时间：2023-05-30 09:05:46
关键词：细胞的生活；基本单位；导学案
《细胞的生活》是人民教育出版社七年级生物学上册第二单元《生物体的结构层次》中的第一章《细胞是生命活动的基本单位》中的最后一节内容。也就是在学习了动物、植物细胞的结构之后，知道了细胞是构成生物体的基本单位后的一节。在统观初中生物学教材，并结合自己对《义务教育生物课程标准》相关内容理解的基础上，我认为这一节的目的是帮助学生进一步完善“细胞是生命活动的基本单位”这一初中生物学的核心概念，在整个初中生物教学中起提纲挈领的作用。
为了使学生进一步完善“细胞是生命活动的基本单位”这一初中生物学的核心概念，《细胞的生活》中前所未有地出现了许多新概念：有机物、无机物、细胞膜的作用、能量转换器、受精卵、遗传信息等，这几乎是整个初中生物学内容的概述。鉴于此，我觉得对于学生来说，现在学习《细胞的生活》内容，只能做到浅尝辄止，不求甚解。就像一个电视剧的序幕，精彩的、主要的情节会在今后的节次中层层展开，步步深入。比如，叶绿体和线粒体如何转换能量，受精卵怎样将遗传信息代代相传等。而本节的教学活动只是让学生认识、知道这些概念而已。
《细胞的生活》由两个主要内容组成：（1）细胞的生活需要物质和能量。（2）细胞核是控制中心。教学中我将它们划分为三个部分：（1）细胞的生活需要物质。（2）细胞的生活需要能量。（3）细胞核是控制中心。学生接受困难主要有三点：（1）有机物与无机物的分类。（2）叶绿体和线粒体的作用。（3）遗传物质。基于对教材和课程标准的理解，我确定了教学目标，对本节教学内容设计了导学案，并辅之以课件。
在导学案的设计中，我从动物、植物细胞的结构来复习引入。让学生观察图片，完成动物、植物细胞异同点的两道选择题，来达到强化“细胞是构成生物体结构的基本单位”这一二级概念。教学中的第一部分“细胞的生活需要物质”，通过让学生阅读课本第50页的内容，知道细胞生活需要的物质分为有机物和无机物两类，并尝试区分哪些是有机物，哪些是无机物。这是学生在课本中可以找到答案的。至于什么是有机物，什么是无机物，只需举种子燃烧的实例略加说明，不能深究。通过观察图片让学生感受这些物质进出细胞是由细胞膜控制的，从而建立“细胞膜能够控制物质进出”这一概念。
第二部分“细胞的生活需要能量”由感受汽车和人的运动都需要能量入手，引出细胞内的两个能量转换器：叶绿体和线粒体。通过展示图片让学生知道叶绿体和线粒体在细胞中的位置及大致形状。知道叶绿体是储存能量，而线粒体是释放能量。至于如何储存，如何释放，提示学生将在今后的生物学学习中加以认识理解，但要告诉学生无论是叶绿体储存的能量或者线粒体释放的能量最终都是来源于太阳的光能。
第三部分“细胞核是控制的中心”既是本节课的重点，又是本节课的难点。这个概念的引入要从分析“小羊多莉的身世”入手。通过分析资料使学生明确看出“多莉长得像提供细胞核的母羊B”，从而形成“细胞核是控制中心”的结论。同时通过阅读课本知道：细胞核中控制生物生长发育和遗传的物质是脱氧核糖核酸，简称DNA，展示图片，了解DNA的结构模型。至于DNA的结构是怎样的？它如何控制遗传信息？那是本节课所不能解决，只能为今后的教学活动埋下伏笔，作为激发学生继续学习和探究生物学兴趣的手段和方式。
根据每个内容的目的和要求，导学案中设计了适当的练习题，来检测本节课的教学效果。大部分练习题是可以在课本上找到答案的，少数的几个综合题，结合前面的知识，大部分学生也有能力完成。在课堂小结后，设计的练习题起回顾、记忆和综合之功效，使学生对整个教学内容有一个整体的结构框架，帮助学生建立相应的知识体系。
为此，整个教学过程帮助学生进一步完善了“细胞是生命活动的基本单位”这一生物学的核心概念。而恰恰课文的最后一段内容又正好是突出和强化这一概念的，所以在课堂的剩余时间里，让学生识记并熟读这个内容，我认为是必须的，也是必要的。
课件是教学的辅助工具，要为完成教学任务服务，要与学生手中的导学案相辅相成，同时又要尽量避免与教材中的内容相左或重复，以免让学生眼花缭乱。我在选择幻灯片的时候，力求少而精，主要是为学生完成导学案中的练习题提供帮助。图片有复习引入的动物植物细胞的结构、物质的分类、细胞膜控制物质进出示意图，反映生活现象的“汽车和人的运动”。细胞中叶绿体和线粒体的位置、为说明“细胞核是控制中心”的“小羊多莉的身世”资料、DNA的结构模型等。
细胞膜上钠泵活动的生理意义是建立起一种势能贮备、保持渗透压。钠钾泵又称“钠泵”或“钠钾ATP酶”，使细胞外的NA+浓度高于细胞内，当NA+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物质以共同运输的方式带入细胞。
钠钾泵（也称钠钾转运体），为蛋白质分子，进行钠离子和钾离子之间的交换。每消耗一个ATP分子，逆电化学梯度泵出三个钠离子和泵入两个钾离子。保持膜内高钾膜外高钠的不均匀离子分布。钠钾泵的一个特性是他对离子的转运循环依赖自磷酸化过程，与之相类似的还有钙泵和质子泵，它们组成了功能与结构相似的一个蛋白质家族。
（来源：文章屋网 ）
作者：郭英 黄高升日 闫庆国 王哲 张永清
【关键词】 霍奇金病
关键词: 霍奇金病;淋巴细胞;增生
摘 要:目的 认识霍奇金病（Hodgkin’s Disease，HD）组织中的淋巴细胞的增生性质. 方法 应用PCNA免疫组化方法测定经石蜡包埋40g・L-1 甲醛固定的10例HD和10例反应性增生淋巴结标本的增生活性. 结果 10例HD病的背景淋巴细胞平均增生分数为（17.92±7.1）%，10例反应性增生淋巴结淋巴细胞平均增生分数为（11.14±8.6）%，统计学分析表明两者的增生分数有非常显著的差异（χ2 =75.6，P
Keywords:Hodgkin’s disease;lymphoid cell;hyperplasia
Abstract:AIM To find out the nature of lymphoid cells in the tissue of Hodgkin’s disease，based on estimating prolifer-ative activity.METHODS By using an antibody to prolifer-ating cell nuclear antigen（PCNA），proliferative activity of background lymphoid cells of10cases of Hodgkin disease in-cluding7cases of mixed cellularity type，3cases of nodular sclerosing type were estimated and10cases of lymphadenitis used as control group.RESULTS The mean growth fraction of background lymphoid cells was significantly higher than that of reactive group.CONCLUSION The lymphoid cells in the tissue of Hodgkin’s disease might probably not be reac-tive.
0 引言
霍奇金病（Hodgkin’s Disease，HD）是淋巴造血系统的恶性肿瘤.HD病组织中细胞成分复杂［1，2］ .其中公认的肿瘤细胞为RS细胞、霍奇金细胞（总称HRS细胞）及其变体细胞.淋巴细胞在该病组织中占据很大组分，它在该病中是单纯的反应性增生的淋巴细胞，还是参与组成恶性成分，这个问题是关系到霍奇金病肿瘤细胞起源的关键问题.我们应用PC-NA单抗免疫组织化学染色方法检测了10例霍奇金病及10例反应性增生的淋巴结中淋巴细胞的增生活性，以认识霍奇金病组织中淋巴细胞的增生性质.
1 材料和方法
1.1 材料 HD石蜡包埋标本10例（混合细胞型7例，结节硬化型3例）及反应性增生淋巴结石蜡包埋标本10例均取自本校西京医院病理科.其中反应性增生淋巴结的诊断标准依据Krishnan等［3］ 的论著所述.上述标本用切片机制成5μm厚石蜡切片行PC-NA单抗免疫组化染色.
1.2 方法 PCNA单抗购自博士得公司，Envision购自Dako公司，用Envision两步法行免疫组化染色，DAB呈色，苏木精衬染.设PBS及正常鼠血清替代一抗作为阴性对照.用目镜中放置方格测微器观察，在病变组织内随机分别记数10个高倍视野中固定方格内总数1000个PCNA染色阳性及阴性淋巴细胞，计算每例HD及反应性增生淋巴结中淋巴细胞的增生分数.即:淋巴细胞增生分数=PCNA阳性淋巴细胞PCNA阳性淋巴细胞+PCNA阴性淋巴细胞×100%统计学处理:用χ2 连续校正检验.以P
2 结果
PCNA阳性细胞胞核呈棕黄色反应，有的细胞胞核呈极浅的棕黄色，未算在阳性细胞之列（Fig1，2）.两种阴性对照均未见胞核呈阳性反应.HD组织背景淋巴细胞的平均增生分数为（17.92±7.1）%，反应性增生淋巴结组织中淋巴细胞的平均增生分数为（11.14±8.6）%.经χ2 检验连续性校正，HD中背景淋巴细胞的增生分数显著高于反应性增生淋巴结中淋巴细胞的增生分数（χ2 =75.6，P
转贴于 图1 － 图2 略
3 讨论
HD病是人类常见的淋巴造血组织恶性肿瘤.其肿瘤组织中细胞成分混杂，现公认其中HRS细胞及其变体细胞为该病的肿瘤细胞.现今对HD病因之研究热点仍集中于这类细胞［1，2］ ，而认为HD病肿瘤组织中的淋巴细胞是反应性的［1，2］ ，很少引起关注.然而HD病的特点在于少量的肿瘤细胞与大量增生的淋巴细胞及其他细胞相混杂，其中的淋巴细胞是否真是普通的反应性增生的淋巴细胞是关系到霍奇金病肿瘤细胞起源的关键问题.Ohshima等［4］ 用单细胞分析及原位杂交证实HRS细胞是非克隆性的，最近有人用原位研究发现HD组织中的淋巴细胞的染色体异常［5］ .这些均对HRS细胞的肿瘤性质及背景淋巴细胞的本质提出质疑.我们利用Ki67标记指数法证实HD病中背景淋巴细胞较普通淋巴组织增生之淋巴细胞的增生活性有显著升高［6］ .另有人用PC-NA免疫组化染色证实各型HD病中背景T淋巴细胞增生活性较高［7］ ，但未对HD组织中背景淋巴细胞与普通淋巴组织增生之淋巴细胞的增生活性做出比较，因而不能提示它们是否具有瘤性增生的活性.现在我们用PCNA抗体将HD病与反应性增生淋巴结同时染色，发现HD病背景淋巴细胞较反应性增生淋巴结之淋巴细胞的增生活性有显著升高.PCNA是细胞周期中DNA聚合酶-δ的辅助蛋白［8，9］ ，它的水 平在G1 与S的交界处增多，这时用免疫组化方法可以检测到PCNA，PCNA在S期的后期水平达到最高［10］ ，所以PCNA是反映细胞增生的可靠指标之一.而且PCNA抗体可以用于检测甲醛固定石蜡包埋的组织，应用较为便利.我们分别用PCNA及Ki67标记指数法均发现HD病组织中之淋巴细胞的增生活性明显高于普通反应性增生的淋巴细胞的增生活性，而且用PCNA免疫组化法所测得的HD病中淋巴细胞的增生活性与低度恶性非霍奇金淋巴瘤接近［11］ ，表明其可能具有瘤性增生活性，可能参与HD病中恶性细胞的组成成分.
参考文献
［1］Hsu SM，Hsu PL.The nature of Reed-sternberg cells:Pheno-type，genotype，and other properties ［J］.Crit Rev Oncog，1994;5（2-3）:213-245.
［2］Kadin ME.Pathology of Hodgkin’s disease ［J］.Curr Opin On-col，1994;6（5）:456-463.
［3］ Krishnan J，Danon AD，Frizzera G.Reactive lym-phadenopathies and atypical lymphoproliferative disorders ［J］.Am J Clin Pathol，1993;99（4）:385-392.
［4］Ohshima K，Suzumiya J，Mukai Y，Tashiro K，Shibata T，Tanaka T，Kato A，Kikuchi M.Classical Hodgkin and Reed-Sternberg cells demonstrate a non-clonal immature B lymphoid lineage:Evidence from a single cell assay and in situ hybridiza-tion ［J］.Hematol Oncol，1996;14（3）:123-136.
［5］Jansen MPHM，Hopman AHN，Haesevoets AM，Gennottle IA，Bot FJ，Arends JW，Ramaekers FC，Schouten HC.Chromoso-mal abnormalities in Hodgkin’s disease are not restricted to Hodgkin/Reed-sternberg cells ［J］.J Pathol，1998;185（2）:145-152.
［6］Huang GS，Yan QG，Wang Z，Guo Y，Zhang XH.Lymphoid cells are not reactive in the tissue of mixed cellularity Hodgkin’s disease ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:S98-S100.
［7］Schmid C，Sweeney E，Isaacson PG.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in Hodgkin’s disease ［J］.J Pathol，1992;168（1）:1-6.
［8］Prilich G，Tan CK，Kostura M，Mathews MB，So AG，Downey KM，Stillman B.Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-δauxiliary protein ［J］.Nature，1987;326:517-529.
［9］Bravo R，Frank R，Blundell PA，Macdonld-Bravo H.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-δ［J］.Na-ture，1987;326:515-517.
