时间：2023-05-30 10:06:43
关键词：木质纤维素；纤维素酶；纤维素酶解
DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185
1 引言
木质纤维素原料来源十分广泛，是储量丰富的可再生资源[1]。据统计，全球每年生产该类物质约200×109吨，其中有90%以上是木质纤维素类物质，而它们当中有8～20×109仍具有潜在的可利用性[2]。包括农业废弃物（秸秆、蔗渣等）如何处理，对环境压力以及可再生能源的利用具有现实意义。因此，在生物燃料、生物基化学品、分子材料、食品等领域这些廉价及丰富的木质纤维素，都具有广泛的应用空间。
纤维素的结构单位时D-葡萄糖，其分子式为：（C6H10O5）n，式中n为葡萄糖基数目，称为聚合度。经长期研究，已证实天然纤维素中D-葡萄糖基以吡喃环的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷键构成分子链，因为这对吡喃式D-葡萄糖具有最低的能态，这也是其二聚物（纤维二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上带有多个羟基，因此纤维素分子间容易形成氢键，进而使得链与链之间氢键紧密连接易于聚集成结晶性的原纤结构。如图1所见，大量氢键网状结构中存在着相对规则的结晶区，其阻碍了纤维素分子的进一步利用，故纤维素水解前需进行预处理，破坏它的氢键及结晶区，以便更好地水解纤维素，从而增加它的酶可及面积。
2 纤维素酶作用机理
纤维素酶是指能够水解纤维素β-1，4-糖苷键，进而生成葡萄糖的一类酶的总称，它是由几种酶共同协同作用，而不是单一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、内切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖酶）。长期的研究表明，结晶纤维素的彻底降解至少需要这3组纤维素酶的协同作用，如图2所示，Cx能容易地降解接近类型的纤维素或衍生物，Cx只有和C1组分结合时才可以利用晶形式的纤维素。C1酶首先作用于结晶纤维素表面，使其形成结晶构的纤维素键断开，长链分子末端游离，从而其转化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非结晶或纤维素、可溶性纤维素转化为纤维二糖，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖、三水解为葡萄糖。
3 单一纤维素组分作用机理
（1）内切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纤维素的β-1，4葡萄糖苷键，随机切割，产生大量纤维素的还原性末端。测定Cx酶活力方法较多，通用的方法是利用羧甲基纤维素钠（CMC）作为底物测其酶活，由于它是一种高聚合度的可溶性纤维素衍生物，还原性所占比例较少，纤维素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷键。
（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所产生的纤维素分子还原性末端，能够是纤维素长链释放出葡萄糖及小分子的寡糖。
有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2个独立的活性结构域：其一是指具有催化纤维素功能的结构域CD，其二是指具有结合纤维素功能的结合于CBD，二者由高度糖基化链相连接。查阅大量文献指出，C1对纤维素结晶区破坏作用极大，能够产生纤维二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纤维素结晶区表面，其次再由单根葡聚糖链（纤维素）快速准确地进入CD中带底物结合和催化部位的“隧道”，纤维二糖被准确地从葡聚糖链上切割下来并被释放出来的同时，C1分子沿着葡聚糖链向前滑动2个葡萄糖单位[3]。
（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖）。CB酶又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够作用于结合在末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相应的配基。在水相系统中，CB酶能水解纤维二糖及一些聚合度小于6的纤维糊精为葡萄糖，随着聚合度的增加，水解效果显著下降。
4 总结
木质纤维素广泛的来源，如农业废弃物、餐厨垃圾以及部分工业残余物等，可通过预处理和水解发酵转化为能源物质。在此基础上，需要在理论研究做出深入解释，以便更好的应用于实践。
参考文献：
[1]Sánchez J & Cardona CA. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology 2008（99）：5270-5295.
[2]Lin Y & Tanaka S.Ethanol fermentation from biomass resources：current state and prospects.Applied Microbiology & Biotechnology 2006（69）：627-642.
【关键词】 纤维素酶； 结构；进展
纤维素类物质是自然界中最廉价、最丰富的一类可再生资源。如果将天然纤维素降解为可利用的糖类物质，再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料等物质，对解决当今世界所面临的环境污染、资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义。而降解纤维素效果最好的是纤维素酶。它是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，将纤维素降解为寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。
1 纤维素酶的来源
纤维素酶的来源很广泛，真菌、细菌、放线菌等均有能产生纤维素酶的报道。目前国内外最主要的是利用真菌来发酵产纤维素酶。目前，绿色木霉和黑曲霉被公认是产纤维素酶最稳定和无毒安全的菌种，对研究纤维素酶的性质以及分离纯化等都比较方便。
2 纤维素酶的种类及降解机理
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：(1)外切型葡聚糖酶：(C1酶, ) ; (2)内切型葡聚糖(Cx酶）；( 3)β - 葡聚糖苷酶( 纤维二糖酶)。
C1酶主要作用于不溶性纤维表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，使纤维素易于水化，经C1酶作用后的纤维素分子结晶结构被破坏，Cx酶即吸附在纤维素分子上面，从键的内部任意位置切开β - 1, 4 - 糖苷键，将纤维素分子断裂为纤维二糖和纤维三糖等。最后这些被裂解产物由β - 葡聚糖苷酶分解为葡萄糖。
2.1 纤维素酶对纤维素分子的吸附作用 纤维素酶对纤维素的降解是从吸附于纤维素分子开始的，纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性有密切相关，而吸附过程是否可逆视具体酶的种类而定。此外，纤维素酶的吸附机制并未弄清，仍需做进一步研究 。
2.2 纤维素酶中单个组分的作用机制 纤维素酶的断键机理与溶菌酶一样,遵循双置换机制。两个色氨酸参与基质结合，而处在与将被裂解的键相邻的一个非离子化谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被非极性的侧链基团围绕，以促进质子转移。
2.3 纤维素酶的协同降解作用 纤维素酶三种酶组分的协同作用如上所述，即外切酶作用于不溶性纤维素表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，纤维素易于水化；内切酶则作用于经C1酶活化了的纤维素分子，分解其β -1，4- 键，产生纤维二糖和纤维三糖等短链低聚糖；β - 葡聚糖苷酶再将这些短链低聚糖分解成葡萄糖.。然而，该协同作用中的各种酶的作用顺序并不是固定不变的。
3 纤维素酶的结构
国内外大量的研究认为，纤维素酶分子普遍具有类似的结构,由球状的纤维素催化结构域(Catalyticdomains, CD)，纤维素结合结构域( Cellulose - Binding Dom sins, CBD)和连接桥(Linker)三部分组成。不同来源的纤维素酶尽管具有不同的分子量，但是其催化区域CD的大小却基本一致；纤维素酶的结合结构域CBD主要可维持酶分子的构象稳定性，调节酶对可溶性和非可溶性底物的结合专一性。连接桥Linker可保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。
在对CD的研究中，研究者们为了确定纤维素酶中哪个氨基酸是酶催化的必需氨基酸，用定点突变的技术，在已知的核苷酸序列中准确地诱变密码子中的一个或数个碱基，改变组成酶的一个或数个氨基酸残基，从而确定功能性氨基酸基团。目前国内外的研究主要对纤维素酶所属的第5，7，9等族纤维素酶。而对于其它族的研究，还有待进一步研究。
4 纤维素酶的制备
对纤维素酶的制备一般采用微生物发酵方法。发酵方法可分为固体发酵法和液体深层发酵法两种。而采用何种发酵法取决于具体情况，如随着现在实验室的快速发展，很多研究机构采用发酵柜来发酵产酶，使我们在有限的空间里用较少的成本便可以达到产酶的目的。
5 纤维素酶的应用
目前纤维素酶的应用还主要集中在微生物纤维素酶的应用上。现在已被广泛地应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中。
啤酒和葡萄酒的酿造工艺具有十分悠久的历史。在低质量大麦的发芽过程中加入纤维素酶可水解β-1，3-和β-1，4-葡聚糖，从而帮助大麦发芽，提高啤酒的过滤效率，并能增加葡萄酒的香味。
此外，纤维素酶也已被用在造纸、植物和真菌原生质体的制备以及农业生产中。
总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。
参考文献
关键词：羧甲基纤维素酶；滤纸酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25
中图分类号 S154 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-22-04
Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，FP activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.
Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25
纤维素物质是地球上含量最丰富的碳水化合物[1]，而目前人类对纤维素的开发与利用还非常有限，因此如何更有效地开发和利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。目前，对纤维素的降解利用主要是用酸碱处理等化学手段，以及汽爆及蒸汽加热等物理手段[2]。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，以及对环境污染较小等特点而备受重视。纤维素是一个复杂酶系，根据其功能的不同可分为3类：作用于纤维素非结晶区的内切葡聚糖酶（CMC）；作用于无定型区切割糖苷键的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纤维二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。协同作用才能将结构复杂的天然纤维降解。纤维素酶在食品、洗涤、纺织、饲料、造纸等方面具有广泛的应用和发展前景[5]。通过对本实验室保存的67株菌株进行初筛和复筛，A25这一株菌株是本次实验所筛选的，具有较高降解纤维素活力的菌株，本文对其纤维素酶的生产培养特性进行研究，对于了解其降解机制以及实际应用都有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 从农田土壤中分离得到67株土壤细菌。
1.2 实验方法
1.2.1 DNS法标准曲线的制备 称0.05g经105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸馏水中，用蒸馏水定溶至500mL配制成浓度为50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸馏水将体积配制至10mL。再分别从中取2mL，再加蒸馏水1.0mL再加DNS试剂2.0mL摇匀，置于沸水中煮沸5min，取出置与冷水中冷却到室温，测其OD530值。根据OD值，以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，列出直线回归方程（Y=aX+b）。
1.2.2 产纤维素酶菌株的培养 在无菌条件下，将67株菌株接种到纤维素培养基中，放在培养箱里温度为28℃，培养48h。
1.2.3 刚果红染色 把培养好的霉菌用刚果红染色剂覆盖培养皿一层进行染色30min。然后用0.9%生理盐水冲洗2～3次，观察其透明圈的大小，并计算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直径的值与菌落直径的比值）。根据比值的大小进行初步筛选。
1.2.4 粗纤维酶液的制备 在无菌操作下，将初步筛选的7株霉菌分别接种到液体发酵培养基中，摇瓶培养3～4d，温度为28℃，转速为160r。
1.2.5 纤维素酶发酵液的处理 纤维素酶霉菌摇瓶培养好后，用循环水式抽滤机进行抽滤。将滤液转入到原三角烧瓶中，放入冰箱备用。
1.2.6 酶活力的测定 采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸比色法）[6-7]。
1.2.7 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）酶活力测定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纤维素钠溶液为底物，用pH5.0柠檬酸缓冲液配制）。加1mL稀释酶液于50℃，恒温水浴反应30min，然后加入2mL DNS显色液，终止反应，煮沸5min，再放入冰水中冷却至室温。用722S分光光度计在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件作空白样调零。
1.2.8 滤纸（FP）酶活力测定 精确吸取4.0mL稀释酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，置于试管中，加入新华5号滤纸条（1×3cm）一条，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反应24h。吸取上述滤纸酶液2.0mL加入蒸馏水1.0mL，2.0mL DNS显色液，终止反应。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷却至室温。在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件下作空白调零。
1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法测定 取1.0mL稀释酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制的1%的水杨酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS显色液，终止反应，于沸水中水浴5min，用冷水冷却至室温，在530nm处测定其OD值，同时相同条件下作空白调零。
1.4 滤纸崩溃实验 取稀释酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液置于试管中。（15×50cm）加入新华5号滤纸条（1×3cm）一条，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒温箱内40℃保温24h。观察滤纸崩溃情况，观测标准如下：+++表示滤纸完全沉在底部，摇动试管后滤纸呈糊状；++表示滤纸完全下沉，摇后呈小片状；+表示滤纸沿底部呈毛状，摇后部分溶化；-表示滤纸直立完整无缺，摇后不溶化。
1.5 还原糖含量的测定 采用DNS法[9]测还原糖。
2 结果与分析
2.1 高产纤维素酶菌株的初筛 将67株菌株接种到羧甲基固体培养基中进行培养48h，用刚果红染色静止30min后测其H/C的比值，结果见表2。
从本实验室保存的67株菌株中，将各菌株分别采用纤维素固体培养基进行富集培养并进行筛选，从中筛选出高产纤维素酶菌株。从表2这些菌株的透明圈的直径与菌落的直径比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值较高，这7株产纤维素酶能力较强，红色水解透明圈较明显、较大，具有较高的纤维素酶活力。H/C是透明圈与菌落的比值，比值越大酶活越强。根据红色水解透明圈出现的快慢、大小可大致得出该菌株的产纤维素酶情况，这可作为初次判断的依据。通过表2的结果说明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有较高的酶活力。
2.2 葡萄糖标准曲线的绘制 参照1.2.1所描述的方法制备出标准葡萄糖曲线（图1），根据标准葡萄糖曲线求出直线回归方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖浓度，x：OD530的值），通过直线回归方程可以计算纤维素酶酶促反应中产生葡萄糖的浓度，从而根据酶活力单位定义算出酶活。
2.3 高产纤维素酶菌株的复筛 挑选上述试验中滤纸酶活性较高的7个菌株进行进一步试验，将所获得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液体发酵培养基中进行摇床发酵培养后，在获得发酵液的基础上制得粗酶液。测定其滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均设3个处理，取其平均值，如表3。
2.4 温度对酶促反应的影响 温度对酶促反影响的原因主要有以下2个方面，一是温度对酶蛋白稳定性的影响，即对酶热变性失活作用，二是温度对酶促反应本身的影响，其中可能包括影响酶和底物的结合，影响Vmax，影响酶和底物分子解离基团的pK，影响酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸馏水加入试管分别于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴锅中处理30min后，对菌体的酶活进行检测，其结果见图2。由图2可见，反应温度对菌株A25的酶活有显著影响，其最适酶活温度为50℃，当水浴处理温度高于50℃或低于50℃时，该菌株A25酶活减弱，但是培养液仍具有较高的纤维素酶活力；同时也表明该菌株所产的纤维素酶具有较高热稳定性。可见，50℃所测得的酶活力最高，即此酶的最适酶活温度为50℃。
3 讨论
3.1 高产纤维素酶菌株的初筛 纤维素在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈，根据水解圈的大小可粗略的估计菌株产酶的情况，然后选取透明圈较大的菌株进行接种。刚果红是对纤维素酶进行初步筛选的试验方法，实验方法比较简单。通过它可以使纤维素固体培养基上的菌种的代谢产物形成浅红色水解透明圈。用刚果红染液覆盖培养皿一层静止染色30min，纤维素酶菌株产纤维素酶越多，产生的红色水解透明圈越大，产纤维素酶速度越快，浅红色水解透明圈出现的越早。虽然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，不能定量说明该菌株产纤维素酶的能力。也有研究表明液体样品的酶浓度与透明圈的直径（下转127页）（上接24页）成线性关系，可以对酶活进行初步定量[10]。
3.2 高产纤维素酶菌株的复筛 已知纤维素酶的作用方式：CO酶是使天然纤维素晶体分链，起一个分离和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素；而C0酶虽不能水解天然纤维素，但能水解直链纤维素的β-l，4-葡萄糖苷键生成纤维二糖，纤维二糖再经β-葡萄糖苷酶水解成为葡萄糖。前人研究认为，纤维素的降解关键是滤纸酶活的高低，再结合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作参考。通过对7个菌株发酵液的滤纸酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活进行测定，初步筛选出产纤维素酶活力较高的A25菌株。初步试验表明，在50℃反应时间30min，pH5.5时A25菌株产生的纤维素酶的活性有较大提高。建议对A25进行进一步的优化试验，以探明其最适的产酶条件，或对其进行进一步的诱变，以提高其酶活性应用于生产实践。
3.3 温度对纤维素酶活性的影响 从粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸馏水加入试管中，在不同的水浴温度下水浴处理30min后，对菌体的产酶量进行检测。为了确定酶活的最适温度，通过测40～80℃不同温度下的实验确定酶活，不同培养温度对纤维素酶有不同的影响，结果表明，曲霉A25水浴处理在40℃时酶活力表现较低，50℃时酶活力达到最大值，水浴处理温度超出50℃时酶活力逐渐变小。对于纤维素酶活的最适温度为50℃，即纤维素酶产量的最适温度在50℃。
参考文献
[1]Michael EH，Mark FR，Charles E.Cellulase for commodity products from cellulosic biomass[J].Curr.Opin.Biotech.1999.10（4）：358-364.
[2]Beltrame，Carniti P，Visciglio A，et al.Fractionation and bioconversion of steam-exploded wheat straw[J].Bioresour.Technol.，1992，39：165-1871.
[3]任立伟.纤维质酒精发酵的菌种选育及发酵条件的研究[D].长春：吉林农业大学，2003.
[4]王巧兰，郭刚，林范学.纤维素酶研究的综述[J].湖北农业科学，2004，3：14-19.
[5]Bhat MK.Cellulases and related enzymes in biotechnology[J].Biotechnol.Adv.，2000，（18）：355-383. [6]赫特尔 马赫 B.酶的测定方法[M].钱嘉渊，译.北京：中国轻工业出版社，1992：102-119.
[7]格拉泽AN，二阶堂弘.微生物生物技术[M].陈守文，喻子牛，译.北京：科学出版社，2002：55-56.
[8]诸葛健，王正祥编著工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994.
[9]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].2版.杭州：浙江大学出版社，1999：73-75.
关键词：纤维素酶；壳聚糖；水热法；固定化
中图分类号：TQ016 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）19-0012-02
前言
纤维素酶是催化纤维素降解成葡萄糖的多酶复合体，化工原料、饲料、燃料、食物和药物等可由葡萄糖发酵得到[1]。游离酶受热易失活，难回收，工业上常将酶固定化利用。壳聚糖由几丁质去乙酰化得到，大量氨基、羟基等电负性基团能与酶结合。但壳聚糖是阳离子聚合物，溶于酸，易被多种非专一性酶降解。目前壳聚糖的改性方法大多通过加入多种化学试剂，不仅对酶有毒害，还使操作复杂化。
水热法模拟自然界的成矿环境[2]，在密闭的反应釜中，以水为溶剂，将常规条件下不易溶解的物质在高温高压条件下溶解并重新结晶，再经过分离得到产物，绿色环保，操作简单。水热法制备的生物质碳材料具有良好的的理化稳定性，相对表面积增大，有大量生物亲和基团，做酶的固定化载体利于酶的结合、底物的扩散[3]。
本文以水热法制备的壳聚糖碳材料为载体，分别通过共价结合法和戊二醛交联法固定纤维素酶，研究酶的米氏常数，最适温度，重复使用稳定性和热稳定性。
1 实验
1.1 材料与仪器
纤维素酶，东京仁成工业株式会社；壳聚糖，>95%；戊二醛，25%；纤维二糖，98%；pH=4.8的HAc/NaAc缓冲液；加热搅拌控制仪；恒温磁力拌器；水浴恒温振荡器；高速离心机；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵；Waters超高液相色谱；Bio-Rad傅里叶变换红外光谱仪FTS6000；ASAP 2020 /Tristar3000综合共价结合仪；Elementar元素分析仪Vario EL Cube
1.2 壳聚糖碳材料载体的制备及表征
10g壳聚糖、50mL蒸馏水、磁子放入反应釜后密封，于1000rpm、180℃的加热搅拌控制仪上反应10h，冷却，用无水乙醇和蒸馏水洗至澄清，抽滤，固体烘干备用。将原壳聚糖和该壳聚糖碳材料分别命名为1#CS，2#CS180，对其进行比表面积、红外光谱、元素分析。
1.3 固定纤维素酶
称0.4g2#CS180，加20mL2g/L的酶液，磁力搅拌2h，水洗抽滤，固体即得共价结合酶；称0.4g2#CS180，加20mL7%戊二醛，磁力搅拌3.5h，水洗抽滤，收集固体，加20mL2g/L的酶液，室温下磁力搅拌2h，水洗抽滤，得交联型固载酶。
1.4 酶学性质测定
1.4.1 米氏常数的测定
取5份1mL 2g/L酶液，5份固定酶各0.1g，分别与0.2-1.0g/L底物（纤维二糖HAc/NaAc缓冲液）反应2h，测葡萄糖产量。
1.4.2 反应温度对酶的影响
取6份1mL 2g/L酶液，加3mL 2g/L底物，取0.1g两种固定酶各6份，加3mL0.4g/L底物，30-80℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。
1.4.3 固定化酶的重复使用稳定性
固定酶各0.1g，加3mL0.4g/L底物，40℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。剩余固体水洗离心3次后，重复以上操作4次。
1.4.4 热稳定性
取5份1mL2g/L游离酶和固定酶0.1g，于70℃水浴保温，隔1h取出一份，加入各自底物，40℃水浴反应2h，测葡萄糖产量。
2 结果与讨论
2.1 壳聚糖材料的表征结果
2.1.1 红外光谱分析
如图1，1# CS和2# CS-180在1635cm-1N-H2特征峰处的峰强基本一致，表明180℃水热反应未对氨基造成损失。
2.1.2 元素分析与比表面积分析
见表1，壳聚糖水热反应后氢含量显著增加，利于结合酶。比表面积增大将暴露出更多的酶的亲和基团，利于酶的结合和底物的扩散。
2.2 酶学性质测定结果
2.2.1 米氏常数
如表2，本实验条件下，固定化纤维素酶的表观米氏常数均低于游离纤维素酶，其中交联酶的Km值最小，为游离酶的2.868%。
固定酶对底物的亲和力更好，是因为壳聚糖所带的正电荷一定程度上使底物更多更快地移向酶的活性中心，促进了底物与酶的有效接触。戊二醛在壳聚糖和酶蛋白之间发生Schiff反应，改变了酶的结构，减小了底物传递的空间位阻[4]。
2.2.2 温度对酶的影响
由图2知，游离酶和交联酶的最适催化温度是40℃，交联酶的酶活力在40℃后直线下降，而共价结合酶是50℃，且在40-60℃间活力都较高。
蛋白质靠疏水效应维持其结构和功能，非水溶性的壳聚糖通过疏水作用与酶的疏水基团聚集能稳定酶的结构。酶的活性可调节和底物专一性要求酶的活性中心具有一定的柔性，当酶固定化后，最适温度的升高能恢复其柔性。反应温度超过40℃后，交联酶迅速失活，说明戊二醛对壳聚糖和纤维素酶的疏水基团造成了破坏。
2.2.3 固定化酶的重复使用稳定性
如图3，交联酶活力低且下降快，共价结合酶的重复使用稳定性较好。这可能是回收利用过程中，频繁的升温降温使酶部分失活，并且多次高速离心使酶与载体的结合越来越松散。
2.2.4 热稳定性
如图4，游离酶保温1h就基本失活，交联酶1h后活力仅剩30%，随着保温时间延长而完全丧失活力，共价结合酶4h后仍有90%以上的活力。游离酶易热变性，当被强耐热性的载体固定化后，热能使活性中心恢复柔性以适应底物，从而减弱热对其结构和功能的破坏。戊二醛交联过程可能破坏了壳聚糖和纤维素酶的结构。
3 结论
壳聚糖碳材料具有良好的理化稳定性，相对表面积大，同时含大量生物亲和基团，适合作载体。用该壳聚糖碳材料固定的纤维素酶米氏常数都减小了，且共价结合酶的最适反应温度比游离酶和交联酶高10℃，热稳定性良好，适合多次使用。
参考文献：
[1]陈实公.固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D].合肥工业大学，2006.
