。另外，大量研究证明，蜂胶能刺激免疫机能，能增强抗体生成量，增强吞噬细胞活力，是一种天然的高效免疫增强剂。对糖尿病患者增强体质，提高生活质量都具有非常重要的意义。我国刘海富等学者研究报道，蜂胶提取物有显著的降糖效果。其降血糖总有效率达94.7%，有39%的2型糖尿病患者服用一周后，血糖指标就可以恢复到正常水平；有55%的1型和2型糖尿病患者在原来治疗的基础上使用蜂胶，可使一直居高不下的血糖值逐步下降。对1型糖尿病患者也可逐步减少胰岛素的使用量。
对肠胃道的作用蜂胶具有很强的抗幽门杆菌的作用，是很好的天然抗生素。既能抑制并清除幽门螺旋杆菌，又不会造成人体消化道菌群比例失调，同时蜂胶有良好的成膜性，是胃黏膜保护剂，能够在胃黏膜上形成酸不能渗透的薄膜。利用蜂胶这一特性，人们应用蜂胶治疗胃及十二指肠溃疡，且获得疗效。
抗菌消炎作用炎症是机体对遭受外界伤害时的一种保护性反应，其发炎的过程较为复杂。在炎症的发病过程中脂质氧化酶起着重要作用。蜂胶是珍贵的天然广谱抗生物质，具有抗菌消炎、抗病毒作用，能够同时抑制或杀灭细菌、真菌和病毒，对各种皮肤病（如带状疱症、鸡眼、脚气、痤疮、湿症等）及各种外伤（创伤、烧伤、烫伤等）有明显作用。对鼻炎、鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、红斑狼疮、气管炎、瘙痒等有明显疗效。对类风湿关节炎、老年性痴呆、甲状腺囊肿等有极好的辅助治疗作用。蜂胶含有大量的类黄酮和肉桂衍生物，它们具有抑制氧化酶的活性，使得蜂胶具有良好的消炎作用。而且蜂胶作为天然抗生物质，与合成的抗生素有不尽相同的作用，长期服用不会产生耐药性和毒副作用，食用非常安全。
治疗肝脏病国内外许多医学专家对蜂胶治疗乙型肝炎进行了大量基础和临床应用的研究，证明蜂胶制品能有效提高乙型肝炎患者的免疫功能，具有很强的抗乙肝病毒作用。对患者肝的循环系统有很好的改善作用，可促进肝细胞再生，修复受损细胞，对肝脏其他类型疾病也同样有效。蜂胶提取物可保护肝细胞免受乙醇、四氯化碳、半乳糖胺、丙烯基乙醇等毒素物质的损伤。尤其是蜂胶水提取物中的二咖啡醇喹尼酸具有很强的保肝作用，使肝脏在糖代谢中发挥作用，可将进入人体内的葡萄糖合成糖原储存。也可将肝糖原分解为葡萄糖输入血液内以此调节血糖浓度，使血糖维持正常水平。
治疗更年期障碍作用女性更年期是卵巢功能逐渐衰退到消亡的过渡时期，是由于内分泌的紊乱、植物神经失调引起的。蜂胶中含有丰富的营养素与活性物质，能增强细胞的活性、促进组织再生、抗菌消炎、修复病变的组织器官及其功能，还能促进内分泌活动、调节植物神经机能，有效治疗因更年期引起的精神倦怠、烦躁、减退及器官组织衰老征兆等症状。对男性更年期也适用。
抗氧化和清除自由基的作用机体中的自由基和脂质过氧化物质等是诱使DNA损伤，破坏细胞完整性的有害物质，也是促使很多器官和组织遭受损伤的因素（另有文献将脂质过氧化物称为催老物质）。机体衰老、病理过程与体内自由基和脂质过氧化物非常聚集有关。
蜂胶中的黄酮类化合物、类黄酮、萜烯类化合物等都具有很强的清除体内过剩的自由基的作用，从而避免机体正常组织被破坏，保证了机体的健康。
局部麻醉和镇痛作用蜂胶及其制剂外用治疗人体创伤和皮肤病，能迅速止痛和止痒，提示蜂胶有局部麻醉和镇痛作用。蜂胶的镇痛作用与其局麻作用有关，其中局部麻醉物质具有挥发性，如将蜂胶内挥发性物质除掉，则可使蜂胶完全失去局部麻醉和镇痛作用。
关键词：胶原生物医用材料；优势；临床医学应用
生物医学材料是一类对人体细胞、组织、器官具有增强、替代、修复、再生作用的新型功能材料。它有独特的基本要求：①具有生物相容性，要求材料在使用期间，同机体之间不产生有害作用，不引起中毒、溶血、凝血、发热、过敏等现象；②具有生物功能性，在生理环境的约束下能够发挥一定的生理功能；③具有生物可靠性，无毒性，不致癌、不致畸、不致引起人体组织细胞突变和组织细胞反应（即“三致物质”），有一定的使用寿命，具有与生物组织相适应的物理机械性能；④化学性质稳定，抗体液、血液及酶的作用；⑤针对不同的使用目的具有特定功能。按生物医用材料性质的不同可分为四大类：①医用金属材料。主要用于硬组织的修复和置换，有钴合金（Co-Cr-Ni）、不锈钢、钛合金（Ti-6Al-4V）、贵金属系、形状记忆合金、金属磁性材料等7类，广泛用于齿科填充、人工关节、人工心脏等。②医用高分子材料。有天然与合成两类，通过分子设计与功能拓展，即合金化、共混、复合（ABC）等技术手段，可获得许多具有良好物理机械性能和生物相容的新型生物材料。③生物陶瓷材料。有惰性生物陶瓷（氧化铝陶瓷材料、医用碳素材料等）和生物活性陶瓷（羟基磷灰石、生物活性玻璃等）。④医用复合材料。由两种或者两种以上不同性质材料复合而成，取长补短，达到功能互补。主要用于修复或者替换人体组织、器官或增进其功能以及人工器官的制造。胶原属于细胞外基质的结构蛋白质，结构复杂，根据分子结构决定功能和性质的原则。其分子量大小、形状、化学反应以及独特的生物分子等对功能、性质起着决定性作用。胶原来源广泛，资源丰富，性质特殊。是21世纪生物医学材料研究和应用的热点和重点[1]。
1胶原生物医学材料的优势
（1）低免疫源性。组织胶原具有一定的免疫性，20世纪90年代研究发现，其免疫源性来自于端肽及变性胶原和非胶原蛋白质，在提取胶原时，除去端肽及纯化分离掉变性胶原和非胶原蛋白，能得到极弱免疫原性的胶原材料。（2）与宿主细胞及组织之间的协调作用。其特点：①胶原有利于细胞的存活和促进不同类型细胞的生长；②胶原不但可增加细胞黏结，而且有利于控制细胞的形态、运动、骨架组装及细胞增殖与分化。（3）止血作用。胶原的四级特殊结构能使血小板活化、释放出颗粒成分，起到迅速凝血的作用。（4）可生物降解性。胶原是一种特殊的生物降解材料，其降解性作为器官移植的基础。（5）物理机械性能。胶原的三螺旋结构以及自身交联而成网状结构，使其具有很高的强度，可满足机体对机械强度的要求；另外通过进一步的交联增强其强度，而且采用不同的交联剂可获得不同的强度和韧性材料。通过复合和接枝共聚能获得更多性能优良的材料。（6）组织工程（Tissueengineering）。胶原的优良特性使其在组织工程中扮演更重要的角色，大量应用于临床，前景广阔。
2胶原在生物临床医学上的应用
[2]（1）手术缝合线。当前应用的天然与合成材料制备缝合线均存在这样那样的不足和缺陷，或者不能自然吸收，需要拆线；或者与组织反应大，引起发炎、造成伤口瘢痕明显；或者吸收时间过长等。而胶原制备的缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性；使用时有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，有较好的平滑性和弹性，缝合结头不易松散，操作过程中不易损伤肌体组织。可采用复合与交联改性方法提高缝合线功能和性能，制备的可吸收缝合线有：①纯胶原可吸收缝合线；②胶原/聚乙烯醇共混复合；③胶原/壳聚糖复合可吸收缝合线；④胶原/壳聚糖/聚丙烯酰胺复合可吸收缝合线。（2）止血纤维。胶原纤维是一种天然的止血剂和凝血材料，且止血功能优异。胶原纤维是一种集止血、消炎、促愈为一体，可被组织吸收，无毒、无副作用的医用功能纤维，相比于以前使用的氧化纤维素、羧甲基纤维素及明胶海绵等止血材料，其效果要好的多。（3）止血海绵。胶原海绵有良好的止血作用，能使创口渗血区血液很快凝结，被人体组织吸收，一般用于内脏手术时的毛细血管渗出性出血。临床应用于普外科、心血管外科、整形外科、泌尿外科、骨科、皮肤科、烧伤科、妇产科以及口腔科、耳鼻喉科、眼科等几乎所有的手术。（4）代血浆。当人体由于外伤或其他原因发生意外急性失血时，最佳方法必须立刻输血，但众所周知，血液来源非常困难！而且不能长久保存，输血之前还需鉴定血型和配型。因此，寻找理想的代用品成为人们的梦想。20世纪50年明胶代血浆受到重视，且符合血浆的条件和性质，国外已大量使用，我国正在积极推进其产业化。国外明胶类代血浆有脲交联明胶、改性液体明胶和氧化聚明胶3种。国内有氧化聚明胶、血安定（Gelofu-sine）海星明胶和血代（Haemaccel）。（5）水凝胶。水凝胶是一些由亲水大分子吸收了大量水分形成的溶胀交联状态的半固体（三维网络），能保持大量水分而不溶解，具有良好的溶胀性、柔软性和弹性，以及较低的表面张力等特殊性质。交联方式有共价键、离子键和次级键（范德华力、氢键等）。水凝胶是高分子凝胶中的一类，可分为物理凝胶和化学凝胶。为改善性能需对天然高分子与合成高分子进行共混复合制备新型水凝胶（互穿网络水凝胶），现已取得很大进展。制成的复合材料有胶原/聚甲基丙烯酸羟乙酯水凝胶、胶原/聚乙烯醇水凝胶、胶原/聚异丙酰胺水凝胶、胶原/壳聚糖水凝胶等。（6）敷料。敷料是能够起到暂时保护伤口、防止感染、促进愈合作用的医用材料。有普通敷料（常用植物纤维纱布）、生物敷料（胶原蛋白及其改性产品以及左旋糖酐、壳聚糖、淀粉磷酸酯等）、合成敷料和复合敷料等四种。开发使用的品种有海绵型敷料、胶原膜敷料、凝胶敷料。（7）人工皮肤。人工皮肤是在创伤敷料基础上发展起来的一种皮肤创伤修复材料和损伤皮肤的替代品。其制备方法采用复合与交联法，一是提高胶原的机械强度；二是胶原与其他天然高分子进行杂化改善机械性能和生物活性。（8）人工血管。人工血管是近年来组织工程（一门多学科的交叉科学）研究的重点之一。当今临床应用的人工血管主要是人工合成材料制成的，最早是涤纶纤维编织的人工血管，但只能对大口径血管有较短的替代作用。后来开发聚四氟乙烯（PTFE）、聚氨酯（PU）、膨体聚四氟乙烯（ePTFE），并采取多种方法进行改性，以适应血管植入的要求。此外，还有生物降解材料如聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸异构体（PLLA）等。（9）人工食管。分为两种，一种是用自身的其他组织或器官（如结肠、空肠、胃、胃管和游离的空肠等）加工而成，现已广泛应用于临床，优缺互见；另一种是人工合成材料加工而成，比如塑料管、金属管、PTFE管、硅胶管等，效果均不理想。最早制成使用的聚乙烯（PE）管，此后发展了PTFE、硅橡胶、硅胶涂覆的涤纶编织管（PET）、碳纤维管等。近年以来，使用聚乙烯醇（PVA）、PLA降解塑料。用降解塑料制作无细胞支架的人工食管、组织工程化食管等。（10）心脏瓣膜。分为机械瓣膜（金属瓣）和生物瓣膜。心脏瓣膜支架材料有可降解合成高分子和生物高分子。可降解合成高分子有PLA、PGA及二者共聚物（PGLA），此外还有聚β—羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯（PHB）；生物高分子材料有胶原、纤维蛋白凝胶、去细胞瓣膜支架等。（11）骨的修复和人工骨。目前仍以金属（不锈钢、钴铬合金、钴镍合金、钛合金）为主；高分子材料，诸如PTFE、聚硅氧烷、高密度聚乙烯（HDPE）、陶瓷（结晶氧化铝、羟基磷灰石）以及复合材料。胶原以其独特的性能成为不可或缺的生物材料，在骨修复中起举足轻重作用。①在组织引导再生术中（guidedtissueregeneration,GTR）能起到“诱导成骨”、“传导成骨”，实现再生修复和骨愈合的作用。②组织工程化骨组织的构建。包括三个方面：一是寻求能够作为细胞移植与引导新骨生长的支架结构作为细胞外基质（ECM）的替代物；二是种子细胞；三是组织工程骨的组织还原（骨缺损修复）。（12）角膜与神经修复。角膜胶原膜和组织工程化角膜；人工神经支架采用胶原、胶原/壳聚糖或胶原/糖胺聚糖等。（13）药物载体。药物载体由高分子材料充当，大多数为传递系统，其主要成分是胶原和明胶。有胶原膜、胶原海绵、药用胶囊和微胶囊和丸剂与片剂。（14）固定化酶载体。胶原可作为细胞或酶的载体，其特点：①胶原本身是蛋白质，对酶和细胞的亲和性是其他材料不可及的；②胶原蛋白成膜性好，可制成各种酶膜；③胶原蛋白肽链上具有许多官能团，诸如羧基、氨基、羟基等，易于吸附和固化。胶原蛋白有很好的生物相容性，在体内可被逐步吸收，交联接枝共聚后赋予了材料良好的物理机械性能，且可在体内长期保存。广泛应用于人体的各个部位。生物医学材料在人体的应用部位，详见图1[3]。