[关键词]血管紧张素Ⅱ；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞外信号调节激酶；受体
[中图分类号]R619.6 R364.3 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0874－04
研究表明，许多细胞因子在瘢痕形成中可改变在创伤修复中起重要作用的成纤维细胞的增殖与迁移，引起组织细胞对损伤的过度反应，导致瘢痕过度增生。因此研究细胞因子对成纤维细胞增殖、分化、演变及凋亡的调控，是目前研究增生性瘢痕形成机制的热门课题。最新的研究发现血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是一个重要的致纤维化因子，且与皮肤的纤维增殖性病变有密切关系。我们最近也报道了Ang Ⅱ可促进增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原的合成，然而其影响增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的信号机制尚未阐明。本研究我们采用体外培养增生性瘢痕成纤维细胞，观察Ang Ⅱ对细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性的影响，旨在探讨其作用的分子机制。
1 材料和方法
1．1 主要材料和试剂：实验所需增生性瘢痕组织标本取自我科住院患者手术切除的增生性瘢痕组织。增生性瘢痕形成不超过一年，取材部位未经任何治疗，不伴有肿瘤或其他结缔组织疾病。未曾服用抑制血管紧张素系统的药物。
DMEM培养液和胎牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(日本Wako公司)，Dispase(日本Sanko公司)。AT1受体阻断剂Valsartan，AT2受体拮抗剂PDl2339(日本三共公司)，抗细胞外信号激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)和pERK的抗体，兔抗人ATl受体多克隆抗体，羊抗人AT2受体多克隆抗体均购自Santa Cruz公司。德克萨斯红(Dexas Red)标记的鼠抗兔IgG，FITC标记的兔抗羊IgG均由第四军医大学全军神经科学研究所提供。
1．2 成纤维细胞培养：应用胶原酶法行成纤维细胞培养，用0.125％的胰蛋白酶消化传代。实验所用成纤维细胞为第3－4代。
1．3 免疫荧光组织化学检测AT1和AT2受体表达：利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中AT1和AT2受体表达情况。操作按试剂盒说明进行，将培养的细胞用40g/L多聚甲醛固定10min，PBS缓冲液洗涤，1％BSA封闭30min，分别加入工作浓度为1:50的相应抗体，4 ℃下保持在湿盒中孵育36h。洗涤后，加入两种荧光素混合液(工作浓度分别为FITC标记1:30，得克萨斯红标记1:100)，室温孵育3h。经得克萨斯红标记后，AT1受体呈红色荧光(激发波长514nm)，FITC标记后，AT2受体呈绿色荧光(激发波长488nm)当细胞同时标记到两种荧光素时则表现为黄色荧光。通过计算机采集共聚焦显微镜所得图像。
1．4 实验分组：选择生长状态良好3－4代的成纤维细胞，接种于24孔细胞培养板，2％血清培养液培养48h，无血清培养，实验组分为5组，并按实验设计分别加入10-7mol/L Ang Ⅱ，10-7mol/L Ang Ⅱ+10pμmol/L Valsartan，10-7mol/L Ang Ⅱ+10μmol/L PDl23319，10μmol/L Valsartan，10μmol/L PD123319，对照组仅加入等量的DMEM。于相同条件下继续培养。
1．5 Western blot分析细胞外信号激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性：取各组细胞按试剂盒说明书操作。具体方法如下：实验终点取细胞溶解物、离心、提取总蛋白。取25μg蛋白，变性后上样于10％的聚丙烯酰胺凝胶，经电泳分离后，电转移到PVDF膜，加入一抗即：抗ERK或pERK的抗体(工作浓度1:1000)，加入辣根过氧化物酶结合的二抗，ECL化学法光试剂盒检测信号。通过美国NIH图像分析系统(美国国家卫生研究院研究服务中心)，对各条带的灰度值进行测定比较。每次实验重复3次。
1．6 统计学分析：数据以(均数±标准差)表示，统计处理应用SPSS软件，组间比较采用方差分析，两两比较用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2．1培养的增生性瘢痕成纤维细胞Ang Ⅱ受体
AT1和AT2的表达：对培养的3－4代的增生性瘢痕成纤维细胞免疫荧光组织化学染色发现，增生性瘢痕成纤维细胞同时表达AT1和AT2受体，阳性标记主要位于细胞膜。AT1受体的阳性标记似乎较AT2受体阳性标记强。
2．2 Ang Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化的影响：在无血清培养的条件下，AngⅡ(10-6mol/L)的刺激引起培养的增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化增加，在Ang Ⅱ刺激后5min，ERK磷酸化程度达到峰值。在一定剂量范围内，刺激物Ang Ⅱ浓度增加，细胞ERK磷酸化程度增加
2．3 AT1和AT2受体在Ang Ⅱ诱导的增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化中的作用：与对照组比较，1×10-7mol/L Ang Ⅱ显著增加成纤维细胞ERK磷酸化，且差异有统计学意义(P＜0.05)。10μmol/L AT2受体拮抗剂PD1233191与10-7mol/L Ang Ⅱ同时刺激成纤维细胞，PD123319l可显著增强Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化，与单纯Ang Ⅱ组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受体拮抗剂Valsartan与10-7mol/L Ang Ⅱ同时刺激细胞，Valsartan可显著抑制Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化，与单纯Ang Ⅱ组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；Valsartan或PD1233191单独刺激细胞并未明显影响ERK磷酸化，应用抗ERK抗体显示各组ERK含量一致。
3 讨论
增生性瘢痕主要病理表现是成纤维细胞异常过度增殖、细胞胶原代谢异常导致细胞外基质过度沉积，其形成机制尚未完全阐明。目前研究已证明，细胞因子在瘢痕形成中起着重要作用。肾素一血管紧张素系统最重要的活性产物Ang Ⅱ作为一个重要的应激激素和多效应生长因子不仅在心血管和肾脏的纤维化病变中起重要作用，而且与皮肤的瘢痕形成和成熟关系密切。我们也曾报道了Ang Ⅱ通过其受体调节增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为。然而其作用的细胞信号机制仍未阐明。ERK是哺乳类动物和无脊柱动物细胞中最早发现的丝裂素激活蛋白激酶家族的核心成员，是目前研究比较清楚的刺激转录增加的一条通路。该通路最主要的激活信号来自生长因子，通过改变靶蛋白的磷酸化在细胞生长、迁移及分化等信号传递中起重要作用。多种细胞因子包括Ang Ⅱ通过其受体可激活ERK，导致几个早期即刻基因c－fos、c－jun、erl－1等表达增加。陈伟等报道在增生性瘢痕组织中磷酸化ERK表达增加。刘传君等报道瘢痕疙瘩的成纤维细胞和正常皮肤的成纤维细胞ERK磷酸化程度明显不同阳。上述发现提示ERK通路的改变可能与增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为改变有关。为进一步探索Ang Ⅱ影响增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的分子机制，本研究以观察Ang Ⅱ对瘢痕成纤维细胞ERK活性的影响为切入点，试图初步阐明其作用可能的信号机制。
本实验首先观察了Ang Ⅱ受体在培养的增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。免疫荧光组织化学的检测结果显示增生性瘢痕的成纤维细胞同表达AT1和AT2受体蛋白，这个结果再次证实我们以前的发现。为弄清Ang Ⅱ如何调控增生性瘢痕成纤维细胞ERK的磷酸化，我们用药理学受体阻断的方法观察了Ang Ⅱ受体AT1和AT2在成纤维细胞ERK磷酸化中的作用。本实验我们发现Ang Ⅱ刺激可增加人增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，用选择性AT1受体阻断剂Valsartan阻断AT1受体可抑制Ang Ⅱ诱导的成纤维细胞ERK磷酸化，用AT2受体拈抗剂PD123319阻断AT2受体可促进细胞ERK磷酸化，AT1受体介导的Ang Ⅱ的促牛长信号受到AT2受体否定的调控，这个实验结果提示：AngⅡ通过其受体AT1和AT2可调控增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ对成纤维细胞ERK活性的影响可能是Ang Ⅱ调控增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为町能的信号机制之一。
已证实正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为存在明显差异，我们前期的研究发现增生性瘢痕中Ang Ⅱ产生增加，AT1和AT2受体表达增加，而且Ang Ⅱ产生和受体表达的变化趋势与瘢痕的成熟过程密切相关。我们现在的研究再次证实，Ang Ⅱ作为一个致纤维化因子不仅在心血管系统起作用，同时也在皮肤瘢痕形成中起作用，同时提示Ang Ⅱ对细胞内的信号分子如ERK活性的调控可能是其影响增生性瘢痕形成可能的信号机制之一。这种调控作用可能是通过Ang Ⅱ产生量及其受体AT1和AT2表达量和表达比例的变化来实现的，通过抑制Ang Ⅱ产生、阻滞AT1受体或激活AT2受体，可导致下游信号通路，如ERK通路阻滞，可能对增生性瘢痕产生抑制作用，从而加快瘢痕的成熟。进一步研究需要在体内实验条件下验证上述可能的推测。
[关键词]五味子酯甲；肝窦内皮细胞；血管新生；肝纤维化
血管新生是指在原有血管结构的基础上通过芽生或套叠增生的方式形成新血管的生物学过程。肝脏在生理和某些病理情况下均可见到血管新生，生理性见于肝脏再生，病理性可见于肝纤维化、肝硬化。研究表明血管新生与慢性肝炎、肝纤维化进程有关，甚至是其促进因素。血管新生是肝纤维化的关键病理变化，能促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）生成、门脉高压的产生，现已证实抗血管新生治疗可有效阻止肝纤维化进展。肝窦内皮细胞（liver sinusoid endothelial cell，LSEC）是肝纤维化血管新生的细胞学基础。五味子味酸，甘，性温，具有收敛固涩、补肾宁心、益气生津等功效，含木脂素类、三萜类、倍半萜类、生物碱类、有机酸、挥发油等多种化学成分，五味子酯甲是木脂素类成分之一，能直接吸收入血，发挥抗肝纤维化作用。本研究采用血管内皮生长因子（vascular en-dothelial growth factor，VEGF）诱导SK-HEP-1细胞增殖、细胞迁移与管腔形成、大鼠主动脉环实验与斑马鱼模型，进一步评价五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。
1 材料
五味子酯甲购自上海融禾医药科技发展有限公司；索拉非尼（sorafenib），VEGF/PDGF受体酪氨酸激酶及丝/苏氨酸激酶抑制剂购自Bayer公司。
SK-HEP-1细胞株（ATCC Number：HTB-52TM）购自中国科学院上海细胞库，为内皮来源人肝癌细胞株。
SD大鼠，6～7周龄，SPF级，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号SYXK（沪）2007-0005。
Minimum Essential Medium（MEM），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自GIBCOTM公司；二甲基亚砜（DMSO），Fibronectin噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；Recombinant Rat Vascular Endothelial GrowthFactor（VEGF Rat）购自Prospe公司；EdU细胞增殖试剂盒（Cell-LightTM EdU DNA Cell Proliferation Kit）购自广州锐博生物科技有限公司；NO荧光探针，NOS试剂盒，结晶紫染液购自碧云天生物技术研究所。Matrigel购自BD Biosciences公司。Transwell24孔板购自美国Coming公司。
2 方法
2.1 细胞培养 SK-HEP-1细胞以10%FBS/MEM培养液培养，每3～4d传代1次。
2.2 药物配制 ①每1L MEM培养基含MEM干粉1袋，NaHCO，2.2g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）2.38g，青霉素0.0625g，链霉素0.1g。②胰酶1L含Trysin 2.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.2g，NaCl8g，KCl 0.4g，Na2HPO4・12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO30.35g。③L-谷氨酰胺100mL：L-谷氨酰胺2920mg加ddH2O至100mL。④PBS缓冲液1L含NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4・12H2O 3.58g，KH2PO4 0.26g。
2.3 细胞模型 SK-HEP-1细胞以每孔8000个接种于96孔板，待细胞长至亚单层，弃培养液，VEGF以0.4%胎牛血清稀释，20μg・L-1VEGF与SK-HEP-1细胞共孵育24h，同时设0.4%胎牛血清培养液作为对照。
2.4 MTF法 药物孵育24h后，弃药液，加入0.5g・L-1MTY工作液，孵育4h。小心吸弃工作液，加入DMSO100μL/孔，至充分溶解，在微孔板扫描分光光度计上测定吸光度A490。
2.5 Edu法 药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入50μmol・L-1EdU溶液100μL孵育2h后，弃上清，每孔加入4%多聚甲醛100μL室温固定15min，0.2%甘氨酸孵育10min，PBS洗涤5min，2次，0.5%Triton X-100透膜10min，PBS洗涤5min，Appllo染色反应液避光孵育30min，PBS洗涤5min，DAPI（1：1000）避光孵育5min，PBS洗涤5min，2次，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplicationSoftware对图像进行分析。
2.6 荧光探针法 胞内NO水平的检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入原位装载5μmol・L-1DAF-FMDA（NO探针）100μL孵育20min后，PBS洗涤3次。Thermo scientific varioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。NOS活性检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入NOS检测缓冲液、检测反应液各100μL，孵育2h后PBS洗涤3次。Thermo scientificvarioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。
2.7 细胞迁移试验 Transwell小室的下室以1mg・L-1纤维粘连蛋白37℃细胞培养箱内包被过夜。细胞同步化后，胰酶消化，离心，用0.4%胎牛血清调整细胞密度至2×105个/mL，上室加入细胞和药物培养液各150μL，药物组各设3个复孔，下室加5%胎牛血清细胞培养液600μL孵育8h后弃上下两室培养液，4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤，结晶紫染色10min，PBS洗涤。Olympus倒置显微镜下观察细胞迁移情况，拍摄。
2.8 细胞管腔形成试验 每孔加100μL Matri-ge1聚合1h，细胞胰酶消化后调整细胞浓度至5×104个/mL与药物培养液按1：1混合，每孔200μL铺在matrigel上，孵育8h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄。
2.9 大鼠主动脉环试验 将主动脉分切成1mm血管环备用。每孔60μL matrigel聚合20min后，加入一主动脉环，放置10min。另加60μLma-trigel于主动脉环上，聚合30min。加100μL含青链霉素的2%FBS，孵育6d后弃培养液，0.4%FBS饥饿6h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作0h；加药物培养液，孵育24h，Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作24h。
2.10 斑马鱼试验 转基因斑马鱼（VEGFR：GFP）受精卵发育24h，移至96孔板中，每孔预加入受试样品溶液，每5个孔为同一浓度，对照为胚胎培养用水加相应量的助溶剂，加盖封闭，置于光照培养箱（28℃）内继续发育24h，于倒置显微镜下观察，记录节间血管的血流数。麻醉，荧光显微镜下对节间血管进行计数并拍照。观察结束后，4%多聚甲醛中固定，甲醇脱水，丙酮透化，碱性磷酸酶染色，显微镜下拍照。
2.11 统计学处理 计量资料用x±s表示。所有数据均使用SPSS12.0软件包进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析，P
3 结果
3.1 五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力的影响分别以含2.5～40μmol・L-1五味子酯甲培养液孵育SK-HEP-1细胞24h，MIT法检测细胞活力，2.5～20μmol・L-1五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力明显抑制，40μmol・L-1对SK-HEP-1细胞活力抑制率达到70%，后续药效试验选择2，20μmol・L-1五味子酯甲（图1）。
3.2 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖的影响 与空白对照组相比，VEGF刺激明显诱导SK-HEP-1细胞增殖；与索拉非尼作用相似，2，20μmol・L-1五味子酯甲显著抑制VEGF刺激的SK-HEP-1细胞增殖，具有一定剂量依赖性（图1）。
3.3 五味子酯甲对SK-HEP-1 细胞内一氧化氮（NO）含量与NOS活性的影响与空白对照组相比，VEGF刺激的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性明显升高；索拉非尼、五味子酯甲降低VEGF诱导的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性，其中2，20μmol・L-1五味子酯甲呈现一定剂量依赖性（图2）。
3.4 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进SK-HEP-1细胞迁移；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组明显抑制SK-HEP-1细胞迁移（图3）。
3.5 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞管腔形成的影响 与空白对照组相比，VEGF促进SK-HEP-1细胞管腔形成；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均明显抑制SK-HEP-1细胞管腔形成（图3）。
3.6 五味子酯甲对VEGF诱导的大鼠主动脉环血管生长的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进大鼠主动脉环血管生长；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均显著抑制大鼠主动脉环血管生长（图3）。
3.7 五味子酯甲对斑马鱼血管的影响 与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼组绿色荧光标记的斑马鱼血管数明显减少，五味子酯甲组无明显变化；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲斑马鱼节间血管数显著减少；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲可显著减少斑马鱼功能血管数量（图4）。
4 讨论
肝硬化患者和实验性肝纤维化动物肝脏中均能见到血管新生现象，血管新生既可以是慢性肝损伤后组织修复中微血管重塑的表现，也与肝纤维化的发展有密切的关系，采用索拉非尼干预血管新生可减轻肝纤维化。促进血管新生的细胞因子有VEGF，转化生长因子-β（transforming growth fac-tor-β，TGF-β），成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowth factor，FGF），血小板源生长因子（platelet de-rived growth factor，PDGF）等。纤维化时，肝脏中VEGF表达上调，主要表达在内皮细胞（endothelialcell，EC）和活化肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中，可促进EC分裂、增殖，迁移，诱导纤维蛋白原激活物和胶原酶的表达，增加血管的通透性，使用特异性中和抗体阻断VEGF信号可减轻肝纤维化。
SK-HEP-1细胞株是无限增殖的人肝窦内皮细胞株，具备肝窦内皮细胞的两大关键特点：一是窗孔结构，二是细胞内吞作用（肝窦内皮细胞关键功能特点），因此，SK-HEP-1细胞是进行体外物质筛选理想的细胞载体。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，不仅可以抑制多种受体酪氨酸激酶活性，还可以抑制丝氨酸―苏氨酸激酶活性。作为多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，该药物不仅具有抑制血管新生作用，最近一些研究表明，该药具有良好的抗肝纤维化作用。
本研究以人肝窦内皮细胞株SK-HEP-1为对象，建立VEGF诱导SK-HEP-1细胞增殖模型。一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸与氧分子结合而生成。NO与肝纤维化密切相关。本研究显示，五味子酯甲能明显降低VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖；降低胞内NO含量，NOS活性；抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移，管腔形成，大鼠主动脉环血管新生。
中图分类号：R752.1 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）7-248-02
生殖器疱疹(genital herpes，GH)主要由HSV-Ⅱ(human simplex virus-Ⅱ)型疱疹病毒感染引起的一种性传播疾病，极易复发。由于复发性生殖器疱疹(RGH)能明显增加梅毒、艾滋病等其他性传播疾病的感染机会而日益受到人们重视。目前较多研究发现，RGH临床上反复发作、难以治愈主要与患者免疫功能低下密切相关[1]，因此调节机体免疫机能是控制GH复发的关键。笔者前期应用中药“黄白液”治疗RGH取得了较好疗效, 对其药物作用机制进行初步的探讨[2]。为进一步完善黄白液治疗RGH药效学机制，本文就RGH患者经“黄白液”治疗前、后外周血自然杀伤细胞(NK细胞)和淋巴细胞因子活化杀伤细胞(LAK细胞)的变化进行检测，报告如下：
l 资料与方法
1.1 临床资料 54例RGH患者均来自我院皮肤性病科门诊，其中男36例，女18例；发病年龄20～36岁，平均年龄25.5岁±4.5岁；病程1～3.0年，平均1.8年。凡肝肾功能不全、免疫功能低下、妊娠和哺乳期或不能完成本研究规定疗程以及1周内服用抗病毒药、3个月内接受过免疫抑制剂或皮质类固醇制剂(系统或局部)治疗者，均作为剔除病例。另选择3O例门诊健康体检者作对照(对照组)，其中男20例，女10例，平均年龄23.5岁±5.0岁。两组性别、年龄比较无统计学差异(P>0.05)，具有齐同可比性。
1.2 治疗方法 RGH患者口服中药黄白液(黄芪、白花蛇舌草、大青叶和板蓝根等药物组成，由本院药剂科提供，批号040428，每袋100mL相当于生药含量120g)口服，1袋/次，2次/d，疗程2个月。
1.3 检测方法 外周血NK和LAK细胞活性的测定按常规用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用RPMⅡ640培养液洗涤3次。调整细胞密度为5X108-9/L，加入IL-2(终浓度为500mL・L-1)培养72h，即可诱生出LAK细胞。参照王甫厚等[3]方法。以K562细胞作为靶细胞，采用LDH释放法测定NK和LAK细胞的杀伤活性。
1.4 统计学方法 数据以均值±标准差(x±s)表示，使用SPSS 11.5统计软件进行分析，采用t检验。
2 结果
2.1 治疗前后结果比较 与对照组相比较，治疗组患者治疗前外周血NK和LAK细胞活性均明显减少(P
表1 治疗组治疗前后和对照组外周血NK和LAK细胞活性的变化(x±s)
与对照组相比较：P0.01；与治疗前比较：P
2.2 复况 治疗后随访到1年，54例患者中有23例患者复发，复发率43％。
2.3 不良反应 治疗中未见严重的不良反应发生。其中3例大便次数略增多，未中断治疗。
3 讨论
生殖器疱疹中医称之为“热疮”、“阴疳”， 临床复发率很高，迄今尚无满意的治疗方法。在西方国家, GH是仅次于非淋菌性尿道炎和淋病而居第3位的性传播疾病。目前临床生殖器疱疹的治疗主要用阿昔洛韦、泛昔洛韦、万乃洛韦等抗病毒药物治疗,但该类药物对初发疱疹疗效较好,而对GH复发仍难以有效控制。中医认为生殖器疱疹为交媾不洁、外感淫邪湿毒、下注而发疱疹。反复发作者为湿热秽毒蕴于，日久耗气伤阴，之邪缠绵难去，致病情经久不愈。治疗上应即扶正(提高机体的免疫功能)和祛邪(抗病毒治疗)结合进行。笔者按照中医“扶正祛邪,邪去则正安”的原理,采用益气养阴,清热利湿解毒之法组方黄白液。全方由黄芪、白花蛇舌草、大青叶和板蓝根等药物组成。其中黄芪益气托毒、排脓生肌，扶正治其本为君药，白花蛇舌草清热解毒利湿为臣药，大青叶、板蓝根清热解毒为佐药。全方针对RGH湿热淫毒久羁，灼伤气阴，正气不足，正虚邪恋之病机，扶正驱邪，标本兼治。现代药理研究表明黄芪具有调节机体整体免疫活性的功能，诱生机体产生高价干扰素间接发挥抗病毒效应 ；白花蛇舌草能刺激网状内皮系统增生，促进抗体形成，从而达到抗病毒的目的；大青叶、板蓝根则有良好的广谱抗病毒作用。
通常HSV-Ⅱ可持续潜存于骶神经节，当机体过度劳累、免疫系统疾病、全身应用免疫抑制剂等因索使机体免疫力降低时，即可导致潜伏病毒被激活而发病。由此可见，机体免疫正常是维持潜伏感染的关键，免疫功能低下是引起潜伏病毒被激活主要原因。免疫学研究证实，RGH患者存在明显免疫功能受抑制现象，该病的感染与复发和细胞免疫功能密切相关[4]。NK细胞是机体中重要的免疫细胞，可直接杀伤被病毒感染的细胞；并可分泌IL-2和IFN-γ等，发挥其免疫增强作用[5]。LAK细胞来源于NK细胞，其杀伤活性远高于NK细胞。田中伟等[6]研究生殖器疱疹患者的细胞免疫功能明显降低，外周血NK和LAK细胞的活性降低。本研究结果发现RGH患者外周血NK和LAK细胞的活性降低，与上述研究报道一致，说明复发性生殖器疱疹患者细胞免疫功能缺陷以及NK细胞数目的下降可能是导致生殖器疱疹患者复发的原因。 RGH经黄白液治疗后随着病情的转归，复发率降低、临床疗效确切。由此可见，RGH患者存在外周血NK、LAK细胞的活性明显下降，中药黄白液可显著升高RGH患者外周血NK和LAK细胞的水平，从而增强机体的免疫功能。提示通过对患者细胞免疫功能的调节是黄白液药效学机制之一。
参考文献
[1]朱明芳，陈晋广，杨志波，等. 复发性生殖器疱疹患者的免疫学研究进展. 湖南中医药大学学报,2009,（29）9:66-68.