[2]张文龙，马儒超，周志伟，等.壳聚糖水热交联炭材料研究[J].江西化工，2014（01）：232-236.
关键词：纤维素分解菌；发酵条件；纤维素酶；酶活力
中图分类号：TQ920．1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）06－1232-02
Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic
Enzymes Strain ZJW-6
TANG Rui
（Department of Biology and Chemistry， Xingtai University， Xingtai 054001， Hebei， China）
Abstract： The optimum fermentation conditions of high－yield cellulolytic enzymes strain ZJW－6 were studied in this paper． The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method． The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW－6 was as follows： peptone and （NH4）2SO4 as nitrogen source， shaking for 48h at 30℃ and pH 6．
Key words： cellulose－decomposing microorganisms； fermentation conditions； cellulose； enzyme activity
纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维素二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称。随着人们对纤维素酶研究的深入，纤维素酶在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥着越来越大的作用，因而引起了全世界的关注，其研究也取得了很大进展。但是纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低、生产周期长等问题，大大限制了其大规模工业化生产［1］。对高产纤维素酶菌株ZJW－6采用单因素试验法进行不同条件下的液体发酵培养，使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得最优发酵条件，旨在为其工业化发酵生产打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种 菌种为邢台学院生物化学系微生物实验室筛选并保存的产纤维素酶菌株。
1．1．2 培养基 液体培养基：羧甲基纤维素钠10.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，磷酸二氢钾1.0 g／L，硫酸铵0．2 g／L，氯化钠10.0 g／L，去离子水1 000 mL，pH 7.0［2］。
1．2 方法
1．2．1 待测酶液的制备 将各种不同培养条件下的单因素限制性的液体发酵菌悬液倒入离心管中，3 000 r／min离心15 min，取上清液作为待测粗酶液。
1．2．2 纤维素酶活力的测定 参照文献［3］和文献［4］使用DNS法测定酶活力。将在40 ℃、pH 4．6条件下，1 min分解羧甲基纤维素钠产生相当于1 μg同葡萄糖的还原糖量所需的酶量，规定为一个酶活力单位。
1．2．3 发酵条件优化研究［5，6］ 分别取ZJW－6的菌悬液1 mL加入到含有等量培养基的试管中，在不同时间、不同培养方式、不同培养温度、不同初始pH的条件下培养，测其酶活力。
2 结果与分析
2．1 不同培养时间对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养时间所产纤维素酶的活力见图1。从图1可以看出，在培养48 h以前酶活力显著提高，48~72 h酶活力显著下降，在培养72 h以后酶活力虽有上升，但增幅较小，可见培养48 h为其最适发酵培养时间。
2．2 不同培养方式对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养方式所产纤维素酶的活力测定结果见表1。从表1可以看出，静置培养4 d酶活力为118 U／mL，振荡培养4 d酶活力达138 U／mL，明显高于静置培养。可见振荡条件下培养对菌株ZJW－6产纤维素酶有利。
2．3 不同培养温度对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养温度所产纤维素酶的活力测定结果见图2。从图2可以看出，在26~28 ℃条件下培养，酶活力有所提高，当达到30 ℃时酶活力明显提高，到了32 ℃时酶活力又显著降低，可见菌株ZJW－6产酶的最适培养温度为30 ℃。
2．4 不同培养基初始pH对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6在不同培养基初始pH条件下所产纤维素酶的活力测定结果见图3。从图3可以看出，在培养基初始pH由5变为6时酶活力显著提高，在培养基初始pH大于6以后酶活力又逐渐下降，表明培养基初始pH 6是其最适产酶pH。
3 小结与讨论
综合试验中最适培养基和最优发酵条件的结果，得出菌株ZJW－6产纤维素酶的最优发酵条件为在蛋白胨+（NH4）2SO4的氮源培养基上，30 ℃、培养基初始pH 6、振荡培养48 h。
试验充分说明了产纤维素酶菌株在不同的培养条件下产纤维素酶的能力明显不同，对其最优发酵条件进行研究很有必要。国内外对于产纤维素酶菌株发酵条件优化的研究比较少，迟乃玉等［7］对纤维素酶高产菌株97－B最优发酵条件进行了研究，陈亮等［8］对低温纤维素酶菌株CNY086进行了选育及发酵培养基的优化研究，徐长安等［4］筛选得到一株海洋芽孢杆菌B09并对其进行了发酵条件优化研究。因为产纤维素酶菌株的产酶能力受多种因素的影响，因此不同的菌株，不同的培养条件，不同的培养基配方都还有很大的研究空间，需要进一步研究。
参考文献：
［1］ 武秀琴．纤维素酶及其应用［J］．微生物学杂志，2009，29（2）：89－92．
［2］ 崔 琰，陈红谩，尚宏丽，等．中性纤维素酶产生菌的筛选及其培养基的优化和酶学性质研究［J］．浙江农业科学，2006（2）：214－217．
［3］ 杨 洁，阿力木，李福成．饲用纤维素酶活力测定方法的改进［J］．新疆大学学报（自然科学版），2005，22（3）：322－324．
［4］ 徐长安，罗秀针，张怡评，等．一株海洋芽孢杆菌B09的筛选及其发酵条件优化研究［J］．海洋通报，2009，28（5）：74－78．
［5］ 黎海彬，李 琳，黄日波，等． 纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件［J］．华南理工大学学报（自然科学版），2003，31（3）：45－48．
［6］ 张洪斌，陈贤东，胡雪琴，等．一株里氏木霉产纤维素酶发酵条件的研究［J］．食品科学，2008，29（11）：375－378．
关键词：纤维素酶；菌种筛选；鉴定；酶活力
中图分类号： Q936 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001
纤维素是农作物秸秆的主要成分之一，也是地球上含量最为丰富的可降解生物质，其为葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷键聚合。它的降解与转化是生物圈碳素循环与生物能传递的重要环节。利用微生物对纤维素进行降解，对于自然界生物能源的利用具有重要意义。世界各国均积极开展对纤维素降解菌的研究[1]。东北地区作为我国的粮食主产区，每年产生大量富含纤维素的农业秸秆，传统的焚烧污染环境且造成大量生物质浪费。
本试验从吉林市左家林地土壤中分离出一株纤维素降解菌，由菌丝、菌落形态以及16S rDNA初步鉴定为散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有较强纤维素酶产酶活性，对于纤维素的降解转化具有积极意义，菌种具有进一步研究价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
1.1.1 试验材料
土壤样品，采自吉林省吉林市左家地区林地；化学试剂均为分析纯，购于北京化学试剂厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝胶回收试剂盒，购自BioFlux公司；
1.1.2 培养基
富集培养基：MgSO・7H2O 4 0.1g，FeSO4・7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。
刚果红筛选培养基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸馏水500ml，加热溶解后加入CMC-Na 20.0g、琼脂20.0g、刚果红0.2g充分溶解后，蒸馏水定容至1000ml，HCl调pH直至达到7.0～7.2，121℃灭菌30min，摇匀后倒平板。
纤维素钠筛选培养基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂12.0g，，水 1000ml，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。
产酶培养基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，FeSO4・7H2O 0.01g，MgSO4・7H2O 0.5g，MnSO4・H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl调pH值7.0～ 7.2，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。
PDA培养基：马铃薯200g，去皮切成小块，用蒸馏水1000ml小火沸煮30min，8层纱布过滤，滤液补水至1000ml，调pH6.5。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集与菌种分离
于左家地区林地，取腐殖质表层土壤5g土样于三角瓶中，加入50ml无菌水，震荡5min，至分散均匀。取5ml悬液于50ml富集培养基，28℃，80r/min震荡培养5～7d。取富集培养液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释，涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，分离有明显透明水解圈的菌落。若菌落重叠可划线分离菌株。