3结语
随着社会文明的不断进步，生命至上理念不断深入人心，天赋人权，生命是任何人都不能剥夺的最高权利，人类对身心健康和生活质量越来越重视。当前，新型材料更多的应用于医药和临床，尤其如胶原基生物材料，以其独特的优势和优异的性能在这一领域大显身手。科技改变未来、改变生活，天然高分子与合成高分子材料通过共混、复合、合金化、纳米化等技术手段，制备成多种新颖独特的新材料和新产品。尤其应用于临床和组织器官工程挽救了数以万计的人类生命并提高了生命质量和延长了寿命。随着3D打印技术在生物医疗领域的快速发展，如何制备出适合3D打印的不同类型胶原蛋白材料，并保证在打印过程中蛋白不变性、强度可控、易塑性等成为研究的新课题[4]。
当今，是生物高分子时代，随着科技发展日新月异，生命科学和生物材料研究的不断深入。生物医药是“十四五”的新兴产业链。胶原在生物医学、医药、组织器官工程和临床医学的应用将更加光明，潜力非常巨大。开发应用必将成为广大科研人员研究的重点和热点，我们将拭目以待有更多的新型材料和产品为人类的健康服务并造福人类。
参考文献：
[1]王璐，但卫华，但年华.胞牛皮源高层级胶原聚集体的制备与表征[J].皮革科学与工程.2019，29（05）:16-22.
[2]将挺大胶原与胶原蛋白[M].化学工业出版社，北京，2006.03：186-251.
[3]韩冬冰，王慧敏.高分子材料概论[M].中国石化出版社，北京，2008.07:126-142.
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2011）03-0070-03
蜂胶是蜜蜂从植物芽苞或树干上采集树胶混入其上颚腺分泌物和蜂蜡后加工制成的树脂状固体物质，含有树胶、树脂、蜂蜡、芳香挥发油及花粉等，其化学成分复杂，随产地和蜜蜂种类不同而异，具有高度的复杂性和多样性，主要含有大量黄酮类化合物、多种有机酸、萜类、酚类化合物和20余种微量元素等多种成分［1］。蜂胶性平，味微甘、苦，有润肤生肌、消炎止痛的功效［2］。近年来，通过对蜂胶药理活性的研究发现蜂胶主要有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎症等作用，对心血管系统疾病、糖尿病亦有治疗作用，还具有增强人体免疫力、促进皮肤健康及抑制癌症等功效，因此，越来越多地运用到医学领域中来，本文就单味蜂胶近5年来在医学领域实验方面的研究进展综述如下。
1实验研究进展
1.1蜂胶抗衰老抗氧化的实验研究由于我国社会老龄化问题日渐突出，老年人随着年龄的增长免疫功能衰退或紊乱是老年机体对传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病易感的重要因素，老年人的机体一般表现为免疫功能低下［3］。庞美霞等［4］通过对衰老动物系统试验，探讨蜂胶对高龄小鼠抗衰老机理，研究发现适量蜂胶可以明显提高高龄小鼠免疫力低下的NK细胞活性和Mφ细胞活性、使淋巴细胞增殖、提高老龄小鼠的IL-1和IL-2；还可明显降低MDA含量，提示其具有较强的清除活性氧自由基作用；明显提高SOD活性，提示其具有较强的清除活性氧自由基、抗氧化的作其机制可能与其明显提高抗氧化酶活性有关。王浩等［5］从改善动物学习记忆功能入手，为研究蜂胶的抗衰老作用提供科学依据。以小鼠为实验对象，复制3种不同模型观察，通过Y型迷宫测试，发现蜂胶乙醇提取物对东莨菪碱诱导的学习记忆障碍具有保护作用，提示其增强学习记忆作用可能与提高中枢胆碱能神经系统功能活动有关；对亚硝酸钠诱导的小鼠长期记忆巩固障碍有明显的改善作用，且作用与西药脑复康对照组相当；对三氯化铝所致的急性衰老小鼠学习记忆功能衰退也有改善作用。韩小燕等［6］通过给小鼠灌服蜂胶，观察蜂胶对小鼠血浆自由基代谢的影响及对红细胞的保护作用，结果表明蜂胶能够显著升高红细胞，蜂胶组红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著升高，SOD活性显著高于对照组，血浆MDA含量显著低于对照组，可见蜂胶可以明显改善机体的抗氧化能力，减少自由基的生成，对红细胞有一定的保护作用。
1.2蜂胶调节免疫功能的实验研究徐德洲等［7］以小鼠为实验对象，从细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性等4个方面，对蜂胶的免疫功能的调节作用进行了实验研究。结果表明，蜂胶具有增强DNFB引起的小鼠迟发性变态反应和小鼠淋巴细胞增殖能力，提高小鼠的半数溶血值、抗体生成细胞数；增强小鼠单核―巨噬细胞碳廓清的能力及提高NK细胞活性。庞阳康［8］研究蜂胶对实验动物的免疫功能的影响，运用小鼠游泳训练模型，以测定其脾指数和胸腺指数、外周血WBC、淋巴细胞数量以及T淋巴细胞亚群为观察指标，结果表明蜂胶能提高运动小鼠外周血CD4+百分比、CD4+/CD8+比值，从而具有抵抗力竭游泳训练对T淋巴细胞免疫功能的抑制作用；还可抵抗长时间力竭游泳训练引起的机体免疫器官的损伤。付俊鹤等［9］以小鼠为研究对象，探讨精制蜂胶对正常小鼠免疫功能的影响，结果发现与阴性对照组比较，高剂量组能明显提高小鼠的迟发型变态反应的能力，能明显提高胸腺体重比值、小鼠抗体生成细胞数、半数溶血值，明显增强小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力，明显提高小鼠NK细胞活性，证明精制蜂胶具有潜在增强免疫力的作用。
1.3蜂胶护肝作用的实验研究根据近年来报道的蜂胶药理作用提示，其在保护肝损伤方面也大有优势可探。戴伟等［10］通过建立乙醇急性肝损伤模型，检测用药动物的肝组织中还原型谷胱甘肽（GSH）和甘油三酯（TG）的含量、丙二醛含量以及病理组织学切片，从而发现蜂胶能降低乙醇性肝损伤模型小鼠的肝组织中TG的含量，提高其肝组织中GSH含量，减轻其肝组织脂肪变性程度，从而证明了蜂胶对乙醇性肝损伤的保护功能。其作用机制可能为抑制脂质过氧化、提高GSH含量、稳定肝细胞膜系统、促进肝组织修复等。陈小囡［11］利用大鼠酒精肝模型研究蜂胶对机体内超氧化物岐化酶（Super-oxidedismutase，SOD）活力及丙二醛（Malondialde-hyde，MDA）含量的影响，实验表明酒精性肝损伤（ALD）大鼠肝组织内SOD活性较正常对照大鼠明显降低，MDA明显升高；用蜂胶灌胃12周后，ALD大鼠肝组织内SOD活性明显升高，MDA明显下降，说明蜂胶具有抗氧化，清除氧自由基的能力，抑制脂质过氧化，从而减轻氧自由基诱导的肝细胞破坏。马秋霞等［12］研究蜂胶乙醇提取物对扑热息痛（APAP）致小鼠急性肝损伤的保护作用并探讨其可能的作用机制。实验检测小鼠血清ALT、AST和LDH的活性；观察肝脏组织病理变化情况和肝体比；测定肝组织匀浆GSH、GSSG和MDA的含量。结果表明与模型组相比，蜂胶醇提物可以明显降低小鼠血清中ALT、AST和LDH的活性，降低肝组织中MDA的含量，升高GSH、GSH/GSSG比值，肝组织病理损伤明显减轻；而20%乙醇对照组对上述指标均无明显影响。可见蜂胶醇提物对APAP致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。
1.4蜂胶对血脂调节的实验研究喻建辉等［13］建立大鼠脂质代谢紊乱模型，给药后观测实验动物血清中甘油三酯、胆固醇、高密度胆固醇的含量，测试结果为蜂胶组血清甘油三酯及胆固醇含量明显低于溶剂对照组和阳性对照组，说明蜂胶对高脂血症有正面积极的调节作用。曾志将等［14］运用不同的蜂胶提取物―超临界蜂胶和乙醇提取蜂胶观测对大鼠血脂水平的影响，喂食28天后发现只有超临界蜂胶高剂量组的甘油三脂和乙醇提取蜂胶高剂量组的血清总胆固醇值分别与对照组有显著差异，其他指标差异都不明显。可见不同的蜂胶提取方法对实验动物血脂的影响也存在着差异，对蜂胶剂型方面的研究提供了依据。司艳红等［15］以小鼠为实验对象，将体内胆固醇逆转运作为研究靶点，试图阐明机体内对抗动脉粥样硬化的发生机制。经蜂胶干预后小鼠血浆中3H-胆固醇的分布在6h与24h明显升高，分别是对照组2.9倍和1.7倍，48h组差异无显著性；小鼠肝脏中剩余的3H-胆固醇的含量降低了39%；两天中粪便排除的3H-胆固醇降低了60%；而肾上腺中3H-胆固醇分布却明显增多，升高了84%；血浆高密度脂蛋白-胆固醇和总胆固醇的水平明显升高；血浆低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平变化不大；小鼠肝重、体重及肝重指数差异均无显著性，但是肝重及肝重指数有增高趋势。蜂胶在体内促进了外周巨噬细胞中多余的胆固醇的流出和肾上腺组织的利用。
1.5蜂胶治疗糖尿病方面的实验研究近几年运用蜂胶治疗疾病的实验研究主要集中在防治糖尿病方面。白金丽等［16］对糖尿病进行了初步药理学方面的研究，用四氧嘧啶制作糖尿病大鼠小鼠模型，观测动物的血糖值，实验结果提示蜂胶对四氧嘧啶所致的实验性糖尿病大鼠、小鼠餐后血糖具有显著降低作用，实验组中高剂量组及药物对照组与模型组相比血糖明显降低，实验组中小剂量组与模型组相比血糖下降，可见蜂胶能降低血糖并有剂量依据。郭贤文等［17］以大鼠为实验对象，观测蜂胶对正常大鼠血糖的影响及糖尿病大鼠的防治作用，实验发现蜂胶对正常大鼠的血糖没有影响，蜂胶能明显抵抗四氧嘧啶对大鼠的损伤，对大鼠糖尿病的发生和对糖尿病鼠有明显的改善血糖和治疗作用。周先汉等［18］运用不同剂型的蜂胶研究对正常小鼠和高血糖小鼠血糖的影响，发现在蜂胶净含量相同的情况下，蜂胶脂质体在降血糖、减缓高血糖小鼠消瘦症状和提高其抗氧化能力的效果较好；而3种剂型蜂胶对正常小鼠的血糖均无明显影响［18］。