[2]陈晋广,杨志波,朱明芳. 中药“黄白液”对复发性生殖器疱疹患者外周血Th1/Th2 细胞因子的影响.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2009,8 （5）：294-295.
[3]王甫厚,陈绍先,郭彩云,等．LDH释放法测定NK 细胞毒的方法研究．中国免疫学杂志,1996,6(2):115-117．
[4] 任小丽,陈晋广.卡介苗素联合阿昔洛韦对复发性生殖器疱疹患者细胞免疫功能IL-2 、IL-10 的影响. 现代中西医结合杂志,2009,18（24）:2939-2940.
【摘要】
目的： 探讨金雀异黄素对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， oxLDL）诱导的血管平滑肌细胞中活性氧（reactive oxygen species， ROS）生成的影响。 方法： 以体外培养的人脐静脉平滑肌细胞（human umbilical vein smooth muscle cell， hUVSMC）为对象，用50 mg/L的oxLDL作用细胞2 h，并加入不同浓度金雀异黄素(10， 30， 90 μmol/L)对其进行干预，应用流式细胞技术和荧光分光光度法分别检测细胞内总ROS水平。结果： hUVSMC经oxLDL刺激2 h后，细胞内ROS水平明显升高（P
【关键词】 金雀异黄素； 活性氧； 氧化型低密度脂蛋白； 血管平滑肌细胞
［Abstract］Objective: To investigate the effect of genistein on reactive oxygen species(ROS) production in vascular smooth muscle cell(VSMC) induced by oxidized low density lipoprotein(oxLDL).Methods： Human umbilical vein smooth muscle cells were pretreated with genistein in different concentrations(10， 30， 90 μmol/L) and then treated by 50 mg/L of oxLDL for 2 hours. The levels of ROS were determined by using flowcytometry and fluorospectrophotometry. Results： The level of ROS in VSMC could be enhanced by oxLDL， genistein(10 μmol/L) might decrease the level of ROS induced by oxLDL， but when the concentration of genistein arrived at 30 μmol/L and 90 μmol/L respectively， it could further enhance the content of ROS. Conclusion： Genistein(10 μmol/L) might remove ROS， but genistein(30， 90 μmol/L) induced the generation of ROS in VSMC.
［Key words］genistein; reactive oxygen species; oxidized low density lipoprotein; vascular smooth muscle cell
金雀异黄素又名染料木黄酮，富含于豆类植物中，化学结构为5， 7， 4′三羟异黄酮，属于植物雌激素［1］。金雀异黄素具有心血管保护、抗肿瘤、抗氧化、防治骨质疏松、治疗绝经期综合征等多方面药理作用，有着广泛的应用前景。目前，关于金雀异黄素潜在的不良反应及毒性作用正在研究之中。已有研究发现，金雀异黄素的多种不良反应及毒性作用与其浓度有关，如高浓度金雀异黄素可导致鼠不育、胚胎畸形及神经毒性作用［2，3］；另外，金雀异黄素的某些作用具有双重性，如低浓度金雀异黄素可增加骨质的密度，而高浓度则对骨生成有抑制作用［4］。抗氧化作用是金雀异黄素的基本药理作用。Kruk等［5］报道，金雀异黄素可抑制活性氧（reactive oxygen species， ROS）的生成，抑制作用随金雀异黄素浓度增加而增强，呈剂量依赖关系。而我室研究结果与其有一定差异，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
金雀异黄素（Sigma公司，lot：G6649）；改良Eagle培养基（DMEM，Gibco公司，lot：1136551）；胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)；胎牛血清（FBS，北京华美公司）；二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司）；2′，7′二氯荧光黄双乙酸盐（DCFHDA，Sigma公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、标准蛋白（南京建成生物公司）；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人脐静脉血管平滑肌细胞培养
采用张闻宇等［6］改良的贴壁法进行人脐静脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的原代培养，将培养的VSMC在倒置显微镜下观察并拍照，用平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白（αactin）单克隆抗体免疫组织化学方法进行鉴定。本实验所用细胞均为第3代。
1.2.2 低密度脂蛋白的分离鉴定和氧化修饰
参照张林华等［7］一次性密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)，参照Kerry等［8］的方法对提取的LDL进行氧化修饰。采用MDA试剂盒测定MDA值，判定LDL是否已氧化，用琼脂糖凝胶电泳鉴定氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL）的纯度及氧化度。
1.2.3 实验分组
分为6组：对照组；oxLDL（50 mg/L）组；oxLDL（50 mg/L）＋DMSO（0.5 ml/L）组；金雀异黄素（10， 30， 90 μmol/L）＋oxLDL（50 mg/L）组（分别标为: G1， G2， G3组）。由于金雀异黄素易溶于DMSO和乙醇，几乎不溶于水，所以本实验用DMSO溶解金雀异黄素，DMSO在培养液中的终浓度为0.5 ml/L，为了消除DMSO对实验的干扰，特设oxLDL（50 mg/L）＋DMSO（0.5 ml/L）组为对照。
1.2.4 流式细胞仪检测VSMC中总ROS水平
取生长状态良好的细胞，0.06%胰蛋白酶消化后以5×105细胞/瓶接种于25 cm2培养瓶内，孵育24 h后，换为含1% FBS的DMEM液作用22 h，使细胞同步化。更换PBS液，按分组加入金雀异黄素或DMSO预先孵育2 h，加入终浓度为50 mg/L的oxLDL作用1.5 h后各组再加入终浓度为10 μmol/L 的DCFHDA。 37℃避光孵育0.5 h后，用含EDTA的胰蛋白酶消化细胞并收集至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清。每管沉淀内加入300 μl PBS吹散细胞，避光。用流式细胞仪（美国BD公司）检测10 000个细胞内的平均荧光强度（激发波长488 nm，发射波长530 nm）。
1.2.5 荧光分光光度法检测VSMC中总ROS水平
细胞处理同“1.2.4”。加入终浓度为10 μmol/L 的DCFHDA，37 ℃避光孵育0.5 h后，取细胞，用荧光酶标仪（Applied Biosystems公司）测定荧光强度。
1.3 统计方法
应用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理，结果用±s表示。采用单因素方差分析，P
2 结果
2.1 细胞培养与鉴定
培养的细胞在显微镜下观察，呈现典型的“峰、谷”样结构特征（图1）。 αactin单克隆抗体免疫组织化学结果显示95%以上为阳性。证明所培养的细胞为血管平滑肌细胞，并且纯度符合实验要求。
2.2 鉴定氧化修饰的LDL
琼脂糖凝胶电泳结果显示oxLDL样品电泳迁移率明显大于LDL，Cu2＋氧化的LDL样品中MDA值为18.6～20.6 mmol/L，说明LDL已充分氧化。
2.3 流式细胞仪检测VSMC中总ROS结果
通过用流式细胞仪对各组细胞内产生的荧光强度进行测定，结果表明：与对照组相比，oxLDL可明显诱导细胞内ROS的增加，细胞内荧光强度由11.06±0.75增至30.65±2.09(P
2.4 荧光分光光度法检测VSMC中总ROS结果
用荧光酶标仪检测细胞内总ROS含量，结果如图2所示，与对照组相比，oxLDL组荧光强度明显升高(P
3 讨论
已有研究表明，金雀异黄素具有抗动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）作用，但具体机制仍不完全清楚。目前认为，血管壁细胞氧化应激产生过量的ROS是引发As的一个重要机制。ROS可通过激活核因子кB，诱导VSMC、血管内皮细胞和巨噬细胞表达多种炎症相关因子，参与血管壁炎症反应；还可刺激VSMC的增殖，从而促进As的发生发展。金雀异黄素是公认的抗氧化剂，它能否通过抑制血管壁细胞内ROS的生成发挥抗As作用是我们感兴趣的问题。氧化应激能引起血浆中LDL氧化修饰生成oxLDL。oxLDL是致As的重要因素，并可诱导VSMC、血管内皮细胞产生ROS［9］。
应用流式细胞术和荧光分光光度法两种方法对VSMC中ROS水平进行测定，结果均显示：当金雀异黄素浓度为10 μmol/L时，可降低VSMC中oxLDL诱导产生的ROS；当浓度达到30， 90 μmol/L时，金雀异黄素反而促进ROS的生成。金雀异黄素这样的双重作用可能与其分子结构及浓度有关。研究表明，黄酮类化合物的抗氧化活性是由它分子结构中的酚羟基的数目及分布决定［10］，金雀异黄素属于黄酮类化合物中的异黄酮，其分子结构中含5，7，4′三个酚羟基，10 μmol/L金雀异黄素的酚羟基可能作为供氢体与自由基反应，使之形成相应的离子或分子，熄灭自由基，发挥其消除ROS作用；也有研究发现，某些黄酮类化合物发挥促氧化作用与其具体分子结构或浓度有关［11］， 30， 90 μmol/L金雀异黄素为什么导致ROS生成增加，值得深入研究。进一步的实验需增设金雀异黄素浓度剂量组，深入观察剂量效应关系，并对其机制进行探讨。
参考文献
［1］张闻宇， 钱民章. 植物雌激素及其抗动脉粥样硬化作用［J］. 江苏大学学报：医学版， 2004， 14(2): 168-170.
［2］McClain RM， Wolz E， Davidovich A， et al. Reproductive safety studies with genistein in rats［J］. Food Chem Toxicol， 2007， 45(8): 1319-1332.
［3］Jin Y， Wu H， Cohen EM， et al. Genistein and daidzein induce neurotoxicity at high concentrations in primary rat neuronal cultures［J］. J Biomed Sci， 2007， 14(2): 275-284.
［4］金永生， 刘超美. 金雀异黄素的药理作用［J］. 国外医药：植物药分册， 2002， 17(5): 190-193.
［5］Kruk I， AboulEnein HY， Michalska T， et al. Scavenging of reactive oxygen species by the plant phenols genistein and oleuropein［J］. Luminescence， 2005， 20(2): 81-89.
［6］张闻宇， 吴芹， 官秀梅， 等. 一种改进的人脐静脉平滑肌细胞培养方法［J］. 遵义医学院学报， 2004， 27(1): 68-69.
［7］张林华， 刘秉文. 一次性密度梯度超速分离人血清脂蛋白［J］. 生物化学与生物物理学报，1989， 21(3): 1792-1798.
［8］Kerry N， Abbey M. The isoflavone genistein inhibits copper and peroxyl mediated low densitylipoprotein oxidation in vitro［J］. Atherosclerosis， 1998， 140(2):341-347.
［9］Chen XP， Xun KL， Wu Q， et al. Oxidized low density lipoprotein receptor1 mediates oxidized low density lipoproteininduced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: role of reactive oxygen species［J］. Vascul Pharmacol， 2007， 47(1): 1-9.
关键词:养阴软坚;非小细胞肺癌;生活质量;生存期
中图分类号:R734.2 文献标识码:B 文章编号:1673-7717(2010)01-0171-02
Clinical Observation of "YangYin RuanJian" on the Quality of Life in Non-Small Cell Lung Cancer
YAO Quanbao1,WANG Lixin2,NI Wei3,SHEN Yili1,ZHU Yan1,ZHENG Xin1
(1.Shanghai First People’s Hospital Branch Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200081,China;
2.Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China;
3.Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China)
Abstract:Objective:To observe the clinical effects of "YangYin RuanJian" on the quality of life,sarviral time in non-small cell lung cancer.Methods:86 subjects were randomized into two groups:control group in which 43 cases and treatment group in which 43 cases,were treated wich chemotherapy plus "YangYin RuanJian",The quality of life,survival time were observed.Results:The quality of life,1 year survival time was better in treatment group than in control group.Conclusion:"YangYin RuanJian" can improve the quality of life,survival time in patients with advanced non-small cell lung cancer.
Key words:"YangYin RuanJian";non-small cell lung cancer;the quality of life;sarviral time
笔者近年开展了中药姑息治疗晚期NSCLC的临床观察,显示出对提高生活质量具有一定作用。本研究是对2005年9月-2008年9月上海市第一人民医院分院中医科和呼吸科等收治的肺癌病人运用养阴软坚法(试验组)干预后晚期肺癌生活质量及生存期等的变化,与未干预组(对照组)比较,以明确中医养阴软坚治疗肺癌的临床疗效及可能机理,为进一步深入研究奠定基础。
1 资料及方法
1.1 诊断标准 参照文献制定[1]。根据病史结合以下检查:可疑影象学表现;痰或胸腔积液找到癌细胞;浅表淋巴结、纤支镜或肺及胸膜穿刺活检找到癌细胞;支气管镜对气管内病变部位取材活检病理学诊断确诊;同位素扫描,特别是PET扫描对发现病灶和转移灶较为敏感和特异;血清学神经特异性烯醇化酶(NEC)对小细胞肺癌、癌胚抗原(CEA)对肺腺癌、鳞癌相关抗原(SCC―Ag)对诊断有一定价值;仔细查体,以发现隐匿性转移灶。其中任一细胞学、组织学检查阳性结果或病史结合影像学、同位素扫描检查等可以确诊。
分期标准:采用美国癌症联合委员会制定的TNM分期系统。
1.2 纳入标准 符合上述诊断标准,经病理或细胞学诊断确诊,TNM分期属于Ⅲ、Ⅳ期;估计生存期超过3个月;没有手术适应症;卡氏评分≥60分;年龄18~95岁;患者及家属充分了解本试验的目的、意义、实施方法、可能的不良反应及补救措施,自愿参加本试验并签署知情同意书;按试验要求服药,依从性好者。
1.3 排除标准 不符合纳入标准;妊娠期或哺乳期妇女;合并严重的心脑血管疾病,或精神障碍等疾病;依从性差者。
本研究的总病例数为86例,随机数字表法单纯随机分为两组,其中试验组43例,对照组43例。2周洗脱期后开始进入研究观察。
1.4 临床资料 见表1～2。
两组性别、年龄、吸烟史、家族史、收入等经卡方检验,差异无统计学意义,具有可比性。
两组体重、主要病理类型及分期等经卡方检验,差异无统计学意义,具有可比性。
1.5 治疗方法
化疗方案:诺维本25mg/m2。第1、8天静推,或长春地辛3mg/m2第l、8天静滴;顺铂20mg/m2第l、5天静滴,3周为1疗程,共3疗程。对不能化疗者用支持治疗及对症治疗。
中药处方:南沙参12g,北沙参12g,天冬12g,麦冬12g,天花粉15g,象贝母9g,玄参9g,牡蛎15g,干蟾皮15g。每天1帖,水煎30min,煎为500mL。
加减:有气虚者加炙黄芪15g,党参15g;阳虚火旺者加龟板9g,鳖甲9g;阳虚者加淫羊霍15g,仙茅15g;恶心、呕吐者加代赭石15g,生姜9g。
两组均基础应用西医化疗方案,试验组加服养阴软坚方水煎剂,每日2次,每次250mL,早、晚饭后半小时顿服。30天为1疗程,连服3个疗程。
观察指标:生活质量评分按文献方法卡氏评分,分为改善>20分,改善10～20分,改善
1.6 不良反应终止或撤出试验病例的剔除和脱落安全性评价标准质量控制与质量保证 按《中药新药治疗支气管肺癌的临床研究指导原则》进行。
1.7 统计学分析 在观察结束后,先检验两组数据的分布正态性、方差齐性及效应的可加性,然后用SPSS 12.0统计软件计算机完成统计分析,计量资料采用单因素方差分析,等级资料用秩和检验,计数资料采用卡方检验。
2 结 果
见表3～4。
生存大于6个月者与小于6个月者比较,χ2=1.40,P>0.10,两组差异无显著统计学意义。
生存大于1年者与生存小于1年者比较,χ2=37.46,P
试验组在观察期间有5例出现大便稀薄,大便次数增多,但无腹痛等伴随症状,不影响继续临床观察,未采取任何治疗措施,结束观察后大便恢复正常;没有出现其他不良反应。
3 讨 论
肺癌是严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上。其发病率和病死率居男性恶性肿瘤第1位,在女性居第2位,预后极差。据报道,NSCLCⅢA、ⅢB期患者的5年生存率分别为15%～30%和10%～20%,80%在诊断后1年内死亡[2]。由于被确诊病例大部分是晚期,多已失去手术等最佳治疗机会,而且对于ⅢB、Ⅳ期患者,手术意义不大[3]。化疗、放疗、生物靶向治疗、支持治疗等成为其主要选择,化疗是最常用的治疗方法,对于失去手术机会的晚期患者及手术后患者均有价值,疗效比较肯定,有报道晚期肺癌患者仅做最佳支持治疗,中位生存期约4～6个月;如果用第三代含铂方案,中位生存期可延长到8～10个月。据报道大多数肺癌患者经过3～4个周期化疗后,再增加治疗周期益处十分有限,只能选择支持治疗等姑息治疗方法。
NSCLC相当于中医“肺积”、“息贲”、“咳嗽”等范畴[4],本病是因正气不足,阴阳气血失衡,脏腑功能紊乱,使机体丧失抗病能力,邪气乘虚而入所致,正如《医宗必读》所说:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”,正气虚为本,邪气为标。笔者观察到,临床肺癌病人多表现为干咳、少痰、痰少而黏,或痰中带血,口干咽燥,低热盗汗、舌质红或红绛,少苔或苔剥,脉细数等阴虚、或阴虚火旺证;且肺为娇脏,喜润恶燥,最易受燥热痰毒损伤,肺癌是肺或支气管有形邪气结聚而成,《丹溪心法》有“人上中下有结块者,多属痰”,是燥热痰毒凝聚而成。
目前,我国超过80%的患者就诊时已属晚期,面对大批失去手术机会的患者,放疗和化疗成为了主要的治疗手段。然而放化疗在缩小肿瘤的同时,其严重的毒副反应常给患者带来极大的痛苦,使身体机能受到严重的打击,生活质量急剧恶化,生存期延长也十分有限。近年来,生活质量在肿瘤学领域的研究越来越受到重视,成为衡最和评价疗效的重要指标之一,为治疗方案的选择和疗效的评价提供了依据。在临床中应用中医治疗肿瘤通过调整患者的机体状况,调动内在抗病能力来达到稳定瘤体,改善症状,“带瘤生存”的目的。其与西医比较,最大的特点是瘤体缩小不明显,但自觉症状好转,生存期延长,生活质量提高。中医药治疗晚期肺癌具有一定的临床疗效,且远期疗效具有一定优势[5]。本研究采用养阴为主的治疗方药以扶助正气,而辅以化痰散结解毒消除瘤邪,结果显示,两组生活质量评分差异有非常显著统计学意义,1年以上生存期有非常显著性差异。提示在必要的放化疗基础上,应用中医养阴软坚治疗非小细胞肺癌提高了患者的带瘤生活质量,并且可延长患者生存期,具有积极的意义,显示了中医的优势,值得临床进一步研究。
参考文献
[1] 国家中医药管理局.中药新药治疗原发性支气管肺癌的临床研究指导原则[S].北京:中国中医药出版社,2003:216-221.