1.2.2 菌株纤维素降解能力测定
将分离获得的菌株，液体培养后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释后涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，待菌落直径1.0～5.0mm，取下培养基，于1%刚果红溶液浸泡1h，弃去刚果红溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，弃去NaCl溶液，观察并测量水解圈大小。
1.2.3 纤维素酶活力测定
采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶活力 [2]。酶活力定义为：1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1IU。
1.2.4 菌株表型特征鉴定
取无菌水一滴至于干净玻片，接种环挑取少许菌丝涂布，风干固定，显微观察菌株形态。
1.2.5 菌株的18S r DNA鉴定
CTAB法提取菌株基因组DNA，分析18S r DNA进行军中鉴定。PCR反应体系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d NTP4.0μL，FP2μL，RP2μL，Taq酶 1μL，模板DNA 2μL。引物序列：FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；RP 3' CCCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反应条件：94℃，5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环； 72℃，10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，送至英潍捷基公司测序。序列于GeneBank由BLAST进行序列同源性分析，确定菌种属。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离和纤维素降解能力初步鉴定结果
由刚果红筛选培养基水解圈初步判断，实验分离得到多种具有纤维素降解能力的菌株。其中3种疑似真菌类菌株，具有较为明显纤维素降解能力。
取这3种菌株，于刚果红筛选培养，用1%刚果红溶液浸泡后1mol/L NaCl溶液浸泡脱色，测量水解圈大小，结果见表1。由表1可知，1号菌水解圈直径/菌落直径为8.8，远高于2号菌和3号菌。初步表明，1号菌具有较明显纤维素降解能力。
2.2 菌株的纤维素酶活力测定结果
取1号菌、2号菌、3号菌，DNS法测定纤维素酶活力，结果见图1。由图1可知，在3种菌株中，1号菌纤维素酶活力最高，为2.32IU/mL。将1号菌命名为JN510。由纤维素酶活力判断，其具有进一步研究的价值。
2.3 JN510菌株表型特征鉴定结果
JN510菌株于PDA培养基28℃下培养，生长快速。3d后呈白色绒毛状气生菌丝；继续培养，菌落转为绿褐色；继而颜色逐渐加深。菌落毛绒状。镜检结果见图2。
2.4 18S rDNA序列分析结果
JN510菌株基因组 DNA进行PCR 扩增，产物进行琼脂糖电泳，结果见图3。由图可知，引物对18S r DNA 序列扩增效果良好，扩增片段约500bp。
回收片段，送英潍捷基公司测序。获得序列经GeneBank比对，该菌种与序列号为EU368286.1的Uncultured Eurotiomycetes具有99%的亲缘关系，结合文献所列形态学特征的描述，将其鉴定为散囊菌纲（Uncultured Eurotiomycetes）[3，4]。
3 讨论
吉林市左家地区林地腐殖质表层土壤中存在大量可以降解纤维素的纤维素酶产生菌。其可应用于生物化工过程，如秸秆发酵生产燃料乙醇等工艺。这些菌对于富含纤维素的的转化利用以及农业秸秆回收利用具有重要意义。
纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3者协同作用降解纤维素生成葡萄糖。不同菌种产生上述3种酶的浓度与活力不同。虽然自然界中纤维素降解菌种类较多，但是秸秆等生物质中的纤维素往往与木质素、脂质等交联存在。使得自然界中纤维素降解菌的降解能力不理想，降低了秸秆等富含纤维素生物质的开发利用。因此可以考虑构建不同纤维素降解菌，以及纤维素降解菌与木质素降解菌等降解菌的混合菌系。以此来转化纤维素，提高降解效率。
本实验获得的纤维素降解菌JN510具有较强纤维素降解能力，具有良好的开发前景，值得进一步研究。
参考文献
[1]顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.
[2] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J]. Pure Appl Chem， 1987， 59（2）： 257- 268.
[3] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1979：129-135.
关键词：蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz）；绿原酸；提取工艺
中图分类号：Q946．8；R284．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）18－4097-04
Optimixation of Cellulase Extraction Technology of Chlorogenic Acid from
Taraxacum mongolicum
LIN Chun－mei
（Ocean College， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005，Jiangsu，China）
Abstract：Chlorogenic acid in dandelion （Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz．） was extracted by cellulose． The effects of enzyme dosage， raw material to solvent ratio， treatment temperature， treatment time and pH on the yield of chlorogenic acid were optimized by orthogonal experiment based on single factor tests． The results showed that the optimal extraction conditions were pH 6．0； enzyme dosage， 3．0 mL； extraction temperature， 50 ℃； extraction time 1．0 h； the yield of chlorogenic acid under these conditions was 10．031 mg／g．
Key words：Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz； chlorogenic acid； extraction
蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand．－Mazz）别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等，原产于欧洲，在中国大部分地区均有分布，其味甘苦，性寒，既是营养保健野菜，也是常用的中药材，为药食同源植物之一，是开发绿色天然植物型营养保健品理想的宝贵资源。
蒲公英含碳水化合物、脂肪、蛋白质、多种矿物质、微量元素以及维生素等营养成分，此外还含有蒲公英甾醇、蒲公英苦素、皂苷、胆碱、肌醇、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等功能性化学成分，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌均有显著的抑制作用，即具有广谱抑菌作用，此外还具有利胆保肝、抗胃损伤、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等功能［1，2］。其中的绿原酸是一种多酚类物质，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗艾滋病毒、抗致畸、抗过敏、抗肿瘤细胞毒活性、对透明质酸酶和葡萄糖－6－磷酸酶有抑制作用等功能［3］。因此蒲公英及其绿原酸成为功能性食品研究开发的热点，中国国内外已开发出蒲公英饮料、蒲公英酒、咖啡、糕点、糖果以及蒲公英花粉和蒲公英根粉等保健食品。目前，绿原酸提取的原料主要是金银花、杜仲叶，另外有葵粕、稻壳、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等［4－15］，其中蒲公英来源丰富，部分学者用水提或醇提方法进行了蒲公英中绿原酸提取的研究［16］，而纤维素酶法具有条件温和、没有溶剂残留等优点。
研究采用纤维素酶法提取蒲公英中的绿原酸，用分光光度法测定提取液中绿原酸含量，计算绿原酸提取率，并对影响绿原酸提取率的因素进行了初步探讨，优化了绿原酸提取的工艺，为提高蒲公英的综合利用价值提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 原料与试剂 蒲公英为2011年5月27日采自山东省烟台市郊区的农田，将其于低温烘干粉碎过40目筛；35 kU／g纤维素酶购自北京梦怡美生物科技有限公司，使用前配成5 g/L纤维素酶；绿原酸标准品（纯度＞98％）购自北京中科三捷生物有限公司；无水甲醇、无水乙醇、盐酸均为分析纯。
1．1．2 仪器与设备 HW·YS型数显恒温水浴锅购自浙江舟山市定海区海源仪器厂，电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，T6新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，PHS－3C型精密酸度计购自上海精密科学仪器有限公司。
1．2 方法
1．2．1 纤维素酶法
1）工艺流程。选材称量加去离子水加酶液水浴加热灭酶用壳聚糖澄清抽滤取滤液定容用分光光度法测定，计算绿原酸提取率。
[关键词] 巴曲酶；低分子肝素；急性脑梗死；纤维蛋白原
[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）11（b）-0069-03