1.6蜂胶治疗胃肠病方面的实验研究王泽军等［19］提取蜂胶的不同部位测试对胃排空和对小肠推进功能的影响。实验结果表明，蜂胶不同提取部位在促进消化功能方面，出现的药理效应不同，虽均降低小鼠胃中甲基橙残留率和促进小肠炭末推进率，但醇提物的作用较水提物为好，表明蜂胶具有良好的促进消化功能作用，这为今后开发应用蜂胶在消化系统疾病方面提供了临床依据。
2问题与展望
综上所述，近年来研究者对蜂胶具有的丰富的保健作用和药用价值十分关注，研究方向也日益增多，主要集中在其调节免疫功能、降低血脂、促智抗衰以及治疗糖尿病等方面，经过研究都取得了理想的效果，但对于蜂胶起效的作用机制还有待于进一步的研究。关于蜂胶对糖尿病发挥保护和治疗作用的剂量方面还有待于进一步研究；防治糖尿病的机制和靶点还于进一步探讨；蜂胶与其他药品或中药复方结合的研究也有报道，但还不多。
而根据蜂胶药理作用的前期研究报道提示，蜂胶化学成分复杂，药理作用多而广，尤其值得关注的是由于蜂胶具有良好的成膜性，能够在粘膜上形成一层不能渗透的薄膜［20］，抵御胃酸的侵蚀，并有止血、抗菌、促进溃疡面愈合等作用，所以在治疗胃溃疡、十二指肠溃疡等多种胃肠疾病方面也大有优势可探。笔者认为可以将蜂胶与单味中药或复方联合运用，利用蜂胶的药理特性研制出新型复合制剂，使二者的优势叠加，药理效用得到进一步拓展。
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[关键词] 蜂胶;糖代谢;调节机制
[中图分类号] R961 [文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)28-18-02
蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物幼芽及树干上采集树脂,并混入其上颚腺分泌物、蜂蜡和少量花粉经咀嚼加工而成的一种具有芳香气味的固体胶状物。
蜂胶中含有丰富的活性成份,如多酚黄酮类化合物、芳香酸及芳香酸酯、醛及酮类化合物、萜类化合物、甾体化合物、烃类化合物等。蜂胶具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、促进组织再生、降血糖、调节血脂、抗氧化等药理作用,2005年被收入《中华人民共和国药典》2005版一部。
随着生活水平的提高和饮食结构的变化,糖尿病在世界范围正成为现代疾病中的第二杀手,其对人体的危害仅次于癌症。近年来国内外学者对蜂胶应用于糖尿病的预防及治疗进行了探索,取得了一定进展。
1 蜂胶对糖代谢的调节作用及其机制
1.1蜂胶调节糖代谢的实验研究
糖尿病作为一种常见的内分泌代谢疾病,主要表现为机体对糖代谢的紊乱和血糖水平的升高,其急慢性并发症严重影响人们的健康。
大量动物实验证实蜂胶对糖尿病机体血糖具有调节作用。胡福良等[1]发现蜂胶水提液和醇提液均能降低糖尿病大鼠的尿酸、尿素、肌酐水平,并且蜂胶给药组大鼠的肾重/体重均比模型组低,说明蜂胶对糖尿病机体内的肾脏组织具有保护作用。他们还发现蜂胶能降低糖尿病大鼠体内蛋白质的消耗,升高糖尿病大鼠体内总蛋白、白蛋白的水平,同时升高白蛋白/球蛋白的比值,表明蜂胶可以调节糖尿病大鼠体内蛋白质的代谢[2]。蜂胶水提液和醇提液能改善糖尿病SD大鼠的糖、脂肪、蛋白质代谢,减少糖尿病肾病的危害;还能控制糖尿病大鼠空腹血糖的升高,且随着使用时间的延长,效果越来越明显。董捷等[3]也发现蜂胶复合软胶囊可显著降低四氧嘧啶所致糖尿病大鼠的血糖值,对正常大鼠的血糖也有一定的降低作用。
1.2 蜂胶降血糖的机制
1.2.1 抗氧化作用糖尿病患者血糖升高与体内自由基产生增加有关,自由基、脂质过氧化、低密度脂蛋白氧化性的改变参与了糖尿病的进一步发展。张国文等[4]以蜂胶提取液灌胃来测定蜂胶对小鼠及卵巢组织过氧化物歧化酶活性的影响,发现蜂胶提取物可明显提高组织中SOD活性,提示蜂胶具有清除自由基和抗氧化作用。王桂云等[5]发现试验组的小鼠胸腺SOD活性明显高于未服用蜂胶的对照组,提示蜂胶对衰老小鼠胸腺细胞的退行性变化具有改善或延缓作用。金毅等[6]研究了蜂胶的聚酰胺柱分离组分对Fe2+/半胱胺酸氧化损伤的体外原代培养乳鼠心肌细胞的保护作用,结果蜂胶组分C可以减轻活性氧自由基对生物膜的破坏和对SOD 的损伤,表明蜂胶组分C具有抗氧化作用。钟立人等[7]发现蜂胶的各种溶剂提取物均有抗氧化作用,且在一定范围内与蜂胶提取物的添加量成正比,其中乙醇提取物最强,可与维生素E和芦丁相媲美。
蜂胶中至少有两种物质起抗氧化作用:一类是黄酮类物质,这类物质主要通过螯合金属离子阻止羟基自由基的形成和清除自由基而起抗氧化作用,是蜂胶抗氧化作用的主要成分;另一类是咖啡酸酯类,如咖啡酸苯乙酯(CAPE),这类物质抑制黄嘌呤氧化酶的生成,从而减少自由基的产生,同时也具有清除已生成的自由基的作用。
1.2.2 增强免疫功能的作用免疫功能增强是提高机体抗病能力,提高整体素质,防止糖尿病及其并发症的重要基础。
蜂胶作为天然免疫刺激剂,能强化免疫系统,增强免疫细胞的活力。对免疫系统的中心器官胸腺,蜂胶可促进产生大量T细胞;蜂胶能促进脾脏产生大量淋巴细胞,有丰富的B细胞,可分泌特殊性抗体;对骨髓、淋巴结等整个系统产生有益的影响。
唐传核等[8]报道,蜂胶具有复活巨噬细胞作用,用小鼠巨噬细胞作实验,采用蜂胶萃取液来处理。结果表明,蜂胶作用3h时观察巨噬细胞的活性,发现随着蜂胶浓度的增高,活化作用加强,当作用24h时从低浓度到高浓度均呈现出较强的活化作用。
李淑华等[9]研究蜂胶对免疫功能低下模型鼠细胞免疫功能的影响,发现蜂胶乙醇提取物能促进ConA诱导的淋巴细胞增殖,增加T细胞总数,并调整T细胞亚群紊乱,对免疫功能低下的小鼠细胞免疫功能具有免疫刺激和免疫调节作用。蜂胶水溶物及蜂胶中的咖啡酸CA和CAPE 经研究证实是蜂胶发挥免疫调节作用的活性物质,其通过保护脾细胞结构,增加脾细胞对多克隆的致有丝分裂因子的反应,增加巨噬细胞活力及增加细胞因子,提高IL-2和IFN γ的水平,进行免疫调节[10,11]。
1.2.3 对体内酶系的作用α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4糖苷键水解,是促进小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解的酶。近年来,对天然药物的研究发现,黄酮类化合物对一些水解酶具抑制作用[12]。
研究显示,蜂胶抑制餐后血糖升高可能缘于其对体内糖代谢酶系的影响。Toshiro等[13]的研究证实巴西蜂胶对α-葡萄糖苷酶有抑制作用,其水溶性成分中的3,4,5-tri绿原酸是强有力的麦芽糖酶特异性抑制剂,另有一些咖啡脂类化合物及奎宁酸等也起到了非竞争性抑制剂作用。
醛糖还原酶AR催化下葡萄糖转化为山梨醇的增加是多种糖尿病慢性并发症发病的主要机制之一。对多种黄酮类化合物的研究证明,槲皮素、栎皮苷、杨梅苷等可抑制AR的活性[14]。还证实蜂胶富含黄酮类化合物,对AR有抑制作用[15]。
2蜂胶在糖尿病治疗领域中的临床应用
其实,糖尿病本身并不可怕,可怕的是糖尿病的并发症,糖尿病的危害几乎都来自其并发症,其中尤以心血管疾病为显著。在中国糖尿病患者中合并冠心病者高达600多万。
土耳其科学家Okutan[16]等比较了绿蜂胶提取物CAPE对糖尿病心脏组织的保护作用,他们将实验鼠随机分为三组,即对照组正常鼠、蜂胶治疗组(糖尿病鼠)和非治疗组(糖尿病鼠)。在用蜂胶提取物治疗8周后,检测各组心脏组织中丙二醛(MDA)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的改变,以了解蜂胶对糖尿病心脏病是否具有保护作用。结果显示,糖尿病心脏组织中MDA、SOD和CAT显著升高,造成对心脏的损害。使用蜂胶提取物治疗后8周,MDA、SOD和CAT均较非治疗组显著降低,且接近正常心脏组织水平(P
高海琳等[17]将蜂胶应用于糖尿病的综合治疗中,对50例2型糖尿病患者和3例1型糖尿病患者随机分为蜂胶治疗组和对照组进行了为期2 年的临床疗效观察,发现服用蜂胶后空腹及餐后2h血糖明显下降,原应用胰岛素治疗的患者在服用蜂胶后均不同程度地减少了胰岛素用量;对蜂胶组治疗前后血清胰岛素水平与对照组进行了比较,发现蜂胶没有刺激胰岛素分泌的作用,不会导致高胰岛素血症。
刘洪昌[18]对11例Wagner分级为1～2级糖尿病足,在降糖等综合治疗的基础上配以复方蜂胶液外用治疗,经综合治疗后,血糖控制稳定,6 例无感染创面,经26～40d溃疡面完全愈合,5例感染创面经35～63d全部愈合,平均愈合天数43d。早期糖尿病足在综合治疗的基础上予以复方蜂胶液外敷加红外线照射有助于溃疡面尽快恢复。
楚勤英[19]将38例2型糖尿病II级糖尿病足患者随机分为蜂胶换药组及对照组,观察患者的伤口愈合情况,结果提示蜂胶换药组的有效率为94.7%,高于对照组的68.4%(P
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【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6
【摘要】 目的 探讨prp105132作用下体外小胶质细胞的活化及对il6产生的影响。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量prp105132(0、20、40、80 μmol/l)干预小胶质细胞，elisa法检测24 h后细胞上清液中il6含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp105132剂量的增加，il6分泌量增多(p<0.01)。结论 prp能够诱导体外小胶质细胞分泌il6，并且具有剂量依赖关系。
【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6
【abstract】 objective to investigate the microglia secret il6 in the condition of prp105132. methods rat microglia culture was exposed to prp105132(0, 20, 40, 80 μmol/l) in vitro. the il6 level in cell supernatant was measured by commercial enzyme immunoassay (elisa) after 24 h. results microglia were activated in the condition of prp peptide. a dosedependent increase in il6 secretion by the prp105132 exposed rat microglia was obtained. conclusions prp may induce microglia secret il6.