[2] 陈灏珠.实用内科学[M].12版.北京:人民卫生出版社,2005:1697-1713.
[3] 周清华,孙燕.肺癌新理论新技术进展[M].成都:四川大学出版社,2003:147-187.
【摘要】 目的 探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用。方法 将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(AdPTENGFP)及空载体腺病毒(AdGFP)体外转染至RPMI8226细胞。通过MTT法检测细胞生长曲线，Hoechst33342染色检测细胞凋亡，荧光定量PCR(FQPCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化，Western印迹检测PTEN、FAK及pFAK蛋白变化，Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力。结果 AdPTENGFP以感染复数为100转染RPMI8226细胞后，第4天达到最大生长抑制率为42.01%，AdPTENGFP转染RPMI 8226细胞72 h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%，PTEN mRNA及蛋白表达升高，FAK mRNA以及FAK、pFAK蛋白表达下调，与AdGFP组相比差异显著(P
【关键词】 PTEN基因;多发性骨髓瘤;增殖;凋亡;侵袭
目前认为遗传学变异是多发性骨髓瘤(MM)的重要致病因素，抑癌基因的缺失是重要的遗传学变化，但对MM基因学改变还知之甚少。PTEN基因是迄今为止发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因〔1〕。PTEN表达水平与多种血液系统恶性肿瘤密切相关〔2，3〕，幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)病人常见PTEN缺失〔4〕，强力提示PTEN在调节造血细胞增殖、凋亡、恶性转化中的作用。PTEN通过负调控多种信号传导途径，来调节细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤细胞迁移和侵袭。其中PTEN/FAK信号传导通路在影响细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为方面起着重要作用。既往尚无资料显示PTEN是否能够影响MM细胞的增殖和侵袭。因此，我们将重组腺病毒介导的野生型PTEN基因导入人MM细胞株RPMI8226，使PTEN基因在RPMI8226细胞中高表达，观察其对RPMI8226细胞增殖、凋亡和侵袭活性的影响，研究PTEN/FAK的表达水平，以进一步了解MM发生发展中可能存在的分子机制，为探索MM基因治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料 重组腺病毒AdPTENGFP和AdGFP由上海吉凯生物公司合成并鉴定，在293A细胞中进行扩增及滴度测定。人MM细胞株RPMI8226细胞和人胚肾细胞系293A细胞均为本实验室长期保存细胞系。RPMI8226细胞用含15%胎牛血清(杭州四季青)RPMI 1640培养基培养，293A细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养，均在37℃、5%CO2，饱和湿度环境孵育。
1.2 病毒转染及效率的测定 将100 μl含病毒液的无血清培养液加入RPMI8226细胞中，感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为100，在37℃，5% CO2条件下培养2 h，置于含15%胎牛血清RPMI 1640培养液继续培养。流式细胞仪计算转染效率。
1.3 MTT法测定细胞抑制率 取对数生长期RPMI8226细胞，分为对照组、转染AdGFP组、转染AdPTENGFP组，以1×104个/孔接种于96孔板培养，每组3个复孔，实验重复三次，每孔200 μl。按MOI=100转染细胞，于不同时间点每孔加入MTT溶液，孵育4 h后离心弃上清，另加入二甲基亚砜(DMSO)振荡数分钟，选择OD490 nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度A值。抑制率=(对照组A-试验组A)/对照组A×100%。
1.4 细胞凋亡率检测 Hoechst33342染色检测细胞凋亡：分别收集转染后不同时间不同组的RPMI8226细胞，取100 μl细胞悬液，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度为10 μg/mL。常温避光染色15 min，取40 μl细胞悬液，在激发波长为350 nm荧光显微镜下观察结果并计数10个视野(200个细胞/视野)，计算凋亡细胞所占比例。
1.5 实时荧光定量PCR检测PTEN、FAK基因表达 分组收集转染后3 d RPMI8226细胞，Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应：SYBR反应体系共25 μl。反应条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，30个循环，设空白对照，记录循环阈值(Ct值)。根据Ct= Ct目的基因Ct βactin，Ct=2-Ct计算目的基因与βactin相对表达量。PCR引物由北京赛百盛生物公司合成，检测基因序列见表1。
1.6 Western印迹检测PTEN、FAK、pFAK蛋白表达 分组收集转染3 d后RPMI8226细胞，每组收集1×107个细胞，加入200 μl预冷的蛋白裂解液4℃裂解1 h，冰浴下超声裂解15 min。12 000 r/min 4℃离心20 min，取上清，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，分装后20℃保存。取80 μg样品蛋白加入等体积上样缓冲液，经SDSPAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，加入1∶500稀释的小鼠抗人单克隆抗体，4℃培育过夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次。化学发光法检测后分析结果。表1 FQPCR扩增引物序列
1.7 Transwell小室试验检测细胞侵袭力 将50 mg/L Matrigel胶4℃融化，用无血清RPMI1640培养基将其1∶8稀释混匀。200 μl包被Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃风干备用。将不同转染组细胞加入无血清培养基孵育12 h。取105细胞加入800 μl无血清培养基中，加入1 g/L BSA维持渗透压，放入Transwell小室上层。下室加入含10%FBS RPMI1640培养基1 000 μl，在37℃、5% CO2环境下培养孵育24 h。取出小室，用下室培养液反复淋洗下室底面，用棉签擦去多聚碳酸盐膜上层细胞，立刻在倒置荧光显微镜下观察穿膜及黏附在小室下层有荧光的细胞数量，400倍显微镜下计数10个视野取平均值，以穿膜细胞数目多少作为评价其侵袭力强弱的指标。将脱落及淋洗下来的细胞在倒置显微镜下计数荧光细胞数。整个操作过程于冰上及无菌条件下，并重复3次。
1.8 统计学方法 数据以x±s表示，两样本均数比较应用t检验，多样本均数比较应用方差分析，率的比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 重组腺病毒的转染效率 当MOI为100时，流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的细胞的比例，腺病毒感染RPMI8226细胞效率为(83.1±6.4)%，符合基因治疗对载体的要求。
2.2 MTT试验检测细胞增殖 在MOI为100时，RPMI 8226细胞转染AdPTENGFP后第2～6天出现差异，7 d以后细胞荧光衰减，细胞生长抑制逐渐降低，第4天细胞生长抑制率最大，为42.01%，AdGFP与AdPTENGFP组OD 490值比较有统计学意义(P
【关键词】 中医药; 血管; 血管内皮细胞生长因子; 免疫组织化学; 毛囊; 小鼠
活血补肾合剂（Huoxue Bushen Mixture， HXBSM） 是龙华医院皮肤科经验方，临床治疗脱发取得了良好的疗效［1］。本实验观察活血补肾合剂对小鼠毛发生长、局部血管新生及毛囊中血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）表达的影响，旨在从微观结构和细胞因子水平对活血补肾合剂促进毛发生长作用的机制加以阐释。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 C57BL/6小鼠，普通级，8周龄，体质量（20±2）g，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物来源与制剂加工 活血补肾合剂由地黄30 g、丹参40 g、益母草20 g、玄参15 g、黄芪 40 g 、党参20 g、麦冬15 g、猪苓20 g、金钱草40 g、白花蛇舌草40 g共10味中药组成，由龙华医院制剂室制备（沪药制字z05170520），含生药4 g/ml。养血生发胶囊（熟地黄、当归、羌活、木瓜、制何首乌等）由广州敬修堂药业股份有限公司生产，批号030263。生理盐水，上海市富民制药厂生产。
1.2 造模、分组及药物处理
1.2.1 动物模型建立 参考文献［2］建立动物模型，将按1∶1的比例混合的松香和石蜡加热融化后涂于C57BL/6小鼠背部，凝固变硬后揭去，从而达到脱毛的效果。每只小鼠脱毛区域约为2 cm×2 cm。
1.2.2 动物分组及药物处理 按《药理与中药药理实验》［3］人鼠等效剂量换算方法计算各种药物的人鼠等效剂量。C57BL/6小鼠，共90只，随机分为 3组 ，每组30只。活血补肾合剂组，以生药 25 g/（kg·d） 剂量灌饲;养血生发胶囊（Yangxue Shengfa Capsule， YXSFC）组，以0.36 g/（kg·d）剂量灌饲; 模型组，生理盐水0.4 ml/d灌胃。以上 3组 每天灌服药物1次，从造模后第1天起，连续给药17 d。
1.3 检测指标与方法
1.3.1 肉眼观察 各组小鼠拔毛局部皮色变化及毛发生长情况。
1.3.2 光学显微镜下观察 分别于造模后第4、 11天 用断颈法每组随机处死10只小鼠，第17天用 同样方法处死各组剩余小鼠。在每只小鼠拔毛部位切取新鲜皮肤标本，固定于10%中性甲醛，经脱水，透明，渗蜡，包埋，连续切片，并进行HE染色，观察真皮浅层毛细血管数（条）。以200倍视野计数，每张切片数5个视野，计算平均值［4］。
1.3.3 检测VEGF表达 采用免疫组织化学法。
1.3.3.1 检测方法 免疫组化Envision二步法测定VEGF（VEGF抗体为Santa Cruz Biotechnology 公司产品，工作浓度1∶25～1∶50），与HE染色同步进行。
1.3.3.2 图像分析 采用Leica DMIRB倒置像差显微镜和 Leica Q 500 IW图像分析仪，选择200倍视野，每张免疫组化切片任选2个视野，分析视野中免疫组化切片染色阳性面积占整个视野面积的百分比。
1.4 统计学方法 实验数据用 x ± s 表示。采用SPSS for Windows软件包进行完全随机设计资料的两因素方差分析。
2 结果
2.1 各组小鼠拔毛局部毛发生长情况 各组小鼠在造模时皮肤均为粉红色;HXBSM组和YXSFC组在造模后第4～5天局部皮肤变黑，第8～9天出现新生毛发，第17天皮肤变灰;而模型组约在第 6天 皮肤变黑，第11天出现新生毛发，第17天皮肤变灰。其中皮肤变黑的时间头端早于尾端。
2.2 对小鼠皮肤局部血管新生的影响 因实验过程中有动物死亡，各组第4和11天均处死10只，第17天HXBSM组和YXSFC组均处死9只，模型组处死8只。同组小鼠不同时间拔毛局部真皮浅层毛细血管数相比，HXBSM组在造模后第11天和第17天时明显多于第4天（ P <0.05），模型组第 17天 时明显多于第4天和第11天（ P <0.05）;同一时间不同组别相比，第4天和第11天时HXBSM组新生血管数较模型组增加（ P <0.05），YXSFC组第11天时新生血管数较模型组增加（ P < 0.05 ）;而第11天时，HXBSM组明显多于YXSFC组（ P <0.05）;第17天时，3组小鼠局部毛细血管数目相比，差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1。
2.3 对小鼠皮肤局部毛囊中VEGF表达的影响 同组小鼠不同时间拔毛局部毛囊中VEGF的表达相比，HXBSM组和YXSFC组在造模后第11天高于第4天（ P <0.05），第17天高于第11天和第 4天 （ P <0.05）;模型组在第11天和第17天高于第4天（ P <0.05），而第11天和第17天相比，差异无统计学意义（P>0.05）。同一时间不同组别相 比，第4天时各组小鼠毛囊中VEGF的表达量差异无统计学意义（ P >0.05）;第11天和第17天时，HXBSM组VEGF的表达量高于YXSFC组和模型组（ P <0.05）;第17天YXSFC组VEGF的表达量高于模型组（ P <0.05）。见表1、图1。
表1 各组小鼠局部血管新生和皮肤局部毛囊中VEGF表达（略）
Table 1 Skin blood vessel neogenesis and expression of VEGF in hair follicle of mice in three groups
*P <0.05， vs day 4;P <0.05， vs day 11;P <0.05， vs untreated group;P <0.05， vs YXSFC group.
图1 第11天各组毛囊中VEGF的表达情况（略）
Figure 1 The eleventh day's VEGF expression of mice hair follicle in three groupsA: HXBSM group; B: YXSFC group; C: Untreated group.
3 讨论
临床上，我们发现脱发患者以青壮年居多。患者生活节奏快，心理压力大，造成劳伤心脾，或肝郁气滞，或暗耗肾精。由此导致了湿阻、血瘀或肾虚，气血不能上达头部，毛发失于精血的濡养而脱落。故治疗脱发应以“活血、利湿、补肾”为治则，而活血补肾合剂正是以这一原则组方。我们临床以该方治疗肾虚血瘀型脱发，为期3个月的临床观察显示，治疗组痊愈率和显效率分别为44%和36%，明显优于首乌片对照组的12%和28%（ P <0.05），并且对头痛失眠、腰酸乏力等肾虚血瘀的证候改善也明显优于首乌片对照组（ P <0.05）［5］。本实验所选的C57BL/6小鼠在6～8周饲养良 好的情况下，所有毛囊均由生长期进入休止期，且生理状态下不再自发进入生长期。经人工脱毛或拔毛等创伤刺激后可诱导其毛发进入生长期，并可自发经过退行期再进入休止期。这个周期活动与自然周期无明显差别［6］。该小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中，而且仅在生长期合成黑素并传递给角质形成细胞，使皮肤变成黑色，而退行期皮肤变成灰色，休止期皮肤变为粉红色，因此可根据皮肤颜色大致判断毛发周期与毛发生长情况［2］。本研究观察各组小鼠毛发生长情况，HXBSM组小鼠毛发进入生长期和长出的时间均早于模型组，而各组进入退行期的时间相当，表明活血补肾合剂可促进小鼠毛发进入生长期，并可促进毛发生长，但不能延长或缩短小鼠毛发固有的自然周期。Castex-Rizzi等［7］发现VEGF及其受体仅在生长期毛囊（主要在外毛根鞘、毛母质和毛）表达，进入退行期后逐渐降低，在休止期则基本消失，进一步证实VEGF对毛囊生长周期和毛发生长具有正相调节的重要作用。本研究结果则表明，活血补肾合剂可明显提高小鼠拔毛局部毛囊VEGF的表达。推测活血补肾是通过调节细胞因子水平，达到促进血管新生、促进毛发生长的作用。
【参考文献】
1Li YM， Song Y， Ma SY. Observation of curative effects of Huoxue Bushen Mixture on 317 patients with alopecia. Zhejiang Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2004; 14（7）: 440-441. Chinese. 李咏梅， 宋瑜， 马绍尧. 活血补肾合剂治疗脱发317例疗效观察. 浙江中西医结合杂志. 2004; 14（7）: 440-441.
2Slominski A， Paus R. Melanogenesis is coupled to mu-rine anagen: toward new concepts for the role of mela-nocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth. J Invest Dermatol. 1993; 101（1 Suppl）: 90s-97s.
3Zhang DF. Experiments of pharmacology and tradition-al Chinese medicine pharmacology. Shanghai: Shang-hai Scientific and Technical Publishers. 2002: 8-10.Chinese. 张大方. 药理与中药药理实验. 上海: 上海科学技术出版社. 2002: 8-10.
4Wang T， Song HY， Zhang WM. Hair growth effect of Zhituo Shengfa Tincture. Shanghai Shi Yan Dong Wu Ke Xue. 2004; 24（2）: 99-100， 108. Chinese. 王婷， 宋怀燕， 张文明. 止脱生发酊生发作用的实验研究. 上海实验动物科学. 2004; 24（2）: 99-100， 108.