脑梗死是脑血管病中最常见者，约占75%，病死率平均为10%～15%，致残率极高，且极易复发，复发性中风的死亡率大幅度增加。近年来，临床上对急性脑梗死的治疗大多采用纤溶和抗凝方法[1]。本研究旨在观察巴曲酶联合低分子肝素对急性脑梗死患者血浆纤维蛋白原的影响，评价其临床疗效和安全性，从而更有效地治疗急性脑梗死。现报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年6月～2012年2月在本院神经内科住院的急性脑梗死患者80例为研究对象，其中，男45例，女35例，年龄41～76岁，平均（62.5±10.6）岁，所有患者发病时间在48 h以内，有明确的肢体瘫痪（肌力0～Ⅳ级），无明显意识障碍，血浆纤维蛋白原（FIB） > 1.5 g/L。均符合1995年第四届全国脑血管病会议修订各类脑血管病的诊断标准[2]，并经头颅CT、MRI检查核实具体病灶。排除年龄超过80岁，既往有脑梗死史，出血性脑血管病，凝血机制障碍有出血倾向、妊娠、过敏体质、严重心肝肾功能障碍、心房纤颤、2周内应用过纤溶药物，近期曾做过大手术或有严重外伤，血压 >180/100 mm Hg（1 mm Hg = 0.133 kPa），且经治疗持续不降、可疑为短暂性脑缺血发作者，可能或证实为大面积梗死者。将所有患者随机分成两组各40例，治疗组男22例，女18例，年龄41～75岁，平均（60.2±9.5）岁；对照组男25例，女15例，年龄46～76岁，平均（60.5±9.2）岁。两组病例年龄、性别、发病时间及FIB水平差异无统计学意义（P > 0.05）。
1.2 治疗方法
对照组给予口服阿司匹林，0.3 g/d，3 d后改0.1 g/d，丹参20 mL加0.9%氯化钠溶液250 mL静脉点滴，1次/d，共14 d；观察组巴曲酶10 U加入0.9%氯化钠注射液250 mL中缓慢静脉滴注，于第3、5天分别静脉滴注5 U，同时用低分子肝素钠2 500 U，2次/d腹部皮下注射，连续7 d。用药期间，如出现出血、血压下降等症状，则减慢给药速度或停药。
1.3 观察指标
用药前及用药后1周采用全自动凝血分析仪监测血浆纤维蛋白原（FIB）。用药期间密切观察有无颅内出血及皮肤、黏膜、消化系统、泌尿系统出血情况，用药前及用药后均进行头颅CT或MRI检查。
1.4 疗效判定
治疗2周后根据神经功能缺损积分值进行疗效评定，功能缺损评分减少91%～100%为基本痊愈；功能缺损评分减少46%～89%为显著进步；功能缺损评分减少18%～45%为进步；功能缺损评分减少或增加
1.5 统计学分析
所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床疗效比较
治疗后观察组总有效率显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。
2.2 两组血浆纤维蛋白原水平变化
对照组治疗前后血浆FIB水平无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；治疗后观察组血浆FIB水平明显降低，与对照组和治疗前比较均有显著变化（P < 0.05），见表2。
2.3 不良反应发生情况
观察组有1例出现皮肤黏膜出血，未特殊处理自愈，2周后查头颅CT无出血；对照组无明显不良反应。两组不良反应比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
急性脑梗死是指血栓形成或栓子阻塞脑动脉后导致局部脑组织因血液循环障碍，缺血、缺氧而发生的软化坏死，是一系列复杂的细胞代谢事件的最终结果。其好发于50～60岁以上的人群，常有动脉粥样硬化、高血压、风心病、冠心病或糖尿病，以及吸烟饮酒等不良嗜好的患者，约25%的患者病前有短暂性脑缺血发作病史。起病前多有前驱症状，表现为头痛头昏、眩晕、短暂性肢体麻木、无力。起病一般较缓慢，患者多在安静和睡眠中起病，多数患者症状经几小时甚至1～3 d脑梗死病情达到高峰。
急性脑梗死患者的血液系统呈高黏状态，其凝血与纤溶系统失衡，导致凝血功能增强，而纤溶功能相对降低，故极容易形成血栓及引起血栓的进一步扩大。大量研究表明，高纤维蛋白原是缺血性卒中的高危因素[3]，其水平升高能增高血浆黏度，与血栓形成密切相关，其在血小板黏附和聚集过程中起连接作用。所以对于急性脑梗死的治疗，溶栓是首选方法，一般认为恢复脑灌注的时间窗是6 h。但国外研究结果一致认为动脉溶栓或动脉接触性溶栓的最佳时间是梗死3 h内。因此在有效的治疗时间窗内能积极畅通阻塞血流和减轻再灌注损伤及阻断一系列缺血性连锁反应，是挽救患者生命、降低致残率的有效方法。
巴曲酶是由基因工程合成的单一成分的强力溶血栓及改善微循环治疗剂，可选择性作用于血浆纤维蛋白原Aa链末端和甘氨酸之间肽键，分解纤维蛋白为纤维蛋白单体，抑制血栓形成和发展，从而使血浆纤维蛋白原浓度降低，并诱发释放组织型纤溶酶原激活物（t-PA），增强t-PA作用的能力，以促进生成纤维蛋白酶增多，降低血液黏度，改善循环等，且不影响止血和凝血功能[4]。研究表明巴曲酶不仅可以降低体内纤维蛋白、血液黏度，具有抗凝和溶栓效应，而且可以保护脑缺血后的再灌注[5]，几乎不影响PT、APTT水平，降低了出血风险，提高了安全性。印卫兵等[5]研究发现巴曲酶的使用不用考虑治疗时间窗，其降低纤维蛋白原的同时不会引起明显不良反应，治疗急性脑梗死安全有效。
低分子肝素利用化学或酶学方法将标准肝素解聚而成，可有效抑制凝血因子的活性，有较强的抗因子Xa活性和较弱的抗凝血酶（FⅡa）活性的效应，在增强血管内皮细胞抗血栓作用的同时不干扰血管内皮细胞的其他功能，与普通肝素相比，其出血副作用减少，对溶栓后再梗死有预防作用[6-7]。使用低分子肝素时同样不受治疗时间窗限制，不影响凝血指标，安全性较高。
本研究选用巴曲酶联合低分子肝素钠治疗急性脑梗死，观察其临床疗效、血浆纤维蛋白原水平变化及用药期间不良反应发生情况。结果显示巴曲酶联合低分子肝素钠治疗急性脑梗死的总有效率显著高于对照组（P < 0.05）；治疗后血浆FIB水平明显降低，与对照组和治疗前比较均有显著变化（P < 0.05），治疗期间无明显出血等不良反应发生。巴曲酶联合低分子肝素治疗急性脑梗死疗效显著，且安全性好，值得临床推广。
[参考文献]
[1] Byrne JV. Interventioned neuroradiology： an emerging subspeciatity[J]. Clin Radiol，1997，52：898-899.
[2] 中华神经科学会，中华神经外科学会. 各类脑血管疾病诊断要点[J]. 中华神经科杂志，1996，29（6）：379.
[3] 廖维清，Frank wifg and wrnagl. 脑缺血损伤的病理生理机制—损伤级联反应[J]. 国外医学：脑血管病分册，1998，6（4）：197-199.
[4] 匡培根. 东菱克栓酶对沙土鼠缺血性脑血管病引起的脑水肿的影响[J]. 中国新药杂志，1995，4（1）：59.
[5] 印卫兵，丁新生. 不同剂量巴曲酶对脑缺血沙鼠的脑保护作用[J] . 临床神经病学杂志，2005，18（2）：1.
[6] 韩瑛，张颖瑛. 东菱克栓酶治疗不同病程脑梗塞患者的疗效观察[J]. 临床神经病学杂志，1998，11（5）：310.
酶是自然界动植物、部分有机体内产生的一类大型蛋白质，具有专一、高效和多样性的特点，可降解部分特定的高分子，作为生物催化剂加快反应速度。20年来，酶制剂在制浆造纸工业中的应用有了很大的发展，尤其在生物制浆中减少蒸煮化学品的用量、生物漂白过程中减少漂剂的用量、生物酶促打浆节能减排技术、酶法废纸脱墨性能的改善、纸浆的酶法改性、制浆造纸废液生物处理、利用生物酶改进纸浆的滤水性、纸浆中树脂控制、用生物手段控制腐浆等诸多方面。
1酶制剂在制浆造纸工业中的应用
1.1酶在生物制浆方面的应用
生物制浆主要包括化学法制浆和机械法制浆。生物化学法制浆是指通过生物方法对木片进行预处理，以减轻木片成浆的蒸解度，减少蒸煮化学药品的用量，降低碱回收强度、减少漂白化学药品用量，以及降低漂白废液的污染负荷等。当今，生物化学制浆的研究已发展到中试和工业化规模，而且预处理方法从菌的预处理转向采用酶进行预处理，这是因为菌不如其产生的酶稳定和对环境的适应性好。经过酶制剂处理的植物纤维原料，再经过化学法处理和蒸煮后，纤维的质量有一定的改善和提高。白延坤等〔3〕研究光叶褚白皮机械生物法制浆的结果表明，和对照浆相比，纤维素的脱除率略高，果胶脱除率略低、木素脱除率较高、戊聚糖得到保留更多，而且成浆周期明显缩短。陈嘉川等首先用聚木糖酶预处理麦草，在相同的工艺条件下对常规化学法制浆和酶法化学制浆进行比较实验得出:聚木糖酶的预处理明显提高麦草的脱木素程度，纸浆的卡伯值降低两个单位，蒸煮的用碱量减少，纸浆得率有所提高。与常规的化学法制麦草浆相比，酶制剂处理的化学麦草浆的物理强度和光学性能都有明显改善。因此，聚木糖酶预处理可以改善原料的制浆性能、减少能耗。
当今，生物法机械浆是国内外制浆造纸科研人员研究的重点和热点。生物法机械浆是在磨浆前用微生物菌如白腐菌对木片进行预处理，或者用酶制剂对木片进行预处理，以降低树脂的含量，节约磨浆能耗，减轻环境污染，改善纸浆的成纸强度。现己表明，对预处理后的木片进行磨浆可节省10%一30%的动力，而且纸浆的强度有所提高。在机械磨浆前用真菌或酶处理杨木片，与未经生物预处理的机械法制浆相比，电能节约20%一40%，耐破指数由o.92kPa•m飞上升到2.05kpa.m飞，撕裂指数由2.03IllN•耐g上升到4.53mN•耐g、抗张指数由29.5N•耐g上升为52.8N•而g〔6一7〕。经过生物酶预处理的火炬松木片机械浆和未经处理的相比，除了抗张指数略微降低外，其他成纸的物理指标与杨木相似。实验研究还表明，预处理的最适宜条件是木片处理时要有充足的菌或酶、处理时间和适合的处理条件。上述的生物制浆法虽然针对木材原料进行研究，但对其他造纸原料的生物法机械浆制备也同样有效。
1.2生物酶制剂在生物漂白技术方面的应用
生物漂白是利用微生物菌或酶制剂与纸浆中的某些成分作用，然后进行脱木素或使其有利于脱木素，从而改善纸浆可漂性，提高纸浆白度的过程。生物漂白可节省化学漂剂，改善纸浆性能，减少漂白污染。
目前，用于纸浆漂白的酶制剂主要有两大类:半纤维素酶和木素降解酶。半纤维素酶是指聚木糖酶和聚甘露糖酶;木素降解酶主要包括漆酶、过氧化物酶和锰过氧化物酶。20世纪80年代，制浆造纸工作者对聚木糖酶辅助漂白进行了广泛而深入的研究，并取得大量的研究成果:无论是阔叶木浆、针叶木浆、竹浆、草浆，还是硫酸盐浆、其他化学浆和化学机械浆，无论是与传统的有氯漂白，还是与先进的无氯漂白相结合，聚木糖酶的助漂作用都能促进浆中残余木素的降解，进一步提高木素的脱除程度、漂后纸浆的白度和稳定性，同时减少后续漂白段漂剂的用量，从而减轻纸浆漂白对环境的污染。