【key words】 prion; microglia; interleukin6
朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(tses)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病，主要病理特征为脑组织中存在淀粉样改变，其主要成分为异常prp沉积，周围可见大量的胶质细胞〔1〕。胶质细胞在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，并具有不同的免疫活性，构成中枢神经系统(cns)抵御病原体入侵的第一防线。细胞因子是固有免疫反应和适应性免疫反应的关键调节剂。在cns感染性疾病中，组织浸润性免疫细胞、cns相关的巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞已经被确定为cns特异性炎症中细胞因子的来源。然而，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的前炎症细胞因子和免疫调节性细胞因子的主要来源〔2〕。通过研究克雅氏病患者脑脊液，发现前炎症细胞因子白介素(il)6在脑脊液中含量升高〔3〕。本实验应用prp干预体外小胶质细胞，旨在进一步明确朊蛋白病中il6的可能来源。
1 材料与方法
1.1 朊蛋白肽段处理
prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)采用固相合成法合成，实验前将本条多肽取少量放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水稀释，并用稀乙酸将其调回中性ph值。
1.2 细胞培养
1.2.1 神经胶质细胞混合培养
取10只新生wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖dhanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖dhanks液洗脑组织块1～2次。剪刀剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的dmem/f12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。
1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代
第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用dhanks液3∶1稀释胰酶edta溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%edta，1∶1)，37℃下作用40 min。轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来。将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。
1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色
待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定40 min;0.01 mol/l磷酸缓冲液(ph7.3)清洗3次，每次5 min，4℃冰箱备用。sp法免疫细胞化学染色。
1.4 prp105132处理体外小胶质细胞
1.4.1 体外小胶质细胞分泌il6含量的测定
体外培养小胶质细胞24、48及72 h，收集细胞上清液，-20℃保存。il6含量检测采用abc夹心elisa法。
1.4.2 不同剂量prp105132对体外小胶质细胞分泌il6含量的影响
应用prp105132，分别为0、20、40、80 μmol/l剂量下干预小胶质细胞，采用abc夹心elisa法检测培养后24 h细胞上清液内il6含量。
1.5 统计学分析
计量数据采用x±s表示，用spss13.0统计软件分析。
2 结 果
2.1 培养小胶质细胞的活体观察
第一代小胶质细胞少，呈漂浮状，圆形，折光性强。传代培养5～10 d后，细胞贴壁，数量增多，并长成片，细胞出现较多短小弯曲的突起。加入prp105132肽段后小胶质细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状。
2.2 培养小胶质细胞纯度的鉴定
cd68单克隆抗体的免疫细胞化学染色显示，成片的细胞cd68免疫反应强阳性(即小胶质细胞)，细胞圆形，部分细胞有较短的突起。用苏木素复染的盖片，在镜下随机抽取5个视野，记数视野下的cd68阳性细胞和cd68阴性细胞(苏木素显示细胞核)，求出cd68阳性细胞的百分比。抽查5张盖片，其小胶质细胞阳性率均>95%。
2.3 il6的含量
体外培养小胶质细胞24、48、72 h上清液il6含量分别为(69.06±6.25)、(68.09±3.04)、(69.61±1.05) pg/ml，组间比较无显著性差异(p>0.05)。分别应用0、20、40、80 μmol/l剂量prp105132干预小胶质细胞，24 h后il6含量依次为(69.06±6.25)、(70.33±0.67)、(87.38±4.16)、(109.64±7.40) pg/ml，表明il6含量随prp105132剂量增大而增大，80 μmol/l组与其他三组组间比较有显著性差异(p<0.01)。
3 讨 论
prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)对应prpc的跨膜区域，是prpc向prpsc构型转变的关键部位〔4〕，是所有异常prp同工型的共有结构。在不同的环境(离子强度、ph值、溶质成分等)中表现不同的二级结构。prp105132在体外与整个prpsc有某些相同的性质，可形成淀粉样纤维，并具有蛋白酶k抵抗性。在实验中发现，体外培养小胶质细胞中加入该肽段后细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp剂量增加， il6分泌量增多，prp剂量80 μmol/l时il6的分泌量最高，进一步明确了prp105 132肽段对小胶质细胞的激活作用。
小胶质细胞激活是朊蛋白病的神经病理性损害特征，并且这种特征在体内和体外实验中均得到证实〔5〕。组织学研究发现朊蛋白病中，在cns小胶质细胞与异常朊蛋白的聚集有关,并发现体外朊蛋白诱导小胶质细胞介导炎症反应，导致神经元缺失〔6〕。小胶质细胞介导炎症反应需要各种细胞因子的合成和参与。目前已有研究证实prp可使小胶质细胞诱导表达cox2〔7〕，合成il1β、pge2〔8〕。本实验发现prp干预体外小胶质细胞后，培养上清液内il6含量升高，证实了朊蛋白病中小胶质细胞是细胞因子il6来源之一。
【参考文献】
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本实验采用1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)分光光度法[3,4]测定蜂胶、BHT、蜂胶抗氧化美容霜和市售抗氧化霜的抗氧化活性。进一步证实了蜂胶的抗氧化活性,为蜂胶添加入化妆品中的可行性和优越性奠定基础。
1材料与仪器
材料:蜂胶1,由湖北荆门蜂农提供;蜂胶2,由福建省神蜂科技开发有限公司提供;市售抗氧化霜;BHT(化学纯)由国药集团化学试剂有限公司;DPPH自由基,购于光纯药工业株式会社;其它试剂皆为国产AR级,试验用水皆为二次重蒸水。
仪器:WFJ 7200型分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;电子天平BS223S,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;自动双蒸纯水器、水浴锅、电热鼓风干燥箱等。
2实验方法
2.1 两种蜂胶清除DPPH・自由基能力的比较
蜂胶1、蜂胶2用无水乙醇配置成浓度为0.008g/mL的溶液(参照2009年蜂胶国家标准GB/T 24283-2009);
DPPH溶液:称取0.0128g加无水乙醇溶解于50mL容量瓶中,定容,摇匀 ,作为储备液 ( 6. 5×10- 4 mol/ L ) 保存于冰箱中,用时稀释10倍;
样品在40℃,75%RH下放置0~4周后,按表1加样并充分混匀,测定30min后其在517nm波长处的吸光值。取3次测试的平均值计算清除率。
空白A0为4.0mL DPPH溶液加0.2mL样品溶剂,样品Ai为4.0mL DPPH溶液加0.2mL样品溶液,测吸光值。
自由基清除率(%)=[(A空白-A末)/A空白]×100%
2.2 两种蜂胶与BHT清除DPPH・自由基能力的比较
BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)用无水乙醇配置成浓度为0.008g/mL的溶液;
蜂胶1、蜂胶2用无水乙醇配置成浓度为0.008g/mL、0.0008g/mL、0.0004g/mL的溶液。样品在40℃,75%RH下放置0~4周后,同上一步加样反应。
2.3 蜂胶抗氧化美容霜与市售抗氧化产品清除DPPH・自由基能力的比较
在40℃,75%RH下放置0~4周后,直接取蜂胶抗氧化美容霜(添加蜂胶1的终浓度为0.008g/mL)和市售抗氧化霜各0.2mL,按表1,分别加入体系中反应,并计算结果。
2.4 数据统计与分析
实验数据均采用spss软件进行统计与分析。
3结果与分析
3.1 蜂胶1与蜂胶2清除DPPH・自由基能力的比较
两种蜂胶对DPPH・自由基的清除作用见图1。结果表明两种蜂胶对DPPH・自由基皆有明显的清除作用,其中蜂胶1的自由基清除活性略大于蜂胶2。随着在40℃,75%RH下放置时间的延长,两种蜂胶的清除活性无明显改变,并都明显大于BHT。
图1两种蜂胶的清除率比较
3.2 不同浓度蜂胶与BHT清除DPPH・自由基能力的比较
如图2、图3所示,两种对DPPH・自由基有明显的清除作用,且清除率与蜂胶的浓度呈正相关。当稀释20倍后,蜂胶2的自由基清除活性才略低于BHT,而蜂胶1的自由基清除活性与BHT的自由基清除活性差异不明显。
图2蜂胶2与BHT的清除率比较
注:蜂胶2*10为蜂胶2溶液稀释10倍;蜂胶2*20为蜂胶2溶液稀释20倍。
图3蜂胶1与BHT的清除率比较
注:蜂胶1*10为蜂胶1溶液稀释10倍;蜂胶1*20为蜂胶1溶液稀释20倍。
3.3 蜂胶抗氧化美容霜与市售抗氧化霜清除DPPH・自由基能力的比较
从图4可以看出,蜂胶抗氧美容霜清除自由基活性强,达到63.71%;在40℃,75%RH下放置1周后,清除率降低到59.90%,而当储存2周后,清除率提升到82.59 %,并保持在该水平;市售抗氧化霜的自由基清除活性为4.84 %,当在40℃,75%RH下放置1周后,清除率为3.01 %,放置2周后就不具有自由基清除活性了。
图4自制蜂胶抗氧化美容霜与市售抗氧化霜的清除率比较
4讨论
两种化妆品的抗氧化活性在40℃,75%RH下放置2周后都有明显的变化,蜂胶抗氧化美容霜的清除率明显上升,并保持在较高水平,而市售抗氧化霜的清除自由基能力则完全消失,这可能与它们的乳化状态发生变化有关。市售抗氧化霜的抗氧化活性很低,可能是因为该产品价格低,抗氧化成分含量少,不代表整个化妆品界,但可以反映出某种社会现象,即化妆品市场的规范性和真实性有待进一步改善。
本实验中还存在一些问题:市售霜和蜂胶抗氧化美容霜在DPPH反应液中的溶解性不好,一定程度影响结果。但该问题两产品同时存在,也在一定程度上具有可比性。蜂胶还处于初步研究阶段,它成分复杂、药理活性多样,各地不同产区差异性大,其化学成分的组成和药理活性的特点常常有很大差别,因此需要更深入的研究。用DPPH法评价天然抗氧化剂的抗氧化活性,在操作时,一定要注意避光和通风,因为 DPPH溶液为剧毒、易挥发的液体[5]。
随着市场需求的日益加大,蜂胶的神奇妙效不断被发现和证实,我们相信,通过科学、严格的管理和规划,是能够生产出合格、标准、统一的优质蜂胶化妆品的。
参考文献:
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关键词：纳米氧化铝 制备方法 问题 前景
Preparation Methods of Nano-alumina and Its Characteristics
LI Yifan
（Shenhua Zhunneng resource Comprehensive development Co. Ltd.，Inner Mongolia Zhungeer010300）
Abstract：The characteristics of nano-alumina are briefly introduced，and the preparation methods of nano-alumina and its characteristics are reviewed. Points out that the problem of nano-alumina industrialization in our country，meanwhile look forward to the prospect of nano-alumina industry.