5 Gao SP， Li YM， Gu MJ. Clinical observation of “Huoxue Bushen Mixture” in treating alopecia areata of kidney deficiency and blood stasis. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2005; 39（7）: 39-41. Chinese with ab-stract in English. 高尚璞， 李咏梅， 顾敏婕. 活血补肾合剂治疗肾虚血瘀型斑秃的临床观察. 上海中医药杂志. 2005; 39（7）: 39-41.
iNKT细胞(invariant nature killer T， iNKT)是T淋巴细胞中独特的亚群。它们表达恒定的TCRVα14与NK细胞的部分标识CD161(NK1.1)分子和NK细胞受体NKRP1C。iNKT细胞也被认为是经典的NKT细胞。iNKT细胞受体的恒定部分是TCRVα14链。小鼠的TCRVα链由Vα14Jα18部分组成， 人类的恒定区为TCRVα24Jα28链。这些部分与TCRVβ链有关， 限制着与TCRVβ的匹配。活化NKT细胞的经典抗原是糖脂类抗原αGalcer（αgalactosylcermide）， 由类似于MHCI的CD1d分子提呈。αGalcer是一种由海洋海绵体中提取的α半乳糖神经酰胺。αGalcer活化的iNKT细胞具有产生各种细胞因子的能力， 从而参与着各种各样的免疫调节。iNKT细胞既能控制和缓解部分疾病的进展， 如糖尿病、 肿瘤及器官移植的排斥; 又能扩大和促进一些疾病的发生和发展， 如红斑狼疮、 过敏性哮喘等。不同亚群或亚型的iNKT细胞具有不同的免疫调节功能。现集中讨论iNKT细胞的生物学进展和iNKT细胞在肿瘤和糖尿病中的调节机制。
1 iNKT细胞的生物学特征
2000年， NKT细胞(nature killer T cell)， 被认定为第4类的淋巴细胞［1］， 它们表达T细胞受体TCR又表达NK细胞的表面标志CD161(NK1.1)。近年的研究发现NKT细胞表达着一个恒定的TCRα链。在小鼠中， 恒定的TCRα链由TCRVα14Jα18组成; 在人类， 恒定的TCRα链指TCRVα24 Jα28部分。由于NKT细胞被限定与相应的TCRVβ匹配(小鼠为Vβ8.2、 Vβ7和Vβ2; 人类为Vβ11)， TCR缺少可变性。CD1d分子也是非多态性分子， 因此带有TCRVα14并由CD1d分子提呈抗原而活化的NKT细胞叫做恒定的NKT细胞(iNKT)。对小鼠而言， 带有恒定的TCRVα14受体的NKT细胞就是iNKT细胞， 也是经典的NKT细胞［2］。目前， 众多学者认为iNKT细胞应属于T淋巴细胞亚群， 是T细胞在特殊状态或者活化状态下特殊的表达方式。一部分人提出NKT细胞属于免疫系统中的固有细胞; 而另一部分学者认为在一个个体中， NKT细胞的存在确实受到遗传的控制， 其NKT细胞的数量也是稳定的。但是在不同个体的人群中， NKT细胞的数量差别很大， 能达到100倍以上。甚至在非正常的人群中也能发现同样多的NKT细胞［3］。在小鼠的组织中， iNKT的分布是有规律的。以TCRVα14+NKT细胞为例， 在外周血和淋巴结中， iNKT细胞占T淋巴细胞总数的0.5%， 肝脏中30%。在人类的组织分布中， iNKT细胞比小鼠少10倍之多。在牛中无NKT细胞的存在［4］。
人和小鼠的iNKT细胞都与脂多糖类的抗原（glycilipid）起反应。αGalcer被认为是最经典的活化iNKT细胞的抗原。这些抗原均由一个类似于MHCI类分子的CD1d分子提呈。它能很强地连接到iNKT细胞的TCR受体上， 而且半存活期很长［5］。 αGalcer的靶向只有iNKT细胞。在缺少CD1d的小鼠中， αGalcer几乎无活性［6］。iNKT细胞主要表达T细胞的TCRVα14/Jα18以及NK细胞表面标识CD161(NK1.1)和NKRP1C。而活化后的iNKT细胞则表达CD69+， CD62Llow， 以及CD44high［7］。由于iNKT细胞的活化以识别非多态性的CD1d分子提呈的糖脂类抗原为特征， 在很长的一段时间， 人们都认为能够活化NKT细胞的抗原仅限于αGalcer。随着研究的进展， 人们发现NKT细胞可能还有其他的抗原决定族（ligands）能够识别不同来源的脂类或者多肽类抗原而被活化。这些抗原大约分成二类: 一类是外来性糖脂类抗原， 包括由Leishmania原虫属或者格兰氏阴性菌分泌的磷脂或者多糖类如glycoinositol phosopholipids（GIPLS）、 Lipophosphoglycan(LPG)以及Sphingomanas分泌的glycosphingolipid(GSL)。另一类指合成的糖脂类抗原， 包括αGalcer和将αGalcer的splincosin链缩短的变异体OCH。外来性糖脂类抗原可以通过代谢细胞因子和细胞毒作用参与感染、 肿瘤、 移植和自身免疫病的免疫调节。而合成的糖脂类抗原通过调节Th2细胞分泌的细胞因子控制Th1型的自身免疫性疾病的进展［8］。
有学者指出iNKT细胞是自身反应性细胞， 它既具有保护性的免疫调节功能， 又具有损伤性调节功能。最新的研究已经证明了iNKT细胞由不同的细胞亚群或亚型组成， 不同的iNKT细胞亚群表现出不同的生物学功能。他们把TCRVα14+NKT细胞称为I型NKT细胞， 其中包括了两个不同的NKT细胞亚群， 即CD4+NKT细胞和CD4-CD8-NKT细胞。I型NKT细胞是CD1d限制性的NKT细胞， 能够介导保护性和调节性免疫功能， 如抗肿瘤、 抗感染、 器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的发展［9］。Ⅱ型NKT细胞也有部分受CD1d的限制， 但它们不表达TCRVα14， 也不识别αGalcer抗原。部分Ⅱ型NKT细胞有自身反应的能力， 而且抑制I型NKT细胞的抗肿瘤效应。事实上， 对于iNKT细胞的分型、 分群以及功能的获得是否与器官来源有关等问题都不十分清楚， 有待进一步研究。
2 iNKT细胞的抗肿瘤调节机制
由于iNKT细胞的受体部分是相对恒定的， 作为抗原的提呈分子又缺少多样性。iNKT细胞一旦识别了糖脂类抗原αGalcer而活化之后将产生高浓度的细胞因子， iNKT细胞参与多样的免疫调节是必然的。事实上αGalcer本身就是抗肿瘤制剂。αGalcer活化的NKT细胞在肺脏和肝脏中协同IL12对那些转移癌起重要杀伤作用。另一方面， 使用αGalcer之后， NKT细胞被活化。活化后的NKT细胞释放大量的IFNγ; IFNγ又活化了体内的NK细胞。由于调动了NK细胞的杀肿瘤效应， 进而达到了控制肿瘤的目的。αGalcer诱导抗肿瘤的细胞和分子机制还包括了上调CD40L和细胞毒性分子的表达。象图1显示的那样， NKT细胞表面的CD40L激活了DC细胞表面的CD40， 导致DC细胞产生IL12。DC细胞分泌的IL12又活化了NKT细胞。活化后的NKT细胞产生IFNγ。而IFNγ又能活化NK细胞和CD8+的细胞毒性细胞（CTL）， 从而介导了抗肿瘤作用。αGalcer活化的NKT细胞能趋化DC细胞成熟， 调动Th1细胞的正向免疫应答反应（图1）［10］。
图1 NKT细胞抗肿瘤的分子与细胞机制（略）
NKT细胞的另一个抗肿瘤机制可能来自肿瘤细胞自身。两个直接识别的理论解释了这种假设。第一个直接识别的理论认为， 由炎症部位(inflammatory situation)引起的癌可以诱导DC产生IL12， 加上癌细胞自身分泌的IL12， 两者都能充分的活化NKT细胞; 第二个直接识别理论提出， 癌细胞或者与癌细胞相关的组织表达特异性的糖脂类物质。这些糖脂类物质就像αGalcer抗原那样能活化NKT细胞。肿瘤患者体内的NKT细胞可能直接识别了癌细胞表面的糖脂类物质而被活化， 导致NKT细胞抗肿瘤效应的发生。
iNKT细胞参与抗肿瘤调节几乎是公认的事实。近期的研究也指出其他的细胞可能会干预NKT细胞的抗肿瘤作用， 包括Ⅱ型NKT细胞。已经知道用αGalcer加DC可以很好的控制肿瘤。若要把NKT细胞作为治疗肿瘤的新工具时， 必须综合考虑CD1d/NKT 细胞的整个系统。
3 iNKT细胞在I型糖尿病中的免疫调节作用
I型糖尿病是自身免疫性疾病。由于自身反应性淋巴细胞破坏了胰岛的β细胞， 使β细胞不能产生胰岛素而引起的。I型糖尿病的发生受基因突变和环境因素的影响。I型糖尿病的模型小鼠叫做NOD 鼠。这种小鼠很容易自发形成糖尿病。糖尿病类型与人类I型糖尿病（T1D）相似， 是用于研究自身免疫性糖尿病最好模型［11］。已经知道I型糖尿病主要由于T 淋巴细胞异常引起的， 但是不排除其他淋巴细胞， 如B细胞、 DC 细胞（树突状细胞）、 巨噬细胞以及NK 细胞的参与。NOD 小鼠通常在出生后的2周左右， β细胞就开始凋亡。DC 细胞携带着β细胞的表面抗原进入胰腺淋巴结， 将这些自身抗原提呈给具有自身反应性的T 淋巴细胞， 导致这些异常的T 细胞大量活化。在小鼠出生后的第3～4周， 自身反应性淋巴细胞开始侵袭胰岛细胞， 然后不断扩大。当90%的胰岛细胞被破坏后， 将不能分泌胰岛素， 导致血糖上升， 糖尿病形成。通常糖尿病形成的时间大约在第12周。到第25～30周时， 80%以上的雌性小鼠发病。糖尿病的发生率在雌雄小鼠间是不同的。雄鼠糖尿病的发生率仅占20%～30%， 远低于雌性小鼠。最新的研究报告参与糖尿病免疫调节的细胞可能还有调节性T 细胞， 包括CD4+T 细胞、 CD25+Treg。细胞（T 调节细胞）、 CD62L+CD4+T细胞以及CD1d限制的iNKT细胞［12］。以往的研究通过转基因和转细胞手段证明了iNKT细胞在糖尿病小鼠中的保护性调节作用。他们将CD4-CD8-/TcRVαβ+的胸腺细胞（CD1d限制的T 细胞）导入低龄NOD 小鼠。结果发现接受CD4-CD8-/TcRVαβ+T细胞的小鼠不发生糖尿病。随后建立了转基因小鼠。通过转基因手段， 增加NOD 小鼠体内iNKT细胞数量， 从而预防了糖尿病的发生［13］。由转基因获得的NKT 细胞， 无论是经典的iNKT细胞还是非经典的NKT 细胞都参与了自身反应性糖尿病的保护性调节。尽管导入NKT 细胞能够推迟NOD小鼠的发病时间或者降低发病率， 但是必须在胰岛细胞遭到侵害的早期实施才有效。 这暗示着NKT 细胞的作用可能不是消灭自身反应性T 细胞， 也不是直接终止已经活化的自身反应性T细胞的作用。它的作用可能是抑制自身反应性T 细胞的分化以及间接地通过FasL 、 perferin或者IL2、 IFNγ 等细胞因子的作用参与调节［14］。iNKT细胞的另一个作用机制可能是通过DC细胞途径。DC细胞能使T 细胞耐受。而CD1d限制的iNKT细胞能诱导耐受性DC细胞分化。如果活化的iNKT细胞诱导了大量耐受性DC 细胞增殖， 这种DC 细胞不能把β细胞抗原递呈给T 细胞。这就阻止了自身反应性T 淋巴细胞的活化， 间接地控制了自身免疫病的发生和发展。同样的道理， 作者用αGalcer抗原活化了NOD小鼠的iNKT细胞; 活化后的iNKT细胞诱导大量耐受性DC细胞生成并进入到胰腺淋巴结。一方面导致自身反应性T 细胞耐受; 另一方面， iNKT细胞通过直接杀伤作用或者抑制性调节作用控制糖尿病的发生或进展。胰腺淋巴结含有0.2%NKT 细胞， 而且胰腺血管内皮表面表达CD1d 分子。iNKT细胞能够进入胰腺。在NOD小鼠的胰腺侵润部位确实发现了iNKT细胞。当胰岛细胞完全受损， 糖尿病形成时， iNKT细胞的数量明显减少［15， 16］。
iNKT细胞存在于自然免疫和获得性免疫的中间状态。参与各种免疫应答反应。作为免疫治疗的新技术而言， iNKT细胞极具吸引力。人们已经有能力去合成一些糖脂类抗原人工活化NKT 细胞， 并试图使其成为一种新的治疗疑难病的手段［17］。到目前为止， iNKT细胞或者NKT 细胞的效应功能究竟是什么？在正常状态下iNKT细胞的数量究竟为多少？iNKT细胞是免疫系统固有的遗传性细胞群， 还是应激条件下一过性的选择性细胞群等等都有待进一步研究。
参考文献
［1］ Taniguchi M. A novel lymphocyteNKT［J］. JSI News Letter， 2000， 8(1): 15-16.
［2］ Barbara A， Sullivan， Mitchell K. Activation or anergy: NKT cells are stunned by αgalactosylcermide［J］. J Clini Inves， 2005， 115(9):2328-2329.
［3］ Albert B， Paul B.Savage and Luc Teyton The biology of NKT cells［J］. Annu Rev Immunol， 2007， 25(4): 297-336.
［4］ Van Rhijn I， Koets AP， Im JS， et al. The bovine CD1 family contains group 1 CD1 proteins but no functional CD1d［J］. J Immunol， 2006， 176(8): 4888-4893.
［5］ Sharif S， Arreaza GA， Zucker P， et al. Activation of natural killer T cells by alpha galactosylcermide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune type 1 diabetes［J］. Nat Med， 2001， 7（9）:1057-1062.
［6］ Hong S ， Wilson MT， Serizawa I， et al. The natural killer Tcell ligand alphagalactosylcermide prevents the autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice［J］. Nat Med， 2001， 7（9）: 1052-1056.
［7］ Hayakawa Y， Godfrey DI， Smyth MJ. Alphagalactosylcermide: potential immunomodulatory activity and future application［J］. Curr Med Chem， 2004， 11（2）: 241-252.
［8］ Mattner J， Debord LK， Ismail N， et al. Exogenous angendogenous glycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections［J］. Nature， 2005， 434（7032）: 525-529.
［9］ Seino K， Taniguchi M. Functionally distinct NKT cell subsets and subtypes［J］. JEM， 2005， 202(12): 1623-1626.
［10］ Kenichiro S， Shinichiro M， Takehiko F， et al. Natural killer T cellmediated antitumor immune responses and their clinical applications［J］. Cancer Sci， 2006， 97(9):807-812.
［11］ Hong J， Leonard C. An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation［J］. J Clini Inves， 2004， 114(9): 1198-1208.
［12］ Salomon B， Lendchow DJ， Rhee L， et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells the control autoimmune diabetes［J］. Immunity， 2000， 12（4）: 431-440.
［13］ Lehuen A， Lantz O， Beaudoin L， et al. Overexpression of natural killer cells protects Valpha14Jalpha281 transgenic nonobese diabetic mice against diabetes［J］. J Exp Med， 1998， 188（10）:1831-1839.
［14］ Poulton LD， Smyth MJ， Hawke CG， et al. Cytometric and functional analysis of NK and NKT cell deficiencies in NOD mice［J］. Int Immunol， 2001， 13(7):887-897.
［15］ Cardell SL. The natural killer T lymphocyte: a player in the complex regulation of autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice［J］. Clini Exp Immunology， 2006， 143（2）:194-202.