对于聚木糖酶漂白机理探索和研究，国内外制浆造纸工作者进行了大量的探索和实验，目前尚未得到明确的理论。但普遍认为的助漂理论有以下几点:第一，聚木糖酶破坏了聚木糖的连接键，使LCC键断裂，漂白化学试剂到达纸浆纤维的可及度提高，利于木素的脱除;第二，蒸煮后期蒸煮碱液浓度降低引起聚木糖的二次沉淀，这些聚木糖阻碍了漂白化学试剂对纸浆中残余木素的作用，而聚木糖酶能使这些聚木糖水解或部分水解，使漂白化学试剂更易脱去残余木素，纸浆的漂白得以实现;第三，聚木糖酶还会降解纸浆中的一少部分半纤维素，使纤维细胞壁变得疏松，木素更容易脱除;第四，聚木糖酶能去除蒸煮中产生的己烯糖醛酸聚木糖衍生物[8]，进一步改善纸浆的漂白性能。
用于生物漂白的聚木糖酶，要求有很强的耐碱耐高温性，可利用蛋白质工程和基因工程方法和手段获取耐碱耐热性能优良的聚木糖酶，这是目前制浆造纸酶制剂研究的热点，相信将来重组酶会更有效地应用于漂白工艺中去。漆酶能氧化非酚型的木素模型化合物〔9]，因而吸引了众多专家学者研究其对纸浆的助漂白作用。漆酶介体系统(laccase一mediator一system，LMS)在一定条件下对纸浆进行适当时间的处理，能使纸浆卡伯值大幅下降。锰过氧化物酶漂白需要在添加剂存在的情况下才能实现助漂性能，虽然其助漂效果良好，但因为酶添加剂的价格昂贵，较难实现商业化。表1是多种酶在纸浆漂白中的应用情况。
1.3酶制剂在酶促打浆和节能减排方面的应用
酶促打浆的概念是用高活性的纤维素酶以及半纤维素酶在打浆前对纸浆进行预处理，目的使纤维表面松弛和活化，进而促进纤维的吸水润胀，提高细纤维化和微细纤维化的程度。在后面的磨浆机械作用下，纤维被切断或分丝帚化，单根纤维的比表面积和多根纤维分子之间的键合力增强，抄成的纸张各项物理指标有所提高汇‘创，同时打浆能耗降低。
酶促打浆，是把酶制剂以溶液的形式添加到浆料中去，组成浆料和酶的非均相体系。在酶制剂处理初期，纤维表面的半纤维素部分被酶分解，纤维表面吸水润胀的程度明显提高，同时纤维表面的渗透性增强，因而酶分子更容易渗透并扩散到纤维的内部，微细纤维间的半纤维素被酶制剂降解，它们相互间的作用力减弱。然后，生物酶开始进攻纤维素的P层，51层的结构有所松弛，细小纤维间产生相对滑动，由于半纤维素酶制剂能破坏木素一碳水化合物复合体(LCC)之间的连接键，生物酶制剂进入次生壁的通道被打开，纤维素酶作用于纤维表面产生一定的剥离反应，把51层和P层去除，把S:层更好地出来但使其不受损伤，并加快了细纤维化，保持纸浆强度性能良好的情况下，改善打浆性能，节约打浆能耗。
表2是酶促磨浆的主要研究结果，从1968年Yerkes利用纤维素酶(来自白腐香栓菌)研究化学浆和棉短绒的磨浆能耗到现在的复合酶制剂用于降低磨浆能耗的研究，经历了40多年的时间，并取得了一系列的成绩。利用酶制剂对磨前纸浆进行处理，无论是针叶木还是阔叶木的化学浆或者机械浆，都可降低10%一40%的能耗。当今，具备更好反应和控制能力的制浆造纸专用酶制剂得以广泛应用，但对新酶种的识别和它们潜在的价值仍然制约着酶制剂在制浆造纸工业中的工业化和商业化。
1.4酶制剂在废纸脱墨中的应用
酶法脱墨是一种经济有效的脱墨方法，它能减轻或解决化学脱墨带来的一系列环境污染问题，降低漂白化学药品的用量、改善浆料的滤水性能等。当今，废纸脱墨的酶制剂主要有纤维素酶、聚木糖酶、漆酶、果胶酶、脂肪酶、酷酶、淀粉酶等。纤维素酶、半纤维素酶和素木降解酶主要是通过改变纤维表面或附近的连接键，从而使油墨与纤维分离，借助洗涤或浮选的方法将油墨去除;而脂肪酶、酉旨酶等则是利用酶制剂直接攻击油墨，以降解油墨中的油性连接料，碎解油墨，使其与纤维分离，从而实现废纸脱墨目的。
废纸浆中的植物纤维、油墨、淀粉和其他添加剂，大都能作为酶制剂作用的底物，是酶法脱墨的物质基础。目前，酶法脱墨主要有两种不同的方法，一种是与废纸浆中的纤维素和半纤维素反应的酶，另一种是和油墨反应的酶。对于酶制剂与纤维素和半纤维素的作用机理目前主要有四种推测:第一，对纤维素微纤维的剥皮作用;第二，对可及的纤维素链的水解;第三，对纤维素微纤维或微细组分的脱除;第四，对半纤维素的分解作用使碳水化合物一木素复合体释放出木素。与油墨反应的酶主要是酷酶和脂肪酶，它们可以破坏油基印刷油墨的连接料或者载体。目前情况是酶制剂可以加到脱墨的初始阶段，部分或者全部取代传统脱墨方法的脱墨剂，利用浮选洗涤法脱除油墨粒子。但研究还表明，采用酶法脱墨的油墨粒子要比其他脱墨方法的油墨粒子小很多，这些油墨小粒子能扩散进入纤维中，降低洗涤效果。但总体来看，酶法脱墨能减少墨点数，纸浆的白度基本持平，效果与传统方法相当，但很大程度上减少了废水中的污染负荷。目前废纸的纤维素酶和半纤维素酶法脱墨己部分实现工业化，探索其他能用于废纸脱墨的酶对于酶法脱墨的发展具有重要的意义。
酶法脱墨的研究最初主要集中在旧报纸的脱墨，研究结果表明:酶制剂可以部分甚至全部代替化学品，减少污染，同时旧纸的疏解时间缩短，能耗降低;所得脱墨浆白度较高，并且滤水性能好，易于漂白。顾其萍等L20]研究了脂肪酶用于旧报纸脱墨，发现脂肪酶脱墨浆效果良好，并且脂肪酶脱墨浆的返黄值低于化学脱墨浆。还有人研究了漆酶介体体系对旧报纸的脱墨效果和对后续漂白的影响，发现脱墨浆的白度稍微下降，但后续的可漂性明显提高，研究还发现，漆酶与聚木糖酶一起使用会产生协同作用，对旧报纸脱墨后漂白浆的质量改善明显。这可能是因为聚木糖酶提高了漆酶介体体系对纸浆纤维的可及性〔2，〕。近些年，酶法脱墨研究重点已转向静电复印纸和激光打印纸的办公废纸脱墨上，并取得了良好进展:实验表明，加入少量商品纤维素酶和表面活性剂，能很大程度上提高办公废纸油墨的脱除率t221。
1.5酶制剂在纤维改性中的作用
利用酶制剂对纸浆纤维进行改性，在保证纸浆纤维强度的前提下，提高纸浆滤水性，降低打浆能耗。纤维改性的方法，包括化学法改性、机械法改性和物理法改性三种。根据酶对纤维的改性作用，可分为三类:一是改善纸浆滤水性能、抄纸性能和提高高得率纸浆成纸性能的纤维素酶为主的酶制剂体系，二是降低打浆能耗、改善滤水性能和高得率浆成纸性能的半纤维素酶为主的酶制剂体系，三是以改善高得率纸浆物理性能的木素降解酶为主的酶系[23一24]。
纤维素酶处理纸浆能改善纸浆的滤水性，可能是因为纸浆中纤维连接较紧密，纤维素酶很难把纤维素分子降解。它能改善纸浆的滤水性能，是因为酶处理能提高纸浆游离度。在酶制剂的作用下，纤维的性能会产生一定的变化，主要是由于纤维素酶对纤维表面进行作用，主要表现在剥皮、腐蚀、微细纤维化和纤维切断等几个方面，最终影响纸浆的成纸性能。王兆荣等〔25j研究了纤维素酶对漂白针叶木浆的改性，发现适量的纤维素酶用量，能降低打浆能耗，提高纸张的抗张指数，但撕裂指数略微下降。Mansfield等仁26]的研究表明，复合纤维素酶处理纸浆能提高改性后纸浆的游离度，降低打浆能耗，提高纸张的印刷性能，改善成纸的平滑度，而且成纸的抗张强度也有所增加。
纸浆的纤维改性技术有着良好的发展和应用前景，但对改性剂和纤维作用规律的研究需要深入和提高。研究纸浆纤维改性的机理，有针对性的利用不同的改性剂和改性手段，探索其适宜的环境条件和作用方式及理论，并用于实际生产，两方面的结合研究将互相促进，从而加快纸浆纤维改性的研究速度。酶制剂技术的发展，也必将在新的酶改性技术应用中发挥重要作用。
1.6酶在处理造纸废水中的应用
废水的厌氧处理，是水解产酸菌利用自身产生的胞外酶将有机物水解成小分子并酸化，将其继续乙酸化，最终将有机物污染物分解产生甲烷和二氧化碳气体。厌氧生物处理由于产生的污泥产量低、动力消耗少等优点在生产中得到应用。
活性污泥法是好氧生物处理废水的典型方法，好氧活性污泥的细菌如动胶菌和革兰氏阴性菌作用是能迅速稳定制浆造纸废水中的有机污染物，使其具备良好的自我凝聚能力和沉降性能。好氧细菌在有氧的环境条件下降解有机物，然后在沉淀池中沉淀成污泥，上面的清液被排出或重新利用，从而实现对废水的生物法处理。
固定化微生物技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一项新的生物技术。即将微生物固定在载体上，并保持其生物功能。漆酶的固定化及其在造纸废水处理中的应用中表明〔28]，用固定化漆酶法处理纸厂废水，能有效去除甲基酚，同时漆酶还能够脱除甲基和溶解纸浆中的部分木素。漆酶经固定化后，能进一步提高漆酶处理废水脱色的有效性，每一单位酶活所降低的废水色度值明显提高。
2酶制剂未来发展方向
随着真菌和细菌的培养优化技术的发展，制浆造纸酶制剂技术也在不断地更新，其应用领域不断扩大，需求量也不断增加。制浆造纸整个过程中的各个阶段所需要的酶种有所不同，取自哪种真菌或细菌，其存在的基物是哪些，如何将其分离、鉴定和纯化，以及它们的生长环境和条件、应用时的环境条件，都是未来的研究和发展方向。
关键词：黑果腺肋花楸；蜗牛酶；纤维素酶；半纤维素酶；花色苷
基金项目：部级大学生科技创新项目（项目号：201611439001）
中图分类号： S663.1 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2017.10.024
黑果腺肋花楸（Aronia prunifolia Viking）蔷薇科、腺肋花楸属、多年生落叶灌木，原产于北美东北部。目前在食品、饮料、药品和保健品等领域得到广泛应用。成熟果实富含儿茶素、绿原酸、花色苷、黄酮、白藜芦醇等多种活性物质 [1-2]。黑果腺肋花楸中含有四种花色苷单体，即矢车菊素-3-半乳糖苷（68.68%），矢车菊素-3-阿拉伯糖苷（25.62%），矢车菊素-3-木糖苷（0.42%）和矢车菊素-3-葡萄糖苷（5.28%）[3]。据研究报道，黑果腺肋花楸是植物届花色苷含量最高的植物，是葡萄的 180 倍，香蕉的2000倍[4-5]。研究表明，花色苷含量占总酚类化合物的 25%左右，这些高含量的酚类物质使黑果腺肋花楸的果实颜色显现紫黑色等[6]。花色苷主要存在于浆果类果实的植物细胞内的液泡内或吸附在细胞壁上，由于植物细胞壁而坚硬，使细胞壁具有很大的机械强度，在酿酒过程中30%～40%的花色苷在酿酒发酵过程中未被浸出而损失，因此如何提高花色苷的浸出率就成为酿酒工艺的研究热点。
研究发现蜗牛酶具有溶解细胞壁的作用[7-8]；纤维素酶具有崩溃植物果实细胞壁，提高红葡萄汁浸提率和稳定色泽[9-11]；植物细胞壁降解的成功与否，取决于植物中纤维素骨架的彻底降解，半纤维素酶起到非常关键的作用，因为植物细胞壁降解首先是要除去半纤维素，从而使纤维素暴露在纤维素酶中被降解为葡萄糖[12-13]。目前利用浸渍酶等提高酚类物质浸出率的应用在葡萄酒酿造中已经应用[14]。而利用蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶在黑果腺肋花楸酿酒过程对单体花色苷的浸出率是否有作用未见报道。本试验以黑果腺肋花楸果实为原料，在其酿酒过程中，加入蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶，采用HPLC法研究酿酒发酵前后不同种类花色苷的含量变化，为提高黑果腺肋花楸酒相关品质提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
黑果腺肋花楸果实于2016年9月购自吉林市大绥河黑果腺肋花楸种植基地。花色苷标准品矢车菊素-3-半乳糖苷（CAS 27661-36-5）、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷（CAS 57186-