Key words： nano-alumina preparation methods problem，prospect
一、综述
氧化铝是一种白色粉末，已证实有a、b、g、d、e、x、r、l、h、q、κ和无定型氧化铝等十二种晶型[1]，并各自表现出不同的性质，它们在高温下长时间加热都会转化为稳定的a-Al2O3。氧化铝按用途分为两大类，一是用作生产电解铝的冶金氧化铝；二是种类繁多的非冶金用氧化铝，又称特种氧化铝。目前特种氧化铝已开发出了数百个品种，在材料、航天、化工、电子、生化医药等高科技领域广泛应用[2]。
纳米氧化铝是一种尺寸介于（1～100） nm的超细特种氧化铝颗粒，具有良好的体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，在光、电、热力学和化学等方面表现出一系列的优异性能，例如高硬度、高强度、耐热、耐腐蚀等，广泛用于精细陶瓷、生物医学、半导体材料、表面防护层材料、光学材料、催化剂及其载体等领域[3]。
二、制备方法及特点
纳米氧化铝的制备方法很多，根据原料在反应中的存在形式，可分为：固相法、气相法、液相法。
1.固相法
固相法是将金属铝或者铝盐直接研磨或加热分解后，再经过煅烧处理，发生固相反应，得到纳米氧化铝的一种方法。为了提高固相反应速率，可将固体原料研磨使反应物完全混合，或将原料加压成片，加大反应物间的接触面积。固相法的成本低，产量大，制备工艺相对简单，不存在颗粒间因羟基凝集脱水所导致的粉末团聚；但存在能耗大、效率低，产品粒径不够微细，粒径分布范围广，粒子易氧化变形，易混入其他杂质等缺点。
固相法分为机械粉碎法、化学热解法和非晶晶化法。
1.1机械粉碎法
机械粉碎法是用机械对物料进行粉碎和研磨制取氧化铝的方法。机械粉碎法要求简单、成本低、产率高，但是会产生表面和界面的污染，所得氧化铝粉体纯度低、粒径分布不均，而且制备的粉体容易发生团聚。
1.2化学热解法
化学热解法是通过对铵明矾或碳酸铝铵等无机铝盐进行热处理得到纳米氧化铝的一种方法。化学热解法主要包括铵明矾热解法、碳酸铝铵（AACH）热解法和喷雾热解法3种。
铵明矾热解法是用硫酸铝溶液与硫酸铵反应制得铵明矾，再加热分解成纳米氧化铝。煅烧过程收集的炉气可制成硫酸铵循环使用。该法工艺简单，生产成本低，产品质量稳定。缺点是反应过程中有SO2、SO3产生，污染环境，且生产周期长，难实现规模化。目前逐渐被AACH热解法代替。
铵明矾热解法发生的主要化学反应有：
Al2（SO4）3 + （NH4）2SO4 + 24H2O 2NH4Al（SO4）2・12H2O （1）
4NH4Al（SO4）2・12H2O 2Al2O3 + 2NH3 + N2 + 5SO3 + 3SO2 + 53H2O （2）
AACH热解法是将铵明矾与碳酸氢铵反应制得铵片钠铝石前驱沉淀，然后经1200 ℃灼烧，可制得粒径为15 nm左右的高纯氧化铝粉体[4]。此法不产生腐蚀性气体，无热分解时的溶解现象，产品粒径控制好，且能简化操作。但要求严格控制反应物配比，而且除杂较困难。张中太等[5]利用此法，通过控制适当的反应物配比和反应体系的pH值，最终制得粒径为（5～20） nm的活性氧化铝。其发生的主要反应有：
NH4Al（SO4）2 + 4NH4HCO3 NH4AlO（OH）HCO3 + 3CO2 + H2O
+ 2（NH4）2SO4 （3）
2NH4AlO（OH）HCO3 Al2O3 + 2NH3 + 2CO2 + 3H2O （4）
喷雾热解法（Spray Pyrolysis，简称SP法），也称溶液蒸发分解法，它是一种将金属盐溶液以雾状喷入低压高温气氛中，使其中的溶液蒸发，金属盐发生热分解，从而直接生成组分均匀、分散性良好的超细氧化铝粉体的方法。因其工序少，适于连续操作，易于控制组成及纯度，且可以改善粉体团聚现象，故日益受到关注。
1.3非晶晶化法
非晶晶化法是先制备非晶态的化合态铝，然后经过退火处理，使其由非晶态向晶态转变。由于非晶态在热力学上是不稳定的，在受热或辐射条件下会出现晶化现象，通过控制晶化条件，可制备符合要求纳米氧化铝晶粒。此法工艺比较简单、易控制，能够制备出化学成分准确的纳米材料，并且不需要经过成型处理。但该法生产的纳米氧化铝的塑性对晶粒的粒径十分敏感，只有粒径较小时，塑性较好，否则材料变得很脆。同时，非晶合金的尺度至今都不是很大，限制了非晶晶化后的纳米体材尺度。
2.气相法
气相法是直接利用气体或者等离子体、激光、电弧等方式将物质加热变成气体，使其在气态下发生物理或化学反应，冷却凝聚长大形成超细粉体的方法。此法又可分为物理气相沉积（PVD）法和化学气相沉积（CVD）法。PVD法是在真空容器中充入低压惰性气体，加热氧化铝使其蒸发，气化的分子与惰性气体原子相互碰撞而冷却，凝结成纳米粉末。CVD法是以铝的单质、卤化物、氢化物或有机化合物为原料，在气化状态下进行化学反应，经过成核、聚集和长大而形成纳米粉体的方法。
气相法的优点有：反应条件易控制，产物易精制；可通过控制反应气体来得到少团聚或不团聚的超细粉末；反应操作可以连续长时间进行；气相反应中不存在溶剂或副产物，避免了产物污染的情况；颗粒分散性好、粒径小、分布窄。其缺点在于该法对反应设备要求严格，设备操作比较复杂；温度变化、气体流速等控制步骤繁杂困难；成本高，产率低，不适合大量生产，粉末收集困难[6]。
3.液相法
液相法可分为：溶胶-凝胶法、沉淀法、水热法、微乳液法、相转移分离法等。其易通过改变反应条件（原料浓度、反应液pH值、温度、压力等），控制产物的形貌、粒径、化学成分。还可在反应阶段掺杂添加剂或表面改性剂等，制成多成分的均一微粉体，改善粉体性能[7]。该法制备的超细微粉表面活性好，工业化生产成本低。但此法容易引入杂质，产品纯度稍差。同时，反应物以溶液形式存在，得到产物易因羟基发生凝集，造成颗粒大小不均匀。
3.1溶胶-凝胶法
溶胶-凝胶法是目前在纳米氧化铝制备中研究和应用较多的一种方法，其步骤如下：将金属醇盐或无机盐（仲丁醇铝、丙酸铝、AlCl3、Si（OCH3）4等）溶液注入能使其水解的溶液（柠檬酸、碳酸铵、尿素等）中长时间陈化，生成稳定的流动性溶胶体系，再缩合成无流动性的凝胶，在抽真空的情况下对凝胶低温干燥、磨细可得氢氧化铝超细粉，再经煅烧即得氧化铝纳米粉。
该法反应温度低，产品晶型、粒度可控，且粉体颗粒细小、粒子均匀度高，纯度高。但是，凝胶的干燥过程容易产生团聚。所以，在制备工艺中，常常要加入分散剂，使凝胶的表面改性，以避免凝胶粒子团聚。使用的分散剂多为表面活性剂，这些表面活性剂具有不同的亲水/疏水平衡常数，它们的加入能有效地破坏晶桥网络结合，防止胶粒团聚，可以达到乳化溶液和分散胶粒的目的。
溶胶-凝胶法根据原料的不同分为醇盐溶胶-凝胶法和无机盐溶胶-凝胶法。前者醇盐价格昂贵，工艺过程不易控制，后者虽避免了昂贵的醇盐和有毒的有机溶剂，但会引入杂质离子，需要对凝胶进行洗涤。
溶胶-凝胶法和其它方法相结合也为纳米氧化铝的制备开辟了新途径。彭天佑等以Al（NO3）3和（NH4）2CO3采用溶胶-凝胶法结合异相共沸蒸馏技术对氧化铝凝胶脱水，有效防止了硬团聚，制成粒径为68 nm的单分散球形氧化铝粉体。并通过XRD、TG、TEM、DTA、BET等手段监测整个工艺过程，初步确定了制备超细氧化铝粉体的工艺条件[8]。
3.2沉淀法
沉淀法是在铝盐料液（氯化铝、草酸铝、硫酸铝胺、硝酸铝、偏铝酸钠等）中添加适当的沉淀剂（如氢氧化钠、氨水、碳酸铵、盐酸、柠檬酸等），将溶液中的铝离子以沉淀（如Al（OH）3、Al2O3・xH2O）的形式析出，然后过滤、洗涤、干燥、煅烧分解等得到所需的氧化铝粉体。
沉淀法又分为直接沉淀法、共沉淀法、以及均匀沉淀法。直接沉淀法是通过沉淀反应，直接从溶液中制备纳米粒子；共沉淀法是把沉淀剂加入混合后的金属盐溶液中，使各组分混合沉淀，然后加热分解得到超微粒子；均匀沉淀法是以易缓慢水解的物质为沉淀剂，通过控制水解速率，缓慢生成沉淀剂，就可避免浓度不均匀现象，使过饱和度控制在适当的范围内，从而控制沉淀粒子的生长速度，获得团聚少、产品粒度均匀、纯度高的超细粉。
沉淀法一般在常压低温下短时间内完成反应，设备简单、操作方便可调，工艺流程短，实验成本低。但反应受溶液组分、浓度、温度、时间、酸碱性等的影响较大，如水合离子的水解常数pKa和pKb数值小或为负数时，就会大量存在水解反应，固体就会以羟基的形式沉淀，影响产物质量。另外，产物是在低温下反应生成，一般为无定形结构[9]。但近年来，通过引入冷冻干燥、共沸干燥、超临界干燥等工艺，有效解决了硬团聚问题，能制得质量较高的纳米粒子。
3.3水热法
水热法是指通过控制高压釜的温度，创造一个高温高压的水溶液环境，加速离子反应，促进水解反应，在水溶液或蒸汽流中制备氧化物，再经分离和热处理得纳米粒子。水热法制得的粉体成分纯净，粒度分布窄，团聚程度低，但反应对设备的要求很高，成本较高。
3.4微乳液法
微乳液是在表面活性剂及助表面活性剂的作用下，将水相高度分散在油相中或反之，形成的“油包水”或“水包油”型热力学稳定体系。它避免了产物在合成过程中颗粒发生凝集，从根本上限制颗粒的增长。体系中生成的沉淀经洗涤、干燥、煅烧后制得纳米粉体。该方法设备简单，得到的粒子粒径小、分布均匀、稳定性高、重复性好，但由于所制得粒子过细，固液分离较难进行。制备过程使用大量有毒性的有机溶剂，成本较高，反应条件苛刻，整个过程必须严格控制，难以在工业上实施[10]。
3.5相转移分离法
往铝盐溶液中加入碱性溶液，当刚开始产生氢氧化铝沉淀时，通过加热、超声粉碎使之溶胶化；在水溶胶中加入阴离子表面活性剂，抑制核的生长和凝聚，再加入有机溶剂，使粒子转入到有机相中；加热减压除去溶剂，将残留物质干燥、煅烧得到纳米氧化铝微粒。
该方法的关键是利用表面活性剂将水溶液中的胶粒转移到油相中，然后弃水，达到较快速简易地将胶体粒子和水分离的目的。
三、存在问题与展望
纳米氧化铝作为一种新兴材料，它的制备主要停留在探索实验阶段。目前，大多数制备的纳米氧化铝质量不高，制备过程重复性差。有些方法存在工艺复杂、条件苛刻、成本高等问题。故关于纳米氧化铝制备的结构分析、反应机理、反应过程等问题还有大量的工作要做。可以预计，在国家政策的大力支持和众多科研工作者的努力下，我国纳米氧化铝产业必将有新的突破，为国民经济的发展注入新活力。
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关键词：胶原蛋白 化妆品 特性 应用
胶原蛋白实际上是多肽混合物，是胶原的水解物，胶原和水解物对于人类皮肤的胶原结构是相似的，具有较好的相溶性，能够渗入到人的皮肤深处，为皮肤提供营养。而且，胶原蛋白中还含有较多的氨基酸和天然保湿因子，能够使人体组织细胞的贮水能力得到明显提高，从而达到保湿作用。大多数的胶原蛋白多肽与人类皮肤细胞的分裂、生长、分化等有着紧密联系，能够提供皮肤所需的养分，降低皮肤的衰老速度。另外，胶原蛋白还能够防辐射，在各种美容产品和护肤产品中得到广泛应用。
一、胶原蛋白能够应用于化妆品的优势和特性
1.胶原蛋白具有营养性
胶原蛋白中含有皮肤所需要的氨基酸等营养成分，而且能够使这些营养成分深入皮肤深层，保证皮肤中胶原纤维结构稳定性和完整性，并且使皮肤的活性提高，有效改善皮肤细胞的生长环境，有利于组织的新陈代谢，从而实现美容养颜、营养滋补的效果。
2.胶原蛋白具有保湿性
胶原蛋白中具有多种天然保湿因子，对于防止人类皮肤的水分流失起着重要作用。胶原蛋白分子的外侧具有相当数量的羧基和羟基，能够促进胶原分子与水的融合，从而使皮肤的贮水能力明显提升，而且能够补充人体中的胶原蛋白，增强皮肤的亲和性。