免疫学概论
一、免疫系统的基本功能
免疫(immunity)：是免疫系统抵御抗原异物的侵入，识别“自己”和“非己”的抗原，对“自己”的抗原形成天然免疫耐受，对“非己”抗原进行排除，维持机体内环境平衡和稳定的生理功能。
抗原的概念稍后会介绍，这里通俗的说，就是机体认为不是自己的，外界来的大分子物质。比如输血，如果输的血型与自身的血型不同，机体就认为这种血是外来的“抗原”
免疫系统包括：免疫器官、免疫细胞、免疫分子
机体的免疫功能概括为：①免疫防御
②免疫监视
③免疫自身稳定
免疫功能
正常生理功能
异常病理功能
免疫防御
清除病原微生物及其他抗原性异物
超敏反应(过度)．免疫缺陷病(不足)
免疫自身稳定
清除损伤或衰老的细胞
自身免疫性疾病
免疫监视
清除突变或畸变细胞
肿瘤发生，病毒持续感染
二、免疫应答的种类及其特点
免疫应答（immune
response）：是指免疫系统识别和清除抗原的整个过程。分为固有免疫和适应性免疫
⒈固有免疫（innate
immunity）：也称先天性免疫或非特异性免疫，是生物长期进化中逐步形成的，是机体抵御病原体入侵的第一道防线
特点：先天具有，无免疫记忆，无特异性。
⒉适应性免疫(adaptive
immunity)：亦称获得性免疫或特异性免疫。由T、B淋巴细胞介导，通过其表面的抗原受体特异性识别抗原后，T、B淋巴细胞活化、增殖并发挥免疫效应、清除抗原；须经历克隆增殖；
分为三个阶段：①识别阶段
②活化增殖阶段
③效应阶段
三个主要特点
①特异性
②耐受性
③记忆性
因需要细胞的活化、增殖等较复杂过程，故所需时间较长
第二章
免疫组织与器官
免疫系统（Immune
System）：由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成。
免
疫
系
统
免疫器官
中枢
胸腺
T细胞分化、发育、成熟的场所
骨髓
各种血细胞和免疫细胞发生及成熟的场所
外周
淋巴结
TB细胞定居，免疫应答，过滤作用
脾脏
粘膜相关
淋巴组织
⒈参与黏膜局部免疫应答
⒉（B细胞）产生分泌型IgA
免疫细胞
造血干细胞
产生红细胞及免疫细胞
淋巴细胞
细胞免疫和体液免疫
抗原提呈细胞
捕获、处理并递呈抗原
其他免疫细胞
免疫分子
抗体
补体
细胞因子
MHC分子、CD分子
第一节
中枢免疫器官和组织
中枢免疫器官，是免疫细胞发生、分化、发育和成熟的场所
一、骨髓
是各种血细胞和免疫细胞发生及成熟的场所
㈠骨髓的功能
⒈各类血细胞和免疫细胞发生的场所
⒉B细胞分化成熟的场所
⒊体液免疫应答发生的场所
再次体液免疫应答的主要部位
二、胸腺
是T细胞分化、发育、成熟的场所
㈠胸腺的结构
胸腺分为皮质和髓质。皮质又分为浅皮质区和深皮质区；
㈡胸腺微环境：由胸腺基质细胞、细胞外基质及局部活性物质（如激素、细胞因子等）组成，其在胸腺细胞分化发育过程的不同环节均发挥作用。
㈢胸腺的功能
⒈T细胞分化、成熟的场所
⒉免疫调节
⒊自身耐受的建立与维持
第二节
外周免疫器官和组织
外周免疫器官
是成熟淋巴细胞定居的场所，也是这些淋巴细胞针对外来抗原刺激启动初次免疫应答的主要部位
一、淋巴结
1.
T、B细胞定居的场所
⒉免疫应答发生的场所
⒊参与淋巴细胞再循环
⒋过滤作用（过滤淋巴液）
二、脾
人体最大的外周免疫器官
⒈T、B细胞定居的场所
⒉免疫应答发生的场所
⒊合成某些生物活性物质
⒋过滤作用（过滤血液）
三、粘膜相关淋巴组织（MALT）
主要指呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织，以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织
⒈参与黏膜局部免疫应答
⒉（B细胞）产生分泌型IgA
四、免疫细胞
免疫细胞（immunocyte）：是指所有参与免疫应答或与之有关的细胞。根据免疫细胞在免疫应答中的作用可概括为四类：
①淋巴细胞：包括T、B淋巴细胞，由于T、B细胞可以TCR、BCR特异识别抗原故也称抗原特异性淋巴细胞。其分别介导细胞免疫和体液免疫。
②抗原递呈细胞（APC细胞）：包括树突状细胞、巨噬细胞等。能捕获、处理并递呈抗原的细胞，在免疫应答过程中具有重要的递呈抗原肽及免疫调节作用。
③吞噬细胞：包括单核-巨噬细胞和中性粒细胞。具有吞噬和杀菌功能，在固有免疫中发挥重要作用。
④自然杀伤细胞:即NK细胞,可自发杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞，在固有免疫中发挥重要作用。
第三节
淋巴细胞归巢与再循环
成熟淋巴细胞离开中枢免疫器官后，经血液循环趋向性迁移，并定居于外周免疫器官或组织的特定区域，称淋巴细胞归巢。
淋巴细胞在血液、淋巴液、淋巴器官或组织间反复循环的过程称为淋巴细胞再循环
淋巴细胞再循环及其生物学意义
①使体内淋巴细胞在外周免疫器官和组织分布的更趋合理
②淋巴细胞可不断从循环池中得到新的淋巴细胞得到补充
③增加了抗原和APC接触的机会
④使机体所有免疫器官和组织联系成为一个有机整体，并将免疫信息传递给全身各处的淋巴细胞和其他免疫细胞
第三章
抗原（1）
抗原(Antigen,
Ag)：是指能与T细胞、B淋巴细胞的TCR（T
细胞受体）或BCR（B细胞受体）结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质
抗原有两个重要特性：免疫原性、抗原性
免疫原性：抗原刺激机体产生免疫应答，诱导产生抗体或效应淋巴细胞的能力
抗原性：即抗原与其所诱导产生的抗体或效应淋巴细胞特异性相结合的能力
半抗原/不完全抗原：仅具备抗原性而不具备免疫原性的物质。
TCR:
T
cell
receptor,T细胞受体；BCR就不用解释了吧，要记住哦，后面就这么叫了
第一节
抗原的异物性与特异性
一、异物性
异物即非“己”的物质。一般来说，抗原与机体之间的亲缘关系越远，组织结构差异越大，异物性越强，其免疫原性就越强。
①异物性不仅存在于不同种属之间；
②也存在于同种异体之间，如同种异体移植物是异物，也有免疫原性；
自身成份也可被机体视为异物。（如发生改变；在胚胎期未与免疫活性细胞充分接触。）
二、特异性
是指抗原刺激机体产生免疫应答及其与应答产物发生反应所显示的专一性，即某一特定抗原只能刺激机体产生特异性的抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该抗体或对该抗原应答的淋巴细胞有特异性结合。
1.抗原表位
决定抗原特异性的结构基础是存在于抗原分子中的抗原表位。抗原表位(epitope)、又称抗原决定簇（antigenic
determinant）
①抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团；
②它是与TCR/BCR及抗体特异性结合的基本结构单位
2.抗原表位的类型：
构象表位：前者指短肽或多糖残基在空间上形成的特定的构象，也称非线性表位
顺序表位：又称线性表位，由连续性线性排列的短肽构
抗原结合价(antigenic
valence):指一个抗原分子上能与相应抗体发生特异性结合的抗原决定簇的总数
T细胞抗原表位和B细胞抗原表位的概念及区别：
T细胞表位
B细胞表位
识别表位受体
TCR
BCR
MHC分子参与
必需
无需
表位性质
主要为线性短肽
天然多肽、多糖、脂多糖、有机化合物
表位类型
线性表位
构象表位或线性表位
表位位置
抗原分子任意部位
抗原分子表面
3.表位－载体效应(carrier
effect)
B
细胞应答产生抗体需要
Th
细胞的辅助。半抗原为简单分子，只能提供B细胞表位；载体则提供Th细胞识别的T细胞表位。
在免疫应答中，B细胞识别半抗原，并提呈载体表位给CD4+
T细胞，Th细胞识别载体表位，这样载体就可把特异T－B细胞连接起来（T-B桥联），T细胞才能激活B细胞。
4.共同抗原表位(common
epitope)
①某些抗原分子中常带有多种抗原表位，不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。
②某些抗原不仅可与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞反应，还可与其他抗原诱生的抗体或致敏淋巴细胞反应。
、
5.交叉反应(cross-reaction)：抗体或致敏淋巴细胞对具有相同和相似表位的不同抗原的反应。
第二节
影响抗原免疫应答的因素
一、抗原分子的理化性质
1.化学性质:：大分子有机物，如蛋白质、糖蛋白脂蛋白和多糖类、脂多糖等都有免疫原性。
2.分子量大小：分子量越大，含有抗原表位越多，结构越复杂，免疫原性越强。大于100kD的为强抗原，小于10kD的通常免疫原性较弱，甚至无免疫原性。
3.结构的复杂性
4.分子构象
(conformation):某些抗原分子在天然状态下可诱生特异性抗体，但抗原分子构象发生改变，可以影响其抗原特异性甚至免疫原性。此因素主要影响
B
细胞免疫。
5.易接近性(accessibility):
是指抗原表位能否被淋巴细胞抗原受体所接近的程度。
6.物理状态：一般聚合状态的蛋白质较其单体有更强的免疫原性；颗粒性抗原的免疫原性强于可溶性抗原。因此常将免疫原性弱的物质吸附在某些大颗粒表面，可增强其免疫原性。
二、宿主方面的因素：
①遗传因素
②年龄、性别与健康状态
三、抗原进入机体方式的影响：
①抗原剂量要适中，太低和太高则诱导免疫耐受；
②免疫途径：皮内免疫>皮下免疫>腹腔注射/静脉注射>口服易诱导耐受；
③注射间隔时间要适当，次数不要太频；
④要选择好免疫佐剂，弗氏佐剂主要诱导IgG类抗体产生，明矾佐剂易诱导IgE类抗体产生。
第三节
抗原的种类
一、根据诱生抗体时需否Th细胞参与分类
1.胸腺依赖性抗原（thymus dependent
antigen,
TD-Ag）：需在T细胞辅助才能激活B细胞产生Ab，由T细胞表位和B细胞表位组成。绝大多数Ag属此类。
2.胸腺非依赖性抗原（thymus
independent
antigen,TI-Ag）：需T细胞辅助或依赖程度较低即可刺激机体产生抗体，由多个重复的B表位组成。少数Ag属此类。如细菌多糖、聚合鞭毛蛋白等。
3.TD-Ag与TI-Ag的特性比较
胸腺依赖性抗原
胸腺非依赖性抗原
组成
B、T细胞表位
重复B细胞表位
T细胞辅助
必需
无需
免疫应答类型
体液、细胞免疫
体液免疫
抗体类型
多种
IgM
免疫记忆
有
无
化学组分
蛋白质
多糖
二、根据抗原与机体的亲缘关系分类
1.异嗜性抗原（heterophilic
antigen）（Forssman
抗原):为一类与种属无关，存在于人、动物及微生物之间的共同抗原。如：溶血性链球菌的表面成分与人肾小球基底膜及心肌组织。
2.异种抗原（xenogenic
antigen）：来自不同种属的抗原。
3.同种异型抗原（allogenic
antigen）：HLA；ABO系统和Rh系统等。
4.自身抗原（autoantigen）：在感染、外伤、服用某些药物等影响下，使免疫隔离部位的抗原释放，或改变和修饰了的自身组织细胞，可诱发对自身成分的免疫应答，这些可诱导特异性免疫应答的自身成分称为自身抗原,例如晶状体抗原等。
5.独特型抗原（idiotypic
antigen）：T细胞抗原识别受体（TCR）及BCR或Ig的V区所具有的独特的氨基酸顺序和空间构象，可诱导自体产生相应的特异性抗体，这些独特的氨基酸序列称为独特型（idiotype,
Id）抗原而成为自身免疫原，所诱生的抗体（即抗抗体，或称Ab1）称抗独特型抗体（AId）。
三、根据抗原是否在抗原提呈细胞内合成分类
1.内源性抗原(endogenous
antigen)：指在抗原提呈细胞内新合成的抗原。如病毒感染细胞合成的病毒蛋白、肿瘤细胞内合成的肿瘤抗原等。此类抗原在细胞内加工处理为抗原短肽，与MHC-Ⅰ类分子结合成复合物，被CD8+T细胞的TCR识别。
2.外源性抗原(exogenous
antigen)：指并非由抗原提呈细胞合成、来源于细胞外的抗原。抗原提呈细胞可通过胞噬、胞饮和受体介导的内吞等作用摄取外源性抗原，如吞噬的细胞或细菌等。在内吞体及溶酶体内，此类物质被酶解加工为抗原短肽后，与MHC-Ⅱ类分子结合为复合物，被CD4+T细胞的TCR识别。
第四节
非特异性免疫刺激剂
一、超抗原
普通蛋白质抗原可激活机体总T细胞库中万分之一至百万分之一的T细胞。
某些抗原物质，只需要极低浓度(1~10ng/ml)即可激活2％~20％T细胞克隆，产生极强的免疫应答，这类抗原称之为超抗原(superantigen,
SAg)。
SAg的作用特点：
①具有强激活T细胞作用
②不需APC处理
③可激活T细胞，又可致T细胞产生免疫耐受或抑制.
实际为多克隆激活剂，有内源性和外源性之分
二、佐剂
预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质，称为佐剂（adjuvant）。
分类：
①生物性：卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CP)、脂多糖(LPS)和细胞因子(如GM-CSF);
②无机化合物：氢氧化铝[Al(OH)3]；
③人工合成：双链多聚肌苷酸：胞苷酸(poly
I:C)和双链多聚腺苷酸：尿苷酸(poly
A:U)；矿物油；脂质体；免疫刺激复合物(ISCOMs)
；含CpG脱氧寡核苷酸
等。
弗氏完全佐剂(Freund's
complete
adjuvant,
FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund's
incomplete
adjuvant,
FIA)是目前动物试验中最常用的佐剂。
作用机制：
①改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长抗原在体内潴留时间；
②刺激单核－巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力；
③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力。
三、丝裂原（mitogen）
亦称有丝分裂原，因可致细胞发生有丝分裂而得名。由于其与淋巴细胞表面的相应配体结合，刺激静止淋巴细胞转化为淋巴母细胞和有丝分裂，激活某一类淋巴细胞的全部克隆，因而被认为是一种非特异性的淋巴细胞多克隆激活剂。
第四章
免疫球蛋白
抗体（antibody,Ab）是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的球蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性结合发挥体液免疫功能
免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白，有分泌型和膜型之分
分泌型主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能；
膜型构成B细胞膜上的抗原受体
第一节
免疫球蛋白的结构
一、免疫球蛋白的基本结构
㈠重链和轻链
⒈重链
分为五类或五个同种型
IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，相应重链为μδγαε链
⒉轻链
分为两型
κλ，相应轻链为κλ链
㈡可变区和恒定区
轻链和重链接近N端氨基酸序列变化较大的区域，为可变区，靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域，为恒定区
⒈可变区
VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区HVR
或互补决定区CDR
VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位，决定着抗体的特异性，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应
V区中，CDR之外区域的氨基酸和排列顺序相对不易变化，称为骨架区FR
⒉恒定区
同一种属的个体，针对不同抗原的同一类别的Ig，V区不同，C区恒定，免疫原性相同
针对不同抗原的人IgG，V区不同，C区相同
㈢铰链区
位于CH1和CH2之间，含有丰富的脯氨酸，易伸展弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个抗原表位
㈣结构域
Ig的两条重链和两条轻链都可折叠为数个球形结构域，每个结构域一般都具有其相应的功能
轻链：VL、CL
重链：VH、CH1、CH2、CH3
二、免疫球蛋白的其他成分
㈠J链
是一富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，主要功能是将单体Ig分子连接为二聚体或多聚体
IgA二聚体
IgM五聚体
IgG、D、E单体型，无J链
㈡分泌片
是分泌型IgA的辅助成分，由黏膜上皮细胞合成、分泌，并结合于IgA二聚体上，使其成为分泌型IgA，并一起被分泌到黏膜表面
功能：保护分泌型IgA铰链区免受蛋白水解酶降解的作用，并介导IgA二聚体从黏膜下转运到黏膜表面
三、免疫球蛋白的水解片段
㈠木瓜蛋白酶水解片段
水解IgG的部位：铰链区二硫键连接的二条重链的近N端2个Fab，1个Fc
Fab可结合抗原，不发生凝集、沉淀反应，Fc可形成结晶，是Ig与效应分子、细胞相互作用的部位
㈡胃蛋白酶水解片段
水解部位：铰链区二硫键所连接的两条重链的近C端1个F（ab’）2，小片段pFc’
1个F（ab’）2，可结合抗原，可发生凝集、沉淀反应，避免了Fc段抗原性可能引起的副作用
第二节
免疫球蛋白的异质性
一、免疫球蛋白的类型
㈠类
重链不同
㈡亚类
重链的抗原性及二硫键数目、位置不同
㈢型
轻链不同
㈣亚型
轻链C区N端AA不同
二、外源因素所致的异质性——Ig的多样性
含有多种不同抗原表位的抗原刺激机体免疫系统，导致免疫细胞的活化，产生多种不同特异性的抗体
三、内源因素所致的异质性——Ig的血清型
㈠同种型
种属型标志，存在于C区
㈡同种异型
个体型标志，存在于C区
㈢独特型
存在于V区，是每个Ig分子所特有的抗原特异性标志
第三节
免疫球蛋白的功能
一、可变区（IgV）功能
1.
识别并特异性结合抗原：特异性识别和结合抗原是Ig
的基本功能。
Ig结合抗原表位的个数称为抗原结合价，单体Ig
为双价，分泌型Ig
A为4价，五聚体IgM理论上为10价，但实际一般为5价。
2.
中和作用：抗体与细菌抗原或病毒结合后，具有中和毒素、阻断病原微生物入侵和清除病原微生物等免疫防御功能。
二、恒定区（IgC）功能
1.
激活补体
抗体（IgG1、IgG2、IgG3和IgM）与抗原结合后，可通过经典途径激活补体系统，产生多种效应功能；聚合的IgA、IgE和IgG4可通过旁路途径激活补体系统。
2.
结合Fc段受体
IgA、IgE和IgG的Fc段可与多种细胞表面的相应Fc受体结合，产生一系列生物学功能。
（1）
调理作用（opsonization）IgG的Fc段与巨噬细胞、中性粒细胞表面的IgG
Fc受体结合，促进吞噬细胞对抗原的吞噬。
（2）
抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent
cell-mediated
cytotoxicity,
ADCC）具有杀伤活性的细胞通过其表面表达的Fc受体识别包被于靶抗原（细菌或肿瘤细胞）上的抗体的Fc段，通过释放介质直接杀伤靶细胞。自然杀伤细胞（NK细胞）是介导的ADCC的主要细胞。
（3）
介导I型超敏反应：IgE的Fc段与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE
Fc受体结合，参与I型超敏反应的发生。
3.