11-5）和矢车菊素-3-葡萄糖苷（CAS 7084-24-4）购自Sigma公司。
1.2 试验方法
1.2.1酿酒 黑果腺肋花楸果实精选破碎发酵皮渣分离（第7天）检测。每个实验用黑果腺肋花楸果实5公斤，破碎后加酶。将酵母50.00克溶于300毫升的烧杯中放入30℃水浴锅加热活化20分钟，酶按1%添加，取半纤维素酶50.00克、纤维素酶50.00克、蜗牛酶50.00克，分别放入100毫升容量瓶中定容（用35℃水），再放入35℃水浴锅中活化4小时，活化后添加到发酵罐中。
1.2.2 花色苷的检测 黑果腺肋花楸酒中花色苷的检测参照赵权的方法[15]。色谱柱采用反相ODS-C18柱（250mm×4.6mm），流动相：4%磷酸（PH=2）∶乙腈（HPLC）=85∶15；流速：1毫升/分钟；柱温：30℃；检测波长：520 nm；进样量2。矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷三种花色苷标准品混标如下。矢车菊素-3-半乳糖苷出峰时间5.102，标准方程为Y=17332.62X + 114270.8（R2=0.9999346）；矢车菊素-3-葡萄糖苷出峰时间5.637分钟，标准方程为Y = 14169.4X + 68199.53（R2=0.9999619）；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷出峰时间6.601min，标准方程为Y=29482.8X+85457.36 （R2=0.9998405）。
2 结果与分析
2.1 样品色谱分析
图1为标准品及样品高效液相色谱图，各种花色苷分开比较清楚，样品出峰时间与标准品相近，表明该条件适合黑果腺肋花楸酒中花色苷的检测。
2.2蜗牛酶对花色苷浸出率的影响
由图2得知，蜗牛酶对黑果腺肋花楸果实酿酒过程各种单体花色苷浸渍到酒中作用显著。通过酶处理，矢车菊素-3-半乳糖苷含量为481.9毫克/升，比对照提高了14.21%；矢车菊素-3-葡萄糖苷含量为40.39毫克/升，比对照提高了28.84%；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷含量为133.19毫克/升，比对照提高了20.92%。由于矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷占总花色苷的99.58%，因此将上述三种花色苷的和视为总花色苷。总花色苷含量为655.48毫克/升，比对照提高了16.47%。
2.3纤维素酶对花色苷浸出率的影响
由图3得知，通过纤维素酶处理，矢车菊素-3-半乳糖苷含量为466.14毫克/升，比对照提高了11.31%，作用显著；矢车菊素-3-葡萄糖苷含量为31.44毫克/升，比对照提高了8.66%；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷含量为85.04毫克/升，而对照为105.36毫克/升，小于对照；总花色苷含量为582.62毫克/升，比对照提高了6.02%。
2.4半纤维素酶对花色苷浸出率的影响
由图4得知，通过纤维素酶处理，矢车菊素-3-半乳糖苷含量为520.48毫克/升，比对照提高了20.57%，作用显著；矢车菊素-3-葡萄糖苷含量为40.69毫克/升，比对照提高了29.35%；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷含量为157.71毫克/升，比对照提高了33.21%；总花色苷含量为718.87毫克/升，比对照提高了23.86%。
2.5三种酶对花色苷浸出率的比较分析
将不同酶处理得出的矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、总花色苷浸出率进行比较分析。由图5可知，蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶处理对矢车菊素-3-半乳糖苷浸出率均高于对照，其中半纤维素酶处理最高为520.48毫克/升，比对照提高20.56%；蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶处理对矢车菊素-3-葡萄糖苷苷浸出率均高于对照，其中半纤维素酶处理最高为40.69毫克/升，比对照提高29.36%，蜗牛酶处理为40.39毫克/升，二者差异比不显著；蜗牛酶、半纤维素酶处理对矢车菊素-3-阿拉伯糖苷浸出率均高于对照，其中半纤维素酶处理最高为157.71毫克/升，比对照提高33.19%，纤维素酶处理为85.04毫克/升，比对照低19.28%；蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶处理对总花色苷浸出率均高于对照，其中半纤维素酶处理最高为718.88毫克/升，比对照提高23.83%。
3 结论与讨论
本试验以黑果腺肋花楸果实为原料，在其酿酒过程中，加入蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶，采用HPLC法研究酿酒发酵前后不同种类花色苷的含量变化，结果表明，半纤维素酶处理对矢车菊素-3-半乳糖苷浸出率最高，含量达520.48毫克/升高为，比对照提高20.56%；矢车菊素-3-葡萄糖苷含量达40.69毫克/升，比对照提高29.36%；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷含量达157.71毫克/升，比对照提高33.19%；总花色苷含量达718.88毫克/升，比对照提高23.83%，半纤维素酶处理显著提高了黑果腺肋花楸果实酿酒过程花色苷的浸出率。
本实验仅对蜗牛酶、纤维素酶、半纤维素酶在花色苷的浸出率方面进行了初步研究，酶对植物细胞壁起到破坏和溶解作用的机理还不清楚，酶的最佳使用量、酶的最佳pH值条件、最佳使用温度等方面还需进一步研究。本试验仅对三种单体花色苷及总花色苷进行了检测，而对绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素等的浸出是否具有促进作用还有待进一步研究。
参考文献
[1]王鹏，马兴华，韩文忠，等.SO2对黑果腺肋花楸果酒的抑菌规律及发酵启动的影响[J].东北农业大学学报，2011，（02）：76-78.
[2]于明，李铣，张丽，等.黑果腺肋花楸果实的化学成分[J].中草药，2010，41（04）：544-546.
[3]国石磊.黑果腺肋花楸花色苷分离纯化、结构鉴定及其抗氧化活性研究[D].河北科技师范学院，2015，64-66.
[4]MALODOBRY M， BIENI
-ASZM，DZIEDZICE. Evaluation of the yield and some components in the fruit of blue honeysuckle （Lonicera caerulea var. edulis Turcz. Freyn.）[J].Folia Horticulturae， 2010，22（01）：45-50.
[5]WU X， GU L， PRIOR RL. Et al. Characterization of anthocyanins and proanthocyanidins in some cultivars of Ribes， Aronia， and Sambucus and their antioxidant capacity[J] .Agric. Fd Chem.，2004，（52）：7846-7856.
[6]OSZMIAN′SKI J， WOJDYLO A. Aronia melanocarpa phenolics and their antioxidant activity[J]. European Food Research and Technology， 2005， 221 （06）： 809-813.
[7]曾友梅，李林基，程儒雄.w维素酶和蜗牛酶的试制及脱壁试验初报[J].热带农业科学，1982（04）：32-33.
[8]刘伟，查晶，胡一桥.壳聚糖作为缓控释辅料研究的最新进展[J].中国药科大学学报，2000（03）：12-15.
[9]王玉芝.纤维素酶的生产和应用[J].湖北化工，1997（02）：56-57
[10]张明霞，段长青，张文娜.纤维素酶在食品工业中的应用与展望[J].酿酒科技，2005，（99）：22-28.
[11]张艳芳，魏冬梅，袁春龙.酶在葡萄酒中的应用[J].中外葡萄与葡萄酒，2001，4（22）：24-26.
[12]谢占玲.植物细胞壁降解真菌及酶的研究[D].甘肃农业大学，2011.
[13]罗静，石会军，李长春，等.超声波辅助半纤维素酶提取南瓜皮果胶的工艺研究[J].黑龙江农业科学，2013，（01）：90-93.
[14]程国立.浸泡酶对蛇龙珠红葡萄酒花色苷的影响[D].北京： 中国农业大学，2007，57-59.
[15]赵权.干旱胁迫对山葡萄花色苷合成及相关品质的影响[J].北方园艺，2012，1（24）：44-46.
Abstract： This is a major byproduct of wheat bran flour， accounting for 15% to 20% of the wheat quality， every year about 20 million t of wheat bran resources， more than 85% for feed， traditional brewing industry， increase the value of the resource conversion rate. Wheat bran is rich in dietary fiber， protein， phytic acid， vitamins， minerals and so on. This paper uses cellulase， hemicellulase and xylanase enzyme on wheat bran be determined by experiment cellulase， hemicellulase and xylanase enzyme bran joint optimal conditions that is 60℃， PH 4， hydrolysis time was 4hr， feed water ratio of 1：15 enzyme ratio of 5：10：2， or at 60℃， PH 5， hydrolysis time of 3hr， the ratio of water to 1：10 enzyme ratio of 5：10：3， under this condition， the consumption of wheat bran after enzymolysis.