3.胶原蛋白具有修复性
胶原蛋白有着与皮肤中的胶原结构相似的特点，因此，生物学特性优良，能够对上皮细胞进行有效修复，促进细胞增生。而且，皮肤能够顺利的吸收胶原蛋白，吸取皮肤所需要的氨基酸，从而有效改善皮肤老化和受损的情况。
4.胶原蛋白具有亲和性
由于胶原蛋白具有较强的生物相溶性，因此，能够与头皮表面的蛋白质分子和皮肤产生较强的亲和力，并且利用物理吸附的方式，实现与头发和皮肤的结合。胶原蛋白分子能够迅速在头发皮肤表面进行扩散，为皮肤提供所需的营养。而且，胶原蛋白的性质比较温和，不会对眼睛和皮肤产生刺激作用。
5.胶原蛋白具有抗皱功能
胶原蛋白在结构方面与皮肤角质层有着相似之处，因此，它能够顺利与皮肤实现相容。胶原蛋白的渗透性和亲和性较强，能够渗透到人体皮肤深层，为皮肤提供营养。而且，胶原蛋白还能够使皮肤表面形成一层薄膜，使皮肤的密度得到提升，有效改善皮肤松弛、老化等情况。
6.胶原蛋白具有美白功能
胶原蛋白中的酪氨基酸与人体皮肤中的酪氨酸是互相竞争的，然后与酪氨酸酶进行结合，能够酪氨酸酶的产生。而且，胶原蛋白能够将皮肤中的酪氨酸转化成多巴，从而抑制黑色素的产生，实现美白效果。
二、胶原蛋白在各类化妆品中的应用
1.胶原蛋白在护发素中的应用
基础头皮皮下组织的营养对于保持头发的健康有着重要作用，而胶原蛋白通常能够在真皮层位置发挥作用，是表皮层和表皮附属物的营养供应来源。而且，胶原蛋白对头发的湿润度和弹性有着重要影响，头发之所以出现干枯和分叉的情况，大多是由于胶原蛋白不足引起的。毛鳞片是一种相当脆弱的组织，一旦受热或者受到摩擦，就会出现磨损的状况，造成内层胶原蛋白的分解，因此，胶原蛋白的补充必不可少。目前，许多含有胶原蛋白的护发产品已经问世，并且得到了较为广泛的应用。
2.胶原蛋白在护肤产品中的应用
胶原和其水解物与皮肤中的胶原结构存在相似之处，具有较好的相溶性，能够为皮肤提供所需的养分。而且，胶原蛋白外侧的羧基和羟基，以及大量的天然保湿分子，能够使组织细胞的贮水能力明显提升，达到保湿作用。最重要的是，胶原蛋白能够为皮肤提供营养，使皮肤衰老的速度降低，具有较强的修复作用。而且，胶原蛋白溶液还能够抗辐射。正是由于胶原蛋白的这些优点，使其在各类护肤品中得到了广泛应用，如今我们所使用的眼霜、面膜以及各种护肤霜中大多都含有胶原蛋白。我国的许多化妆品企业也加大了胶原蛋白类化妆品的生产力度，推进了胶原蛋白在化妆品生产中的进一步应用。
3.胶原蛋白在美容产品中的应用
胶原蛋白对于肌肉的生长也有着较大作用，青少年处于成长发育阶段，使用胶原蛋白能够促进生长激素的分泌，为他们的健康成长提供营养。而成年人要想保持体形的完美，锻炼结实的肌肉，也要合理补充胶原蛋白。正是由于这方面的原因，胶原蛋白在美容产品中得到广泛应用。皮肤表皮相当致密，只有电解质、水和其他结构比较简单的小分子通过，但是，胶原蛋白的分子量较大，结构也比较复杂，皮肤不能直接吸收。因此，要探索研究相对分子质量较小并且分子结构比较简单的生物活性胶原肽，然后通过胶原肽将胶原蛋白融入皮肤。
结语：
胶原蛋白有着多种优势和特性，能够为皮肤提供营养，延缓皮肤衰老，因此，在化妆品中得到了越来越广泛的应用。随着研究技术的进一步提高，胶原蛋白产品必将更加广泛的出现在我们的生活中。如今，含有胶原蛋白的化妆产品不断增加，而且，还有一些产品正处于研究和探索阶段，在不久的将来也会问世。因此，含有胶原蛋白的化妆产品的发展前景是相当广阔的，相关企业要认识到胶原蛋白的重要作用，并且将其合理应用到化妆品当中，推进化妆品质量和效果的进一步提高。
参考文献：
[1]吴铭，徐珍珍，孙D，王刚，陈光. 胶原蛋白在化妆品中的应用及研究进展[J]. 日用化学品科学，2011（02）
[2]王昱琳. 胶原蛋白在化妆品中的应用研究进展[J]. 明胶科学与技术，2012（01）
一、教学案模式符合学生的认知规律
明确学习的内容，如：胶体 【山东科学技术出版社，P35页】
明确学习的目标，了解胶体是一种常见的分散系。【教育部考试中心命制的高等学校招生全国统一考试大纲（理科・课程标准实验・2011年版）】
知道胶体是一种重要的分散系，能列举出生活中的胶体，了解胶体与其他分散系的区别。能运用胶体的丁达尔现象、电泳、聚沉等特性解释简单的实验现象和实例。【化学1（必修）教师用书・ 山东科学技术出版社】
明确知识点，胶体的定义、胶体的实质、胶体的性质、胶体的应用。
明确针对性练习，针对性练习要紧扣学习内容，多角度加深对于概念或原理的理解。一是针对定义的练习，根据定义的练习要把握住定义当中的关键点，如胶体的微粒直径是1～100nm，胶体是一种分散系等；二是针对性质的练习，针对性质的练习要突出胶体的性质。即丁达尔效应、聚沉和电泳；针对不同的性质设计不同的题目。
二、问题设计要给学生提供合理的思维空间
例如，胶体的学习中，教材在联想・质疑中给出了这样的问题：清晨当太阳升起时，你漫步在茂密的森林里，会看到缕缕阳光穿过林木的枝叶铺洒在地面上。你知道为什么会产生这美丽的景象吗？
学生通过回忆及观察教材图2-1-6，看到森林里从右上至左下有一条光亮的通路穿过了整个的森林。绿树、阳光形成了森林里美丽的风景。美丽的风景往往会使我们流连忘返，产生无数的遐想，引起探究着深深的思考，此时提出产生这种美丽现象的原因问题。诱导学生探究现象产生的本质；学生通过阅读教材、查阅资料、合作交流等方式对现象进行本质式的分析，学生在教材或材料中会查到，溶液、悬浊液与乳浊液都是分散系，溶液的分散质微粒直径小于1nm，浊液的微粒直径大于100nm，而微粒直径处于1～100nm的分散系就是胶体；溶液具有均匀、稳定的宏观特征，浊液具有浑浊、不稳定的宏观特征，而胶体有什么样的性质呢？好奇心促使学生不断探究，在探究中学生会发现胶体有丁达尔效应、聚沉、电泳等性质。应用包括：还会查到胶体的用途，如农业生产：土壤的保肥作用；工业生产：制有色玻璃(固溶胶)，冶金工业利用电泳原理选矿，原油脱水等，医疗卫生：血液透析，血清纸上电泳，利用电泳分离各种氨基酸和蛋白质；日常生活：制豆腐原理(胶体的聚沉)和豆浆、牛奶、粥、果冻、墨水、明矾净水；自然地理：江河人海口处形成三角洲等；这样即激发了学生对于自然现象的探索欲望，又利于培养学生的发散性思维。
三、习题设计要激发学生的探索欲望
好奇心会使学生不断探索，成就感会使学生知难而进。习题的设计要遵循由易到难的原则，层层深入，扎实推进。习题的设计有知识性的，也要有与生产生活相结合的内容，增加知识的可读性，学习的趣味性。
关键词：病毒性心肌炎；心肌纤维化；作用机制
中图分类号：R725.4文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0137-03
病毒性心肌炎（Viral Myocarditis，VMC）是感染病毒引起心肌细胞的变性、坏死、间质炎症细胞浸润及纤维渗出为主的疾病。能够引起VMC的主要是柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus group B3，CVB3）感染，有50%以上的VMC和25%的扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）与之密切相关。
1 心肌纤维化的分类
心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF） 是指在心肌细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 中胶原纤维过量积聚、胶原含量显著升高或胶原成分发生改变。根据组织学特征可将MF分为2类：反应性纤维化，包括间质纤维化和血管周围纤维化，是对心肌负荷或炎症的反应；修复性纤维化是对心肌细胞坏死的反应，常发生于心肌间质，病毒性心肌炎各期心脏间质皆可见到胶原纤维增生。急性期有少量修复性纤维化，恢复期为修复性大量纤维化和反应性纤维化，慢性期大量单纯反应性纤维化。
2 心肌纤维化的发病机制
目前趋向性的观点认为，MF 的发生主要是心肌胶原合成与降解失衡的结果。胶原的过度合成见于肥厚型心肌病等，主要影响左室的舒张功能。胶原的过度降解见于扩张型心肌病等，常伴有基质金属蛋白酶（Matrix Metalloprot-einases，MMPs） 家系活性增加，主要影响左室的收缩功能。近年来在这方面进行了很多研究，取得了系列进展。
2.1 病毒直接损伤
CVB3重复感染可导致MF 和心室重构，使室壁僵硬而影响心脏的收缩和舒张功能，是心力衰竭发生的重要原因之一[1]。病毒性炎症及其它原因引起的心肌细胞损伤、炎性坏死，可激活相应的巨噬细胞，释放多种细胞因子和生长因子等，诱导心肌成纤维细胞表型发生转变，如心肌成纤维细胞合成组织内ECM 的能力增强，最终将导致MF [2]。
2.2 胶原酶
胶原酶是基质金属蛋白酶（MMPs，含锌离子的内肽酶）家族的一部分，MMPs 是一组由成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等合成分泌，参与细胞外基质降解的一类锌、钙离子依赖的内源性蛋白水解酶家族，是细胞外基质降解的生理调节因子。迄今为止，已发现23 种MMPs 成员，按MMPs 底物分类，为胶原酶（MMP-1、MMP-8 和MMP-13）、明胶酶（MMP-2 和MMP-9）、基质溶解素（MMP-3） 和膜型（MT-MMPs）[3] 。MMP-1 作用底物为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原及明胶；MMP-13 的主要作用底物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；MMP-2 的主要作用底物为明胶和层粘连蛋白，以及Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原和纤维连接蛋白、弹性蛋白；MMP-9 的主要作用底物为明胶和蛋白聚糖，以及Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原和纤维连接蛋白、弹性蛋白；MMP-3 的主要作用底物为蛋白聚糖、纤维连接蛋白、明胶以及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型胶原。MMPs 可以基础表达，也可以由多种因素诱导表达，其生物合成及活性调节发生在以下多个水平：基因转录调节，酶原的活化，MMPs 的特异性抑制物[4]。其中以MMP-1更为重要，以酶原方式分泌，降解成活性形式后可清除多种胶原；MMP-13，研究发现其对I、Ⅱ型胶原的降解作用较MMP-1、MMP-8均要强；而MMP-14是膜型基质金属蛋白酶（MTl―MMP），活化的MMP-14可以促使MMP-2和MMP-13前体转变为活性的MMP-2和MMP-13，同时可以直接降解ECM蛋白如I型胶原和纤维连接素（Fibroneetin，fn）。组织金属蛋白酶抑制因子（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP） 是近年来发现的抑制MMPs 活性的一组多功能因子家族，现已发现4 种，分别命名为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。MMP 与TIMP 以1∶1的比例形成MMP-TIMP 复合体，从而阻断MMP 与底物结合，抑制MMP 的活性，降低胶原的降解[3]。MMPs的异常参与了许多心血管疾病的发病过程，MMPs 的表达和活性过度增强或MMPs/ TIMPs 比例失调，可导致正常的心肌胶原蛋白过度降解，被缺乏连接结构的纤维取代，使心脏组织重构，引起心腔扩大、室壁变薄，导致脑功能恶化及心肌纤维化[3] 。在VMC 慢性期，由于细胞介导的自身免疫、心脏组织内病毒RNA 的持续存在和细胞凋亡促使心肌纤维生成持续增多，胶原降解系统中的MMP-1、MMP-3 等MMPs 的表达仍持续下调，而TIMP 的高表达从恢复期一直持续到慢性期，MMPs/TIMPs 比值持续升高，心脏结构蛋白的降解也随之减弱或停止，而TIMP-1 还可以促进成纤维细胞、平滑肌细胞的增殖，愈加使得心肌间的胶原含量增加，发生过度沉积，胶原含量持续增高，胶原合成活动占主导地位[5] 。