穿过胎盘和黏膜
在人类，IgG是惟一能通过胎盘到达胎儿体内的免疫球蛋白，从而形成婴儿的天然免疫；IgA可通过呼吸道和消化道粘膜，是局部免疫的重要因素。
第四节
各类免疫球蛋白的特性与功能
一、IgG
重链为γ链，血清中以单体形式存在，占血清Ig总量的75～80%，半寿期20～23天。人IgG有4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，是再次免疫应答产生的、体内主要的抗感染抗体。能通过胎盘，可激活补体，通过Fc受体结合细胞发挥ADCC和调理作用。IgG与SPA结合的特性可用于抗体纯化及免疫诊断。
二、IgM
重链为μ链，血清中以五聚体形式存在，五个单体通过J链和二硫键联接而成，是分子量最大的Ig，故又称为巨球蛋白（macroglobulin）。IgM无铰链区。IgM占血清Ig的5～10%左右，半寿期10天。也是体内主要的抗感染抗体，感染早期首先出现的抗体是IgM，IgM激活补体的能力远远大于IgG。IgM也是B细胞表面抗原受体的主要成分。
三、IgA
重链为α链，血清中以单体形式存在，分泌液中以二聚体形式存在，称分泌型IgA（secretory
IgA,
SIgA）。SIgA由两个单体、一个J链和一个分泌片组成。血清中IgA占血清Ig总量的10～15%，半寿期为6天。SIgA可通过黏膜，主要存在于唾液、泪液、乳汁（尤其是初乳）及呼吸道、消化道、泌尿道的分泌液中和黏膜表面，在机体黏膜局部抗感染免疫中发挥重要作用。
四、IgE
重链为ε链，在血清中以单体形式存在。IgE无铰链区。血清中含量极微，半寿期2.5天。IgE与肥大细胞、嗜碱性粒细胞极易结合，主要参与I型超敏反应及抗某些寄生虫感染。
五、IgD
重链为δ链，分子形式为单体。IgD在血清中含量很低，半寿期3天。对IgD的生物学功能了解甚少，可能和某些超敏反应、自身免疫疾病有关，尚未证实IgD有抗感染作用。和IgM一样，IgD是B细胞表面抗原受体的成分，现认为IgD和B细胞的分化、成熟有关。
第五节
人工制备抗体
一个B细胞克隆识别其特异性抗原表位而被激活后，只产生一种特异性抗体。
1.
多克隆抗体（polyclonal
antibody）:天然抗原往往具有多种表位，刺激机体产生的抗体中包含针对多种不同抗原表位的Ig，系由多个B细胞克隆产生的抗体混合物，故称为多克隆抗体。多克隆抗体来源广泛但特异性不高。
2.
单克隆抗体（monoclonal
antibodies,
mAb）:由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体，称为单克隆抗体。mAb一般通过杂交瘤技术制备，具有结构高度均一、抗原结合部位和同种型相同、纯度高、特异性强和效价高等特点。
第五章
补体系统
第一节
补体概述
补体系统包括30余种成分，广泛存在于血清、组织液、细胞膜表面，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。血浆中补体成分在被激活前无生物学活性
㈠补体系统的组成
⒈补体固有成分
⒉补体调节蛋白
⒊补体受体
㈡补体的命名
经典、终末途径按其发现顺序命名；旁路途经成分分别称为BPHID因子
有酶活性的补体分子，均在其上以横线表示；裂解片段后缀以英文小写字母
㈢补体的生物合成
90%血浆补体成分由肝脏组成
第二节
补体激活
一、经典途径
1.
参与成分：包括C1（C1q、C1r、C1s）、C4、C2、C3。
2.
激活物
激活物为AgAb免疫复合物（IC），Ab为IgM
、IgG1、IgG2或IgG3。每个C1须同时与两个以上Ig
分子的Fc
段结合。
3.
活化过程
（1）抗原抗体结合后，抗体构型改变，暴露Fc
段中补体结合部位，C1q
可主动识别其补体结合位点，启动经典途径。当一分子C1q
中两个以上的球形头部与免疫复合物（IC）中IgM
或IgG
Fc
段结合后，C1q
的构象发生改变，C1r
活化，并激活C1s
的丝氨酸蛋白酶活性；
（2）C1s
依次裂解C4、C2，产生C4b+C4a
和C2a
+C2b，C2a
与C4b
结合成C4b2a
复合物（C3转化酶）；
（3）C3转化酶将C3裂解成C3b+C3a
，C3b
与C4b2a
结合形成C4b2a3b
复合物（C5转化酶）。
二、旁路途径
1.
参与成分：C3、B因子、D因子和P因子。
2.
激活物：某些细菌、内毒素、酵母多糖等以及凝集的IgA和IgG4等，上述物质实际上是为补体激活提供保护性环境和接触表面。
3.
活化过程：各种因素产生的C3b结合于激活物表面，再与B因子结合产生C3bB，在D因子作用下产生C3bBb（旁路C3转化酶）。C3bBb与多份C3b结合形成C3bBb3b（旁路C5转化酶），后者裂解C5，引起共同的末端效应。旁路途径可以识别自己与非己，具有放大效应。
三、MBL途径（甘露糖结合凝集素）激活途径
1.
参与成分：包括MBL、MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3。
2.
激活物：含N氨基半乳糖或甘露糖基的病原体。
3.
活化过程：MBL识别和结合细菌N氨基半乳糖或甘露糖基等糖结构后，通过构象改变激活与之相连的MASP。MASP-2具有类似活化的C1s的活性，可水解C4和C2，产生经典途径C3转化酶C4b2a，其后反应过程同经典途径。MASP-1直接裂解C3生成C3b，形成旁路途径C3转化酶C3bBb。
四、补体活化的共同终末过程
三条途径产生的C5转化酶，均可裂解C5，引发共同终末效应。
C5转化酶作用于C5，产生C5b和C5a，C5b结合在细胞表面，依次与C6、C7结合形成C5b67复合物，插入细胞膜中，再与C8结合形成C5b678，后者可牢固附着于细胞表面。
C5b678再与多分子C9结合
C5b6789n，即MAC（攻膜复合物），导致细胞崩解。
经典途径
旁路途径
MBL途径
激活物
IgG1-3或IgM与抗原
细菌内毒素、酵母多糖、形成的免疫复合物
凝聚的IgA、IgG4
MBL与病原体结合
起始分子
C1q
C3
C2、C4
C3转化酶
C4b2b
C3bBb
C4b2bC
C5转化酶
C4b2b3b
C3bnBb、C3bBb3b
C4b2b3b
作用
参与特异性体液免疫，在感染晚期发挥作用
参与非特异性免疫，在感染早期发挥作用
参与非特异性免疫，在感染早期发挥作用
第三节
补体系统的调节
①控制补体活化的启动
②补体活性片段发生自发性衰变
③血浆和细胞膜表面存在多种补体调节蛋白，通过控制级联酶促反应过程中酶活性和MAC组装等关键步骤而发挥调节作用
第四节
补体的生物学意义
一、补体的生物功能
⒈溶菌、溶解病毒和细胞的细胞毒作用
MAC溶解红细胞、血小板和有核细胞；参与宿主抗细菌、抗病毒防御机制
⒉调理作用
调节吞噬作用是机体抵御全身性细菌、真菌感染的主要机制之一
⒊免疫黏附
是机体清除循环免疫复合物的重要机制
⒋炎症介质作用
①C3a、C5a为过敏毒素，介导局部炎症反应
②C5a对中性粒细胞等有强趋化作用
二、补体的病理生理学意义
⒈机体抗感染防御的主要机制
⒉参与适应性免疫反应
⒊补体系统与血液中其他级联反应系统的相互作用
第六章
细胞因子
细胞因子:是有免疫原、丝裂原或其他因子刺激细胞所产生的低分子量可溶性蛋白质，为生物信息分子，具有调节固有免疫和适应性免疫应答，促进造血，以及刺激细胞活化、增殖和分化等功能
第一节
细胞因子的共同特点
①多为小分子多肽
②在较低浓度下既有生物学活性
③通过结合细胞表面高亲和力受体发挥生物学效应
④以自分泌、旁分泌或内分泌形式发挥作用
⑤具有多效性、重叠性、拮抗性或协同性
第二节
细胞因子的分类
1.白细胞介素：IL-2通过自分泌作用促进TC；IL-4为Th2型细胞因子；IL-6促炎因子；IL-12促进体细胞增殖分化
2.干扰素家族：最早发现，因具有干扰病毒的感染和复制的功能得名
3.肿瘤坏死因子超家族：能使肿瘤发生出血、坏死的细胞因子。分为TNF-α和淋巴毒素
4.集落刺激因子
指能刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血祖细胞增殖、分化的细胞因子有：GM-CSF，M-CSF，G-CSF，EPO，SCF，TPO
5.趋化因子家族
6.其他细胞因子
如TGF-β，VEGF，EGF，FGF
第三节
细胞因子的生物学活性
一、调节固有免疫应答
二、调节适应性免疫应答
⒈B细胞：IL4,5,6,13,肿瘤坏死因子超家族的BAFF等可促进B细胞的活化、增殖和分化为抗体产生细胞
⒉T细胞：IL-2,7,18等活化T细胞促进其增殖
Th1IL12，IFN-γ；Th2IL-4
三、刺激造血
骨髓和胸腺造血微环境中产生的细胞因子尤其是集落刺激因子对调控血细胞增殖分化有重要作用
四、促进凋亡，直接杀伤靶细胞
TNF-α，LT-α可直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞；活化T细胞表达的Fas配体结合靶细胞的Fas，诱导其凋亡
五、促进创伤的修复
TGF-β，VEGF，FGF，EGF
第四节
细胞因子受体
一、细胞因子受体的分类
1.免疫球蛋白超家族受体
2.Ⅰ类细胞因子受体家族
3.Ⅱ类细胞因子受体家族
4.肿瘤坏死因子受体超家族
5.趋化因子家族受体
二、可溶型细胞因子受体和细胞因子受体拮抗剂
许多细胞因子的受体除跨膜蛋白形式外，还存在着分泌游离的形式，即可溶性细胞因子受体。可作为细胞因子的运载体，也可与相应的膜受体竞争配体而起抑制作用。可溶性细胞因子受体与某些疾病发生有关。
第七章
白细胞分化抗原和黏附分子
第一节
人白细胞分化抗原
一、人白细胞分化抗原的概念
白细胞分化抗原:指造血干细胞在分化成熟为不同谱系、各个谱系分化不同阶段，以及成熟细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面分子。它们大多是穿膜的蛋白或糖蛋白，具有重要的生理功能。在免疫应答过程中，它们参与抗原的识别，细胞间相互作用，细胞的活化、增殖、分化和效应。
注意概念：虽然名字是白细胞分化抗原，但实际上包含所有血细胞的表面分子
CD
的概念：应用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，可将分化抗原归为分化群（cluster
of
differentiation
），简称为
CD。分化抗原以
CD加序号命名。
第二节
黏附分子
黏附分子：是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间互相接触和结合的分子的统称。
粘附分子以配体-
受体配对的方式发挥作用，导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-
基质-
细胞之间的粘附，并参与细胞间的识别、细胞的活化和信号转导、细胞的增殖与分化、细胞的伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移、创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。
一、分类
1.整合素家族：主要介导细胞与细胞外基质的粘附，以及白细胞与血管内皮细胞粘附。都是由αβ两条链经非共价键组成的异源二聚体
2.选择素家族：成员L-选择素、P-选择素、E-选择素，选择素识别的是一些寡糖集团，选择素在白细胞与内皮细胞黏附、炎症发生、淋巴细胞归巢中发挥重要作用。
二、黏附分子的功能
1.免疫细胞识别中的辅助受体和协同刺激或抑制信号
辅助受体和协同刺激信号
指免疫细胞在接受抗原刺激的同时，还必须有辅助受体提供辅助活化信号才能被激活
2.炎症过程中白细胞与血管内皮细胞黏附
3.淋巴细胞归巢
是淋巴细胞的定向迁移，包括淋巴细胞再循环和白细胞向炎症部位迁移
分子基础：淋巴细胞归巢受体（表达在淋巴细胞上的黏附分子），血管地址素（表达在内皮细胞上的黏附分子）
第八章
主要组织相容性复合体及其编码分子
主要组织相容性复合体(major
histocompatibility
complex,
MHC)是一组紧密连锁的基因群，其编码的产物称MHC分子，生物学功能是提呈抗原肽，调控免疫应答，在特异性免疫应答中起重要作用。人的MHC称为HLA基因（复合体），其产物称为
HLA分子或HLA抗原。
第一节
MHC结构及其多基因特性
MHC结构复杂，显示多基因性、多态性
多基因性：指复合体由多个紧密相邻的基因座位所组成，编码产物具有相同或相似的功能
多态性：指一个基因座位上存在多个等位基因
一、经典的MHCⅠⅡ类基因
经典HLAⅠ类基因集中在远离着丝点的一端，按序包括BCA三个座位
经典HLAⅡ类基因在复合体中靠近着丝点，结构复杂，顺序由DP、DQ、DR三个压区组成
二、ⅠⅡ类基因的表达产物——HLA分子
HLA抗原类别
分子结构
肽结合结构域
表达特点
组织分布
功能
HLA
I类（A,B,C）
α链45kD
Α1+α2
共显性
所有有核细胞表面
识别和提呈内源性抗原肽，与辅助受体CD8结合，对CTL的识别起限制作用
HLA
II类(DR,DQ,DP)
α链35kD\
β链28kD
Α1+β1
共显性
APC，活化的T细胞
识别和提呈外源性抗原肽，与辅助受体CD4结合，对Th的识别起限制作用
第二节
MHC的多态性
一、多态性的基本概念
多态性：指一个基因座位上存在多个等位基因，是一个群体概念，指群体中不同个体在等位基因拥有状态上存在差异
HLA等位基因及其产物结构上存在的差异亦即多态性，主要表现在构成抗原结合槽的氨基酸残基在组成和序列上不同
二、连锁不平衡和单体型
连锁不平衡：指分属两个或两个以上基因座位的等位基因，同时出现在一条染色体上的几率高于随机出现的频率
单体型：指染色体上MHC不同座位等位基因的特定组合
MHC多态性从基因的储备上，造就了不同个体对病原体的反应性和易感性不同。这一现象的群体效应，赋予物种极大的应变能力。
第三节
MHC分子和抗原肽的相互作用
MHCⅠⅡ类分子接纳抗原肽的结构，是位于该分子远膜端的抗原结合槽，Ⅰ类分子凹槽两端封闭
Ⅱ两端开放
一、抗原肽和HLA分子相互作用的分子基础
能与HLA结合的抗原都带有两个或两个以上与MHC分子凹槽相结合的特定部位，称为锚定位，该位置的氨基酸残基称为锚定残基
二、抗原肽和MHC分子相互作用的特点
①特定MHC分子可凭借所需要的共用基序选择性地结合抗原肽，有一定的专一性
②一种类型的MHC分子可以识别一群带有特定共同基序的肽段，由此构成包容性
第四节
MHC的生物学功能
一、提呈抗原、参与适应性免疫应答
（1）
提呈抗原供T
细胞识别，启动特异性免疫应答。MHCI
类分子提呈内源性抗原肽供CD8+T细胞识别；MHCII
类分子提呈外源性抗原肽供CD4+T细胞识别。
（2）
介导T
细胞在胸腺中的分化、成熟。
（3）
疾病易感性个体的主要决定者。
（4）
调控机体免疫功能
2．参与固有免疫应答
MHC免疫功能相关基因参与对非特异性免疫应答的调控
（1）
补体基因——参与补体反应和免疫性疾病的发生。
（2）
非经典Ⅰ类基因——调控NK细胞活性
（3）
炎症相关基因——调控炎症反应
第九章
B淋巴细胞
B细胞由哺乳动物骨髓或鸟类法氏囊中的淋巴样干细胞分化而来，成熟B细胞主要定居于外周淋巴器官的淋巴小结内，不仅能通过产生抗体发挥特异性体液功能，也是重要的抗原提呈细胞
第一节
B细胞的分化发育
骨髓中髓质基质细胞表达的细胞因子和黏附分子是诱导B细胞发育成熟的必要条件，在中枢免疫器官中分化发育中主要事件是：功能性BCR的表达、自身免疫耐受的形成
一、BCR的基因结构及其重排
BCR是表达于B细胞表面的免疫球蛋白，即膜型免疫球蛋白，B细胞通过BCR识别抗原，接受抗原刺激，启动体液免疫应答。
⒈BCR的胚系基因结构
人重链基因由编码可变区的V、D、J片段以及编码恒定区的C片段组成，轻链只有V、J
⒉BCR的基因重排及其机制
V区基因的重组是通过重组酶作用实现的，重链在先
Ig的胚系基因是以被分隔开的基因片段的形式成簇存在的，只有通过基因重排形成VDJ（重链）或VJ（轻链）连接后，再与C基因片段连接，才能编码完整的Ig多肽链，进一步加工，组装成有功能的BCR
⒊等位基因排斥和同种型排斥
等位基因排斥：B细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达，先重排成功的基因抑制了同源染色体上另一等位基因的重排
同种型排斥：κ轻链和λ轻链之间的排斥，κ轻链基因的表达成功即抑制λ轻链基因的表达
二、抗原识别受体多样性产生的机制
⒈组合造成的多样性
⒉连接造成的多样性
⒊体细胞高频突变造成的多样性
已成熟B细胞已完成V基因重排，而且发生在抗原刺激外周淋巴器官生发中心的B细胞，主要发生为点突变