关键词： 小麦麸皮；生物酶解；复合酶解法；食用性
Key words： wheat bran；bio-enzymolysis；compound enzymatic hydrolysis；edibility
中图分类号：S816.44 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2014）11-0301-03
0 引言
小麦麸皮富含纤维素和半纤维素、蛋白质、矿物质、脂肪、低聚糖以及β-淀粉酶、植酸酶等成分，是人体植物雌激素的重要食物来源，具有抗衰老、抗癌、减肥、减少憩室病、胆结石和结肠癌发生等重要生理功能，其主要成分见表1。小麦麸皮是小麦加工的副产物，占小麦质量的15%～20%，我国每年加工出的小麦麸皮可达2000万吨以上。由于其细胞结构的高度纤维化，人体内分泌的消化酶无法分解，营养物质不能够充分吸收，因此，85%以上麸皮都用于酿造和饲料行业，极少被开发直接用于饮食。
麦麸中的营养成分主要集中在麦麸细胞壁内，麦麸细胞壁因高度纤维化而十分坚韧，因此要想提高小麦麸皮的可食用性和营养成分必须首先解决充分分解麦麸细胞壁的结构。本项目拟采用细胞壁溶解酶为主体的多酶反应体破壁降解小麦麸皮技术的研究，在温和、安全的条件下，对小麦麸皮的细胞进行有效的酶解破壁，从而克服机械破壁投资大、能耗高、活性遭破坏且重金属超标等弊端，其各种有效成分经生物酶解破壁，活性营养成分迅速释放，可经消化系统，直接被人体所吸收，其速度更快，功效更强，而又无任何毒副作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小麦，选购于粮油市场；纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶，购于和氏璧生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
万能粉碎机，水浴槽，真空干燥箱，烘箱，马弗炉，酸度计，电子天平，分析天平，分光光度计，超声波，离心机，蛋白质测定仪，消化炉，振荡水浴，液相色谱仪。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程 小麦洗净挖干粉碎筛分麸皮酶解低温真空浓缩干燥麦麸酶解粉。
1.3.2 实验方法 本研究重点为酶解工艺参数的确定，选用纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶三种酶进行实验分析。首先用这三种酶分别经行单因素实验确定各酶的最佳使用量范围，然后根据影响酶解工艺的主要影响因素（温度，PH，时间，料水比，酶比），进行正交试验确定最佳酶解条件。
依次向反应体系中加入麸皮和蒸馏水，调整反应体系PH6.0，一次加入纤维素酶和半纤维素酶酶液（浓度均为1g/100ml），37℃反应2hr。反应结束，加入1ml 2mol/L的NaOH溶液终止纤维素酶和半纤维素酶的反应。调整PH为5.5，加入保温好的木聚糖酶酶液（1g/100ml），50℃继续反应2hr。取出各管，过滤，取滤液1.5ml于洁净试管中，加入1.5mlDNS溶液，沸水浴5min，冷却定容至25ml，以蒸馏水为空白对照，测定各管540nm光密度值。
1.4 分析方法
①光密度值的测定。采用葡萄糖标准曲线法测定，首先绘制葡萄糖标准曲线，然后进行样品检测。
葡萄糖标准曲线：将少量的葡萄糖（0.3-0.5g）于表面皿上，70℃烘干至恒重。准确称取烘干至恒重的葡萄糖0.2000g溶解，定容至100ml，此标标准液的浓度为0.2%，按表2配制，并测定OD540，做3次平行取均值，绘制葡萄糖标准曲线图1。
②阿魏酸测定。按照《GB/T23916-2008蜂胶中阿魏酸含量的测定方法液相色谱》的紫外检测法。
③烟酸测定。按照《GB/T17813-1999复合预混料中烟酸、叶酸的测定》的高效液相色谱法。
④总膳食纤维和可溶性膳食纤维测定。按照《GB/T5009.88-2008食品中膳食纤维的测定》。
2 结果与分析
2.1 最适酶量及酶比确定 不同浓度纤维素酶、半纤维素酶及木聚糖酶液对光密度值的影响。
由表3和图2可知：在纤维素酶及半纤维素酶同时存在的条件下，初期，木聚糖酶含量较少时，随着木聚糖酶的增加，水解程度越来越大，水解效果越来越好，当酶含量达到一定值后，水解效果上升趋势不显著。依据表3数据，1号管吸光值较0号管大，进一步证实纤维素酶和半纤维素酶对小麦麸皮的水解有效果；2号管数值较1号管有所增大，说明加入木聚糖酶后，水解效果更好。3-5号管的数值与2号管相差不大，说明继续增大木聚糖酶的量对小麦麸皮的水解没有明显的效果，因此，2号管的酶量是最适酶量，即0.1ml0.5g/100ml的木聚糖酶。
2.2 酶解条件的确定
2.2.1 正交试验表 为寻求温度、PH、酶解时间、料水比、酶比这5个关键因素之间的最优水平组合，验证三种酶的酶比，设计了正交试验，见表4、表5。
依据表5的因素分析，主次因素为：酶比>温度>酶解时间>PH>料水比。
2.2.2 方差分析及F检验 模型误差均方MSe1与实验误差均方MSe2差异极显著，说明试验因素间交互作用极显著，此时各试验因素水平间的差异已不能真正反映因素的主效，进行各因素水平间的多重比较五多大实际意义，只能以试验误差均方MSe2进行F检验与试验处理间多重比较，以寻求最优水平组合。F检验结果表明，温度、PH、酶解时间、料水比、酶比对麸皮的水解都有极显著影响；区组间差异不显著。模型误差显著，还应进一步试验，以分析因素间的交互作用。
2.2.3 试验处理间多重比较（LSD法）（表7） 各试验处理间平均数多重比较结果，第13号试验处理与第14号试验处理与其余各试验处理间差异极显著或显著，最优水平组合为第13号试验处理A4B1C4D2E3，即60℃，PH为4，酶解时间为4hr，料水比为1：15，酶比为5：10：2。
2.3 麸皮酶解前后营养素分析 酶解物料进行低温真空浓缩干燥，制得麦麸酶解粉；进行酶解前后营养物质的测试，采用：检测数据见表8。
从表8麸皮酶解前后营养素检测数据显示，酶解后，膳食纤维明显下降，烟酸、阿魏酸显著增加。烟酸含量为2275.937μg/g，为原麸皮的4.806倍；阿魏酸含量为214.764μg/g，为原麸皮的29.42倍。
3 研究结论
采用复合酶解的技术，明显改善了麸皮的性状，由粗糙变为细腻，提高了其可食性、适口性；小麦麸皮经过复合酶解，营养成分显著提高，尤其是烟酸和阿魏酸，分别比原有提高了4.8倍和29倍；采用生物酶解麸皮，作用条件安全、温和，不但可以安全有效的保留麸皮的营养素，且投资低，易实现产业化。
通过单酶最佳酶解条件的研究、多酶联合正交试验，基本确定了麸皮酶解最佳条件：酶解温度60℃，PH4，酶解时间4hr，料水比1：15，酶比：纤维素酶：半纤维素酶：木聚糖酶=5：10：2。主次因素为：酶比>温度>酶解时间>PH>料
水比。
参考文献：
[1]王旭峰，何计国，陶纯洁，单秀峰.小麦麸皮的功能成分及加工利用现状[J].粮食与食品工业，2010，13（01）：19-22.
[2]林琳.小麦麸皮的营养成分及其开发利用[J].农业科技与装备，2010（03）：53-54.
[3]黄世霞，王在贵，刘朝良等.木聚糖酶体外酶解小麦麸皮相关技术参数研究[J].安徽农业大学学报，2011，38（2）：248-251.
[4]王立东，张丽萍.利用木聚糖酶酶解小麦麸皮制备低聚木糖工艺参数的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（1）：
61-68.
[5]王在贵，刘朝良，王云生.纤维素酶酶解小麦麸皮制备技术初步研究[J].饲料广角，2007，21.
[6]王东石，孟雪琴.酶工程实验指导[M].兰州大学出版社，2011，1.
[7]杜荣骞.生物统计学[M].高等教育出版社，2009，6.
5月28日，丹麦诺维信公司 (Novozymes)在京举行会，正式将全球首款可实现纤维素乙醇大规模商业化生产的酶制剂诺纤力・赛力二代 (CELLIC. CTec2)推向中国市场。该新型纤维素酶复合物适用于多种原料及加工工艺，可将生产每加仑纤维素乙醇所需酶的成本降至50美分，与目前国际市场的汽油价格持平，成为开启纤维素乙醇创新之门的关键。
诺维信中国总裁柯铭在会上表示：“诺纤力・赛力二代是目前全球开发出的成本最低的纤维素乙醇商业化生产技术，商业化设施的逐步建设，将为纤维素乙醇的工艺优化以及酵母活性和适应性提供进一步提升的空间，从而使纤维素乙醇的生产成本进一步降低。”
当代面临的最大的挑战之一就是缺乏可再生且持续的燃料，而生物燃料技术则是目前唯一可用的能够替代石油燃料的技术。近十年来，生物燃料工业界的研究热点一直集中在开发出一种商业上可行的由木质纤维素制造的纤维素乙醇。继上世纪90年代将第一代以粮食为原料的生物乙醇技术带入中国后，诺维信一直致力于第二代纤维素乙醇的技术研究。
与传统汽油相比，纤维素乙醇能够减少二氧化碳排放量达90%。作为发酵法生产纤维素乙醇的一种关键成份，酶制剂可被用来降解生物质中的纤维素，经过预处理和酶解糖化过程发酵生产出乙醇，再以一定的掺混比添加到汽油中成为乙醇汽油。
会上，诺维信亚太区生物燃料市场经理封雯瑞介绍了诺纤力赛力二代的领先性能，它内含独特的蛋白质复合体，能促进酶性能的发挥并可减少用于将纤维素转换为可发酵糖类的酶使用剂量，从而有效地加快转化过程并增加乙醇的产量。“二代酶的添加量与第一代相比可以降低一半以上，并可在更高总固形物含量下实现良好的转化率，有助于生产商减少固定资产投入”。
诺维信于2000年开始研发用于生产纤维素乙醇的酶制剂产品，曾两次获得美国能源部总金额高达2930万美元的项目开发援助金。凭借在酶制剂研制领域的技术储备，诺维信成功地将生产纤维素乙醇所需酶的成本在过去两年中降低了约80%，达到目前的50美分/加仑。诺维信预计纤维素生物燃料的成本还会进一步降低，目前国际上已建设有多套工业示范装置。目前，诺维信正在通过与全球生物燃料工业中众多业界领袖合作，加速纤维素乙醇生产过程中的技术开发和实施，进一步降低纤维素乙醇生产用酶的成本。
今年5月，诺维维和中粮集团与中石化集团就纤维素乙醇的产业化事宜签订备忘录，根据该协议，中粮与中石化将于2011年第三季度开始建设以玉米秸秆为原料的万吨规模纤维素乙醇示范工厂；诺维信将为该工厂提供诺纤力・赛力二代。自2006年以来，诺维信便开始了与中粮集团在中国合作的项目，并于2009年2月与中粮集团和中石化集团签署达成联合开发第二代燃料乙醇的合作协议，共同推进以玉米秸秆为原料的纤维素乙醇的规模化商业生产与销售进程。