2.3 肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）
血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮（ALD） 对于MF 则起到了核心作用[6]。在心肌成纤维细胞，AngⅡ 通过血管紧张素Ⅱ1型受体（ AT1R） 激活细胞外信号调节激酶（ ERK），使成纤维细胞增殖；AngⅡ增加冠状动脉的通透性，刺激成纤维细胞合成和胶原分泌，通过抑制MMPs，减少胶原的降解；AngⅡ能诱导肾上腺髓质分泌儿茶酚胺，使成纤维细胞迅速分裂增生，导致左室肥大和MF；AngⅡ刺激ALD 的分泌，ALD通过与心肌成纤维细胞膜上高亲合力的Ⅰ型受体结合使Ⅲ型胶原堆积，促使MF 的形成。循环中AngⅡ和ALD 均可致MF，但前者既促进胶原纤维沉积又抑制胶原降解，后者也能刺激成纤维细胞合成胶原但对胶原酶活性没有影响。
2.4 心肌纤维化的调控性细胞因子
比较清楚的有AngII-BK系统、ET-NO系统、血小板衍生的生长因子（PDGF）和血栓素（TXA2）-PGI2系统等。现己证实，AngII、ET和PDGF为致MF的因子，而BK、NO和PGI2为抑制MF的因子。近年来的研究表明，转移生长因子β、结缔组织生长因子以及肿瘤坏死因子参与调控NF，尤其转移生长因子β在上述各系统与胶原代谢之间起到桥梁作用。
2.4.1 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-a，TNF-a）
通过调节MMPs而调节ECM重构，而ECM不良重构是MF的原因。TNF-a的过度表达可引起进行性心室肥厚和扩张，伴有MMP-2和MMP-9活性明显增高，胶原合成、沉积和变性增强而未变性的胶原则减少；而抗TNF-a治疗则使MMP-2和MMP-9的活性减弱，可防止后续的胶原合成、沉积和变性[7]。胶原合成增加时，尚可发现TGF-β1和TGF-β2蛋白水平增高。TNF-a可诱导胶原含量增加并影响上述酶活性，同时TNF-a也是细胞凋亡蛋白家族重要成员。
2.4.2 转移生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）
活化的TGF-β1 抑制ECM降解、增加ECM mRNA 表达和蛋白质合成。 RAAS激活、Ang Ⅱ增高引起MF 均由TGF-β1 增加所致，TGF-β1 增加成了诸多因素所致MF 的共同通路[6]。Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白合成增加，可被激活的TGF-β1 自分泌/旁分泌调节，参与MF。研究表明，TGF-β1 促进Ⅰ型胶原蛋白合成和mRNA 表达，阻断Smad3 表达，可消除TGF-β1 的上述作用。MMPs 参与MF 的发病也与TGF-β1 有关[7]。因此，抑制TGFβ的表达势必会减轻心肌纤维化病变。研究发现，应用抗TGFβ抗体可以明显减轻细胞外基质的合成，所以抗 TGFβ抗体是目前抗纤维化治疗中最提倡的方法之一。但由于TGFβ过度表达时有致纤维化作用，而在正常表达时能控制免疫反应和炎症，抑制细胞增殖，并有抑制肿瘤的作用。阻断TGFβ可能对机体产生多种难以预料影响，由于其正面效应的存在限制TGFβ抗体的使用，所以寻找纤维化过程中TGFβ的下游转导因子作为抗纤维化靶点，可能比直接阻断TGFβ的作用更理想。
TGFβ通过与其受体结合发挥生物学效应，目前研究比较清楚的是TGFβ-Smad通路和TGF-β活化激酶途径。TGFβ-Smads 通路[8]Smad 的命名源于首先发现的两种蛋白，即果蝇的Mad 蛋白以及线虫的Smad 蛋白。根据Smads分子结构和功能相似性分为3组：①R-Smads （受体Smads），包括Smad1、2、3、5、8。Smad 1、5、8 主要由骨形成蛋白激活，Smad2、3 则由TGFβ、激活素激活；②Co-Smad 就是Smad4，是和R-Smads结合的转导分子；③I-Smads （抑制Smads），包括Smad6、7，作为信号转导的负反馈调节，可牢固结合TGF RⅠ，抑制RSmads 被TGF RⅠ磷酸化。TGF RⅠ激活后，其丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶将磷酸化受体调节Smad-P3 蛋白，磷酸化的Smad-P3 蛋白，进而与Smad4蛋白形成复合物。活化的复合物转移到核内与其他同时合成的核转录因子（如激活蛋白1） 相互作用，激活含有Smad 结合元件的靶基因转录。TGF-β活化激酶途径[9]，该途径与TGFβ-Smads 途径存在着协同作用。在TGFβ刺激下，TGFβ活化激酶结合蛋白被活化，导致其与TGFβ活化激酶途径丝P苏氨酸蛋白激酶结构域结合。TGFβ活化激酶途径再激活p38MAPK激酶家族中的丝裂原活化蛋白激酶激酶（Mitogen-activated protein Kinase Kinase，MKK） 6/PMKK3/PMKK4，经由MKK6/PMKK3 或MKK4 激活p38MAPK，p38 MAPK直接使活化转录因子2 磷酸化，增强活化转录因子2 的转录活性，与TGFβ-Smads 通路协同刺激TGFβ诱导的转录。
2.4.3 一氧化氮（NO） 和内皮素（ ET）
NO是由内皮型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，eNOS） 合成和释放。在血管平滑肌内的NO，可激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cGMP 升高，后者可抑制肾素的释放，继而明显减少心肌局部AngⅠ的转化，降低AngⅡ，减少MF[10]。 ET由心肌细胞和成纤维细胞合成和分泌，既可促进心肌细胞、血管平滑肌细胞等合成和释放AngⅡ，又是ALD 合成和释放的强效调节剂；ET-1也是一种成纤维细胞的有丝分裂原，ET 受体拮抗剂可抑制成纤维细胞的增殖和MF；心衰时，在血管紧张素转化酶慢性抑制下能提高NO 的产生，此时缓激肽可部分通过抑制局部内皮系统而阻止MF[11]。
2.4.4 结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）
CTGF 是一种富含半胱氨酸的分泌肽，属于即刻早期基因、高度保守的CCN（cyr61，CGTF，nov）多肽家族，广泛存在于人类的组织器官中，与动脉粥样硬化、器官纤维化等疾病密切相关。它与TGF-β1 有许多相似的生物学功能，被认为是TGF-β的下游介质，其异常表达在MF 过程中起重要作用[12]。有研究[13]发现在“两肾一夹”的高血压大鼠模型中，在左心室心肌纤维化中可观察到CTGF的表达明显增加。在培养的人心脏的成纤维细胞中Ang Ⅱ通过激活Ang Ⅱ受体1，可诱导CTGF mRNA 的迅速表达[6]。因此，阻断CTGF 表达或减弱其活性，可能是一种更特异、更有效的预防心肌纤维化的手段。
2.5 细胞凋亡与心肌纤维化细胞
有人认为多种病毒可以触发细胞凋亡从而加快了MF进程，细胞凋亡是引起VMC向心肌病转变的重要机制[14]；有人用免疫组化方法和扫描电镜研究扩张型心肌病心肌标本时发现心肌细胞减少与炎症和细胞坏死无关，认为心肌细胞以及心肌间质细胞的凋亡可能是主要原因[15]；以超氧化物刺激心肌细胞可见与构成DNA有关的组蛋白增多和原位杂交缺口末端标记阳性，提示细胞凋亡；同时超氧化物可以刺激心脏成纤维细胞增生和TGFβ表达增多，通过这两方面作用超氧化物可致MF。
2.6 其它因素
研究发现[6]，非胶原性ECM成分如纤维连接蛋白（Fn）、玻粘连接蛋白（Vitronectin，Vn）、层粘连蛋白（Laminin，LM）、整合素（Integrin）以及透明质酸等，除了与胶原共同构成细胞外骨架外，尚直接或间接介导细胞内外的双向信号转导，在细胞的迁移、增殖和分化等方面发挥重要作用，在MF过程中，亦发挥重要作用；肥大细胞参与了MF 的发病过程，机制可能与其合成、分泌多种细胞因子、黏附分子（ 如TGF-β、bFGF 和TNF-α） 等相关[16]。在CVB3 诱导鼠纤维化模型中用雷帕霉素抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamyein，mTOR），可降低ECM的沉积，减少ECM 的产生，提示mTOR 也可通过影响基质的形成而参与胶原的调控，在MF 中也起一定的作用[17]。Ang Ⅱ和ALD 刺激心肌成纤维细胞增生和胶原合成均涉及细胞内Ca2 + 增加。新近研究提示[18]，ADAMTS-1（一种新的金属蛋白酶）也参与急慢性病毒性心肌炎心肌纤维化的形成。
3 结语
综上所述，心肌纤维化是一个复杂的病理过程，涉及病毒直接损伤、胶原酶系统、循环和心脏局部肾素―血管紧张素―醛固酮系统（RAAS）、致纤维化细胞因子、非胶原性ECM成分的变化、细胞凋亡，免疫系统，细胞信号调节等诸多因素，针对上述调控因素来研制新药和治疗措施以预防和治疗心肌纤维化，具有重要的现实意义。目前现代医学对其确切的发病机制尚未完全阐明，应该加大力度进一步深入研究。
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【关键词】 核糖体蛋白质s6激酶类；肝/细胞学；星形细胞；胶原ⅰ型；rna干扰
0引言
核糖体s6激酶（90kda ribosomal s6 kinase, p90rsk）隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase 1 and 2, erk1/2）信号转导通路的重要效应分子，具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性［1-2］，在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用［3］. 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, hsc）是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节［4］. 研究［5-6］表明p90rsk在肝纤维化中表达增加，并参与诱导hsc的凋亡. 然而p90rsk是否参与调节hsc内胶原的表达及其可能机制，目前国内外尚少见报道. 本实验采用rna干扰、报告基因等技术，研究hsc内p90rsk调节胶原表达及其分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路.
1材料和方法
1.1材料雄性sd大鼠250～300 g（南京军区南京总医院实验动物中心）；pmt2rsk1由美国哈佛大学医学院avruch教授惠赠. pavu6+27由美国密歇根大学生物化学实验室engelke教授惠赠. 携带大鼠ⅰ型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的pgl3col1a1由东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株hsct6由美国西奈山大学肝脏中心实验室friedman教授惠赠，其表型为活化的hsc. 小鼠抗大鼠rsk抗体（美国bd 公司）；兔抗大鼠ⅰ型胶原抗体（武汉博士德公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国promega公司）；ck40型电转化仪，icyclertm 光学荧光定量pcr仪，pac3000蛋白电泳仪，半干转膜仪（美国biorad公司）；ck40倒置显微镜（日本olympus公司）；聚偏二氧乙烯膜（pvdf）（美国schleicher & schuell公司）；lipofectaminetm2000试剂（美国invitrogen公司）；牛血清白蛋白（美国sigma公司）.
1.2方法
1.2.1hsc原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，以10 u/l肝素钠1 ml/kg将大鼠肝素化，暴露门静脉，插管，以37℃无钙灌流液预灌流，40~50 ml/min，持续约10 min；其后用酶灌流液继续灌流，40~50 ml/min，持续时间为10~15 min. 取出肝脏，剪碎、消化、过滤，滤液离心，1700 r/min，离心7 min，弃上清，用dhanks清洗，1700 r/min，离心7 min；弃上清，沉淀以1∶2体积的180 g/l的nycodenz混匀，行密度梯度离心，3400 r/min，离心17 min；取界面处细胞，用dmem清洗2次，1700 r/min，离心7 min；取沉淀细胞悬浮于含200 ml/l小牛血清的dmem中，用台盼蓝染色判断存活率；将细胞以1×105/cm2接种于培养皿，置37℃，50 ml/l co2培养箱培养，24 h细胞贴壁后换液；倒置显微镜下观察所分离的hsc形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜328 nm波长的紫外光激发下，观察hsc的自发荧光.
1.2.2rnai载体的构建及鉴定通过网站的sirna设计软件，设计针对大鼠p90rsk的特异性sirna：forward oligo：tcgacaaaagagatccctccgaagttcgcttcggagggat
ctctttttttt；reverse oligo：ctagaaaaaaaagtagatccctccgaagcgaacttcggagggatctcttt
tg ，由上海申友生物工程公司合成. 将合成的片段分别溶于双蒸水中，配制成100 pmol/l的溶液，将引物进行退火、磷酸化. pavu6+27空载质粒进行酶切线性化，并将酶切产物纯化后与合成的引物于16℃连接过夜后感受态细菌（dh5α）转化，构建p90rsk的特异性质粒pavrski，质粒抽提、酶切鉴定.
1.2.3hsc细胞转染应用lipofectaminetm2000试剂进行pavrski瞬时转染hsct6细胞株（表型为活化状态的hsc），以pavu6+27空载体作为对照. 转染当日，在1.5 ml离心管中以250 μl无血清、无抗生素的 dmem培养液稀释4 μg目的质粒，充分混匀. 同时，在另一1.5 ml离心管中以250 μl无血清、无抗生素的dmem培养液稀释10 μl脂质体，并于5 min内将其与dna稀释液混合. dna脂质体混合物在室温下放置30～45 min. 在此期间，以新鲜dmem培液（含有血清但无抗生素）洗涤细胞2次，然后加入1 ml相同培液. 将500 μl dna脂质体混合物加入6孔培养板中，前后摇动，使其充分混匀，放置于37℃，50 ml/l co2培养箱中培养. 在质粒转染12 h后加入等体积新鲜含血清培养基，转染24～48 h后收集细胞进行目的基因的实时定量pcr和western blot检测.
共转染：在进行报告基因检测中，采用原代分离培养的hsc细胞. 各组细胞分别转染p90rsk的表达质粒（pmt2rsk1，1 μg），rna干扰质粒（pavrski, 1 μg），pgl3basic（1 μg,基础对照），pgl3control（1 μg，阳性对照）外，均再加入pgl3col1a1（1 μg）和prlsv40（0.1 μg，为内参）共转染，24 h后，弃去转染液，加入正常细胞培养液，继续孵育至48 h，进行荧光素酶活性检测.
1.2.4实时定量pcr检测p90rsk和胶原mrna的表达提取转染组和对照组细胞总rna，逆转录合成cdna模板，进行目的基因的pcr扩增，产物10-1倍比稀释，制备标准曲线样品. 采用荧光定量rcp仪分别扩增目的基因和内参基因，测定标准曲线和熔解曲线，用ct值表示样品中模板的相对含量. 荧光定量rcp的反应体系与条件：25 μl反应体系，正、负引物（10 μmol/l）各0.5 μl，takara 2×pcr master mix 12.5 μl，模板1.0 μl，加水补足. 预变性94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 min，共40个循环. 产物熔解曲线测定条件为：95℃ 1 min，72℃ 1 min，每升高0.5℃保持30 s，至95℃. rtpcr使用的正向引物（f）和反向引物（r）包括：p90rsk（f）tctctgtccagcggcgggtgagga；p90rsk（r）gcattcacagcgcccatgcgcag；collagenⅰ（f）ccagccgcaaagagtctacatgtc；collagen ⅰ（r）itcaccttctcatccctcctaa；18 srna（f）gtctgtgatgcccttagatg；18srna（r）agcttatgacccgcacttac.
1.2.5western blot检测p90rsk和胶原蛋白的表达吸去细胞培养液，1×pbs（0.01 mol/l, ph7.4）洗涤后加入裂解液［（10 mmol/l tris(ph7.5~8.0), 25 mol/l nacl, 10 ml/l tritonx100, 10 g/l protease inhibitor）］冰上放置20 min后收集裂解液，4℃，13 000 g,离心30 min，收取上清，进行福林酚法蛋白定量. 取20 μg蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶（50 g/l沉积胶，100 g/l分离胶）电泳分离样品，转印至pvdf膜. 50 ml/l牛血清白蛋白，4℃封闭过夜后，一抗（1∶1000稀释）室温孵育3 h，pbst充分洗涤后加入二抗（1∶5000稀释）室温孵育2 h，pbst充分洗涤，鲁米诺和增强子（ecl plus）室温孵育2 min后kodak增感胶片曝光检测. 以βactin为内参照.
1.2.6荧光素酶报告基因活性检测转染48 h后，以pbs洗涤细胞2次，每孔细胞加入1×reporter lysis，离心收集上清，取20 ml上清按照检测试剂说明书操作，用化学发光检测仪检测荧光素酶的活性.
统计学处理：采用spss11.0统计软件进行方差分析，数据以x±s表示. p<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1p90rskrnai真核表达载体的构建空载质粒pavu6+27的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，在300 bp附近可见一条带，而干扰质粒pavrski的酶切产物经15 g/l琼脂糖凝胶电泳，在350 bp附近可见一条带（图1），并将酶切产物纯化后测序鉴定，说明含52 bp sirna的p90rskrnai真核表达载体构建完成.
2.2p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原mrna表达的影响实时定量pcr结果显示，转染pavrski后，hsc的p90rsk mrna的表达与对照组比较减少了（70.20±4.04）%，ⅰ型胶原mrna的表达与对照组比较减少了（61.80±3.96）%（p<0.01），两者表达变化方向一致.
2.3p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原蛋白表达的影响western blot检测结果显示，转染pavrski后，hsct6的p90rsk和ⅰ型胶原的蛋白表达较对照组减少了（89.10±5.26）%和（98.50±7.01）%（p<0.01），两者表达变化方向一致（图2）.
2.4p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原启动子活性的影响转染pgl3basic,pgl3control,pmt2rsk1,pmt2,pavrski,pavu6+27质粒的hsc荧光素酶的相对活性分别为（0.92±0.12），（5.63±0.69），（1.61±0.35），（0.31±0.08），（0.63±0.10），（0.42±0.09），各组与对照组之间的差异无统计学意义（p>0.05）.
3讨论
近年来，关于hsc中信号转导通路的研究表明，erk1/2信号转导通路与hsc的增殖及胶原合成密切相关［7］. p90rsk是erk1/2信号转导通路下游重要的效应分子，是蛋白磷酸化的主要执行者，在多种细胞中参与调节基因转录、蛋白翻译、细胞周期以及细胞生存等. buck等［8］ 的研究表明，p90rsk通过磷酸化作用抑制hsc凋亡盒形成，从而抑制细胞的凋亡，促进肝纤维化的发生. p90rsk在活化的hsc中表达增加，并与胶原表达之间存在明确的相关性［5］. 本实验通过rna干扰技术进一步研究p90rsk在hsc内调节ⅰ型胶原表达的功能. 结果表明，实验设计的rna干扰质粒特异性抑制了hsct6中p90rsk基因的表达，同时也相应地抑制了ⅰ型胶原的表达，两者的表达变化呈良好的正相关. 我们的研究证实，在hsc中p90rsk对ⅰ型胶原具有表达调控作用，针对p90rsk的rna干扰可有效的降低胶原的表达，可望成为肝纤维化的基因治疗手段. 在肝纤维化发生中，各种细胞因子等可以通过改变hsc的增殖活性或分泌活性这两种重要的方式来调节胶原的表达［9］. hsc最强效的促增殖因子（pdgf）和促胶原合成因子(tgfβ)均可以激活erk1/2通路参与肝纤维化过程. buck等［6］报道p90rsk通过活化c/ebpβ可以抑制hsc的凋亡，促进胶原的形成以及纤维化的发生，与我们前期有关erk1/2的研究结果一致［10］.
综上所述，本研究报告基因活性的分析研究结果表明，在hsc中p90rsk的表达变化对ⅰ型胶原启动子的活性并无明显影响，提示p90rsk在转录水平没有调控胶原基因表达功能，但其在胶原的转录后以及蛋白水平的调控作用仍有待进一步的研究证实.
致谢在此诚挚感谢第二军医大学长征医院消化内科谢渭芬教授和上海国家人类基因组南方研究中心张新教授的技术指导和大力帮助.
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［3］ anjum r, roux pp, ballif ba, et al. the tumor suppressor dap kinase is a target of rskmediated survival signaling［j］. curr biol, 2005, 15(4):1762-1767.
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［5］ 杨妙芳,张新,强晖，等. 核糖体s6激酶与大鼠肝纤维化相关性研究［j］. 中华消化杂志, 2005(2),25:98-100.
［6］ buck m, chojkier m. a ribosomal s6 kinasemediated signal to c/ebpbeta is critical for the development of liver fibrosis［j］. plos one, 2007,2(12):e1372.
［7］ 蒋明德,解方为,欧阳学农，等. erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞ⅰ型胶原分泌及tgfβ1 mrna的表达［j］. 第四军医大学学报, 2005,26(14):1167-1170.
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