三、B细胞在中枢免疫器官中的分化发育
第一阶段发生在骨髓：骨髓中的pro-B细胞重链V-D-J重排，即转化为pre-B细胞，进而发育为μ+的不成熟B细胞；进一步发育为μ+δ
+的成熟B细胞。B细胞分化的非抗原依赖期，进行阴性选择。
第二阶段发生在外周免疫器官：接受抗原刺激后，B细胞可发生类型转换，最终分化为浆细胞。B细胞分化的抗原依赖期，进行阳性选择。
在骨髓中发育的未成熟B细胞通过上述的克隆清除、受体编辑和失能等机制形成了对自身抗原的中枢免疫耐受。
骨髓中未发育成熟的B细胞，表面表达mIgM，此时的mIgM若与骨髓中的自身抗原结合，不仅不能活化B细胞，反而会导致该细胞凋亡，形成克隆清除；一些识别自身抗原的未成熟B细胞可以通过受体编辑，改变其BCR特异性
未成熟B细胞与自身抗原的结合在某些情况下可引起mIgM表达的下调，这类细胞虽然可以进入外周淋巴细胞，但对抗原刺激不产生应答，称为无能或失能
第二节
B细胞的表面分子及其作用
一、B细胞抗原受体复合物
由识别和结合抗原的mIg和传递抗原刺激信号的Igα/Igβ（CD79a/CD79b）异源二聚体组成
⒈mIg
是B细胞的特征性表面标志，单体形式存在，需要其他分子辅助完成BCR结合抗原后信号的传递
⒉Igα/Igβ
均是免疫球蛋白超家族的成员，胞质区有免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），通过募集下游信号分子，转导特异性抗原与BCR结合所产生的信号
二、B细胞共受体（辅助受体）
B细胞表面的CD19、21、81非共价相联，形成B细胞特异性的多分子活化共受体，提高B细胞对抗原刺激的敏感性
三、协同刺激分子
第二信号主要由Th细胞和B细胞表面的协同刺激分子间的相互作用产生
⒈CD40
属肿瘤坏死因子超家族，组成性地表达于成熟B细胞，其配体（CD154）表达于活化T细胞
⒉CD80、86
静息B细胞不表达或低表达，活化B细胞表达增强
⒊其他黏附分子
四、其他表面分子
CD20、22、32
第三节
B细胞的亚群
根据是否表达CD5分子，B细胞可分为CD5+B-1细胞和CD5-B-2细胞两个亚群
一、B-1细胞
定居于腹膜腔、胸膜腔、肠道固有层，合成低亲和力IgM能和多种不同的抗原表位结合，表现多反应性，属固有免疫细胞，可自发分泌天然抗体
二、B-2细胞
主要定居于淋巴器官，参与体液免疫的主要细胞
性质
B-1细胞
B-2细胞
CD5分子表达
+
-
更新的方式
自我更新
由骨髓产生
自发性Ig的产生
高
低
针对的抗原
碳水化合物类
蛋白质类
分泌的Ig类别
IgM>>IgG
IgG>IgM
特异性
多反应性
单特异性
体细胞高频突变
低/无
高
免疫记忆
少/无
有
第四节
B细胞的功能
一、产生抗体介导体液免疫应答
⒈中和作用
某些针对病原体的抗体，可阻断病原体与靶细胞的结合，抗体的这种作用称为中和作用
⒉调理作用
抗体与病原体表面结合，其Fc段又可与吞噬细胞表面的Fc受体结合，将病原体带至吞噬细胞处，使之易被吞噬，抗体的这种作用称为调理作用
⒊参与补体的溶细胞或溶菌作用
⒋ADCC
二、提呈可溶性抗原
B
细胞可藉BCR
结合可溶性抗原，对其加工、处理后，以抗原肽－MHC分子复合物的形式提呈给T
细胞。
第十章
T淋巴细胞
第一节
T细胞的分化发育
一、T细胞在胸腺中的发育
场所：胸腺
由胸腺基质细胞、细胞外基质和细胞因子组成的胸腺微环境是T细胞发育分化的必要条件
根据CD3以及辅助受体CD4、8的表达，胸腺中的T细胞可分为双阴性(DN)、双阳性(DP)、单阳(SP)性三个阶段
最核心事件：获得功能性TCR的表达、自身MHC限制、自身免疫耐受的形成
⒈TCR的发育
基因重排同B细胞
⒉T细胞发育过程中的阳性选择
部位：
胸腺皮质，主要由胸腺上皮细胞发挥选择作用。
在胸腺皮质中，CD4
CD8+双阳性T细胞，其TCR
能与胸腺基质细胞表面的MHCⅠ/
Ⅱ类分子-
抗原肽结合，且具适当亲和力的DP细胞分化为单阳性（SP）T细胞，其中与Ⅰ类分子结合的DP细胞分化为CD8+T细胞（SP）；与Ⅱ类分子结合的DP细胞分化为CD4+T细胞（SP）；而不能与
MHC-抗原肽结合或亲和力过高的DP细胞则发生凋亡遭克隆清除。此过程也称为胸腺的阳性选择。
意义：阳性选择淘汰了不能与自身MHC分子结合的T细胞，使继续发育的SP细胞的TCR只能与自身MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ类分子结合，这就使T细胞获得了自身MHC限制性。
⒊T细胞发育过程中的阴性选择
部位：胸腺皮髓交界处、髓质，
经历阳性选择的SP
细胞在胸腺的皮髓质交界处及髓质区还须经历阴性选择：凡是能识别自身抗原-MHC
复合物、且具有高亲和力的
SP细胞发生凋亡遭克隆清除，其实质是清除自身反应性
T
细胞，即阴性选择。
意义：阴性选择淘汰了识别自身抗原的T细胞，使继续发育的T细胞获得了自身抗原的耐受性。具有两种性能的成熟T细胞离开胸腺，进入血液并移居到外周淋巴组织。
第二节
T细胞的表面分子及其作用
一、TCR-CD3复合物
TCR为T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3分子结合，形成TCR-CD3复合物
⒈TCR的结构和功能
TCR只能特异性识别抗原提呈细胞或靶细胞表面的抗原肽-MHC分子复合物（pMHC），且识别有双重特异性，即既要识别抗原肽的表位，又要识别自身MHC分子的多态性部分
TCR分为TCRαβ、TCRγδ两类
⒉CD3分子的结构和功能
CD3有五种肽链γδεζη
CD3分子的功能是：转导TCR识别抗原所产生的活化（第一）信号。
二、CD4分子和CD8分子（T细胞的辅助受体）
功能：1、辅助TCR识别抗原2、参与T细胞活化（第一）信号的转导。
CD4-与MHCⅡ类分子β链的β2结构域结合；CD8-与MHCⅠ类分子重链的α3结构域结合
三、协同刺激分子
位于T细胞膜上的各种膜分子，通过与APC或靶细胞上的配基结合，提供T细胞活化的第二信号
第一信号由TCR识别抗原产生，经CD3分子将信号转导至细胞内，作用是使T细胞克隆被抗原活化后产生的适应性免疫应答具有严格的特异性
⒈CD28
是协同刺激分子B7的受体。B7分子包括B7-1（CD80）和B7-2（CD86），主要表达于专职APC。CD28分子与B7分子结合产生的协同刺激信号在T细胞活化中发挥重要作用，诱导T细胞表达抗细胞凋亡蛋白，刺激T细胞合成IL-2及其他细胞因子，并促进T细胞的增殖和分化。
⒉CTLA-4（CD152）
表达于已活化的T细胞上，
CTLA4
-CD80/86结合，使已活化T细胞产生抑制信号。CTLA-4分子的胞浆区有I/VxYxxL基序（免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM）。可抑制T细胞活化信号的转导。
⒊ICOS
⒋PD-1
⒎LFA-1和ICAM-1
⒌CD2又称绵羊红细胞受体
人的CD2分子表达在95％成熟T细胞、50-70%胸腺细胞以及部分NK细胞
⒍CD40配体
主要表达于活化的CD4+T细胞，其受体CD40表达于专职APC(B细胞，巨噬细胞、树突状细胞)
第三节
T细胞的亚群
一、T
细胞按表面标志，功能不同分为不同亚群。
1．
初始T
细胞：未经抗原刺激的成熟T
细胞，表达CD45RA
和CD62L。
2．
效应T
细胞：表达高亲和力IL-2R
，CD44和CD45RO
，介导免疫效应。
3．
记忆T
细胞：表达CD45RO
，CD44，介导再次免疫应答。
二、αβT
细胞和γδ
T
细胞
1．
γδ
T
细胞：γδ
T
细胞占T
细胞总数的5%以下，大多为CD4-CD8-，主要分布于皮肤，黏膜。γδ
T
细胞识别CD1
分子提呈的脂类或糖脂抗原，在抗微生物感染中起重要作用。
2．
αβT
细胞：αβT
细胞占T
细胞总数95%
以上，识别由MHC分子提呈的蛋白质抗原，具有MHC限制性，是介导细胞免疫及免疫调节的主要细胞。
三、CD4+T细胞和CD8+T细胞
CD4
+T细胞识别由MHCⅡ类分子提呈的外源性抗原肽，活化后分化为Th细胞
CD8
T细胞识别由MHCⅠ类分子提呈的内源性抗原肽，活化后分化的效应细胞为Tc
（CTL
）细胞，可特异性杀伤靶细胞，是细胞免疫的主要效应细胞。
四、Th、CTL、Treg细胞
1.Th细胞
初始CD4+T细胞可分化为Th1、2、17三类，前两者在细胞、体液免疫应答中发挥重要作用，后者通过分泌IL-17参与固有免疫和某些炎症的发生
2.CTL（Tc）细胞
通常指表达TCR
ab
CD8+CTL细胞，根据分泌的细胞因子的不同进一步分为Tc1、2
3.调节性T细胞（Treg）
（1）自然调节性T细胞nTreg
直接从胸腺中分化而来，表型为CD4+CD25+Foxp3+
（2）适应性调节性T细胞，又称诱导性调节性T细胞（iTreg），一般在外周由抗原及其他因素诱导产生，主要来自初始CD4+T细胞，有Tr1和Th3两种亚群
（3）其他调节性T细胞
第十一章
抗原提呈细胞与抗原的处理及提呈
第一节
抗原提呈细胞的种类与特点
抗原提呈细胞(antigen-presenting
cells
，APC):能够摄取、处理（加工）抗原并将抗原信息提呈给
T
淋巴细胞的一类细胞称为抗原提呈细胞。通常所说的
APC
，指树突状细胞(DC)、单核-
巨噬细胞(Mo/
Mφ)
和B
淋巴细胞。
专职APC：DC、B细胞、巨噬细胞
一、树突状细胞（Dendritic
cell,
DC）
能够显著刺激初始TC增殖，是机体适应性TC免疫应答的始动者，是连接固有、适应性免疫的桥梁
㈠类型与特点
⒈根据来源的分类
髓系DC、淋巴系DC，前者为经典、常规意义上的DC，主要参与免疫应答的诱导和启动；后者指浆细胞样DC，活化后释放I型干扰素，参与抗病毒免疫应答，也可参与自身免疫性疾病的发生发展
⒉根据分化成熟状态的分类
未成熟
DC
：大多数髓系DC离开骨髓后以未成熟状态存在，具有强的抗原摄取、加工处理能力，但表面
MHC
Ⅱ类分子、共刺激分子和黏附分子的表达水平低，故提呈抗原刺激初始T
细胞能力很低。
成熟
DC：
DC
摄取抗原和受某些刺激后逐渐成熟，并向引流淋巴组织迁移。成熟过程中，MHC分子（特别是Ⅱ类分子）、共刺激分子和黏附分子表达显著提高，能够提呈抗原刺激初始T
细胞。
⒊根据组织分布的分类
①淋巴样组织中的DC
并指状
滤泡样DC（FDC
）:位于淋巴滤泡内，不表达MHC
Ⅱ类分子，主要作用是携带抗原抗体补体复合物供B
细胞识别。
②非淋巴样组织中的DC
间质性DC
朗格汉斯细胞（LC）:分布于表皮和黏膜上皮部位，具有强的抗原摄取和处理能力
③体液中的DC
存在于输入淋巴管和淋巴液中的隐蔽细胞和血液DC
㈡功能
⒈抗原提呈与免疫激活功能
⒉免疫调节作用
⒊免疫耐受的维持与诱导
二、单核巨噬细胞
单核细胞来源于骨髓前体细胞，经血液移行至全身组织，分化成巨噬细胞。参与免疫防御和炎症反应。正常情况下多数表达MHC-I
分子，也有MHC-II分子和协同刺激分子水平较低。抗原加工能力强，提呈能力弱。在IFN-γ等作用下，发挥专职APC的作用。
三、B淋巴细胞
能将蛋白抗原提呈给辅助性T细胞。
可通过膜表面Ig将低浓度的抗原浓集并使抗原内化，发挥提呈作用。
第二节
抗原的处理和提呈
APC将胞质内自身产生的或者摄取入细胞的抗原分子降解并加工处理成一定大小的多肽片段，使之与MHC分子结合，以抗原肽-MHC复合物的形式表达于APC表面，此过程统称为抗原加工或处理
在APC与T细胞接触的过程中，表达于APC表面的抗原肽-MHC复合物被T细胞识别，从而将抗原信息提呈给T细胞，此过程称为抗原提呈，是指APC表面的抗原肽与MHC分子结合的复合物与T细胞表面的TCR结合为TCR-抗原肽-MHC三元体，从而活化T细胞的全过程，CD4、CD8也发挥重要作用
根据来源不同，将抗原分为两类：外源性抗原、内源性抗原，前者来源于APC之外，后者在靶细胞内合成
根据抗原的性质和来源不同，APC通过四种途径进行抗原的加工、处理、提呈：
MHCⅠ类分子途径（内源性抗原提呈途径）
MHCⅡ类分子途径（外源性抗原提呈途径）
非经典的抗原提呈途径（MHC分子对抗原的交叉提呈）
脂类抗原的CD1分子提呈途径
㈠MHCⅠ类分子途径
内源性蛋白抗原被蛋白酶体降解与抗原加工相关转运体（TAP）结合，并由TAP选择性地将抗原肽转运至ER与ER内组装的MHCⅠ类分子结合形成抗原肽-MHCⅠ类分子复合物经高尔基体转运至细胞膜CD8+T细胞识别完成抗原提呈过程
㈡MHCⅡ类分子途径
外源性抗原被APC识别摄取胞内形成内体内体转运至溶酶体或与溶酶体融合抗原随后被降解为多肽而转运至MⅡC中（MHCⅡ类分子在ER中合成并与Ii链结合形成复合物经高尔基体转运至MⅡC）Ii链被降解而将CLIP残留于MHCⅡ类分子的抗原多肽结合槽中在HLA-DM的作用下抗原结合多肽结合槽的CLIP被待提呈的抗原肽所置换，形成稳定的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物转运到APC膜表面将抗原肽提呈给CD4+T细胞
MHCⅠ类分子途径
MHCⅡ类分子途径
抗原来源
内源性抗原
外源性抗原
抗原降解的胞内位置
胞质蛋白酶体
内体、溶酶体
抗原与MHC分子结合部位
内质网
溶酶体及内体中MⅡC
提呈抗原多肽的MHC分子
MHCⅠ类分子
MHCⅡ类分子
伴侣分子
TAP、钙联素
Ii链、钙联素
处理和提呈抗原的细胞
所有有核细胞
专职性抗原提呈细胞
识别和应答细胞
CD8+T细胞（主要是CTL）
CD4+T细胞（主要是Th）
㈢非经典的抗原提呈途径（MHC分子对抗原的交叉提呈）
又称交叉致敏，指抗原提呈细胞能将外源性抗原摄取、加工、处理，并通过MHCⅠ类分子途径提呈给CD8+T细胞（CTL）
㈣脂类抗原的CD1分子提呈途径
脂类抗原可与表达于抗原提呈细胞表面的CD1分子结合而被提呈，主要通过CD1分子地再循环过程，没有明显的抗原的加工处理
第十二章
T淋巴细胞介导的细胞免疫应答
点击:283次
|
回复:0次
|
时间:2012-11-09
22:03:43
三个阶段：①T细胞特异性识别抗原阶段②T细胞活化、增殖、分化阶段③效应T细胞的产生及效应阶段
第一节
T细胞对抗原的识别
抗原识别：初始T细胞膜表面抗原识别的受体TCR与APC表面的抗原肽-MHC分子复合物特异结合的过程称抗原识别
MHC限制性：TCR在特异性识别APC所提呈的抗原多肽的过程中，必须同时识别与抗原多肽形成复合物的MHC分子，这种特性成为MHC限制性
一、APC向T细胞提呈抗原的过程
（蛋白质抗原）
外源性：APC/MHCⅡ类分子CD4+Th细胞
内源性：APC/靶细胞/MHCⅠ类分子CD8+T细胞（CTL）
二、APC与T细胞的相互作用
淋巴结副皮质区
1.T
细胞与APC
非特异结合
T
细胞上的LFA-1
和CD2
分别与APC
表面的ICAM-1
、LFA-3
结合，使得TCR
与MHC-肽接近。如TCR
不能识别MHC-肽，T
细胞与APC
分离。
2.T
细胞与APC
特异性结合
如TCR
能识别MHC－肽，则两个细胞发生特异性结合，细胞膜形成免疫突触，增强TCR
与MHC-肽结合的亲和力，促进T
细胞信号转导分子的相互作用，信号通路的激活，促进T
细胞活化。
双识别：识别自身的MHC分子，特异识别抗原
第二节
T细胞的活化、增殖和分化
一、T细胞活化涉及的分子
细胞因子促进T细胞充分活化
1.第一信号
来自其TCR与pMHC的特异性结合，即T细胞对抗原的识别
2.第二信号
来自协同刺激分子，即APC表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号
二、T细胞活化的信号转导途径
PLC-γ活化途径；MAP激酶活化途径
TCR
胞内部分较短，要借助CD3、CD4/8、CD28等分子将刺激信号传到细胞内部，致转录因子活化，转位到核内，活化相关基因。这一过程称为信号转导
1、受体交联
抗原-抗原受体结合，使TCR的构像及位置发生改变，CD3、CD4/CD8分子的尾部聚集在一起，即发生受体交联，激活胞内的信号蛋白和酶。
2、PTK活化
受体交联首先激活膜上的蛋白酪氨酸激酶（PTK），如：Fyn（P59）--CD3
的ζ
链Lck（
P56）--CD4/CD8，PTK
活化促使带有酪氨酸的ITAM蛋白发生磷酸化而活化，胞浆中的ZAP-70的SH2附着于ITAM而活化
三、T细胞活化信号涉及的靶基因
IL-2基因的转录调节可作为T细胞活化期间细胞因子转录调节的重要代表
编码T细胞效应分子基因包括细胞因子基因、细胞因子受体基因、黏附分子基因、MHC等
四、抗原特异性T细胞克隆性增殖和分化
IL-2是促进活化后T细胞增殖的最重要的细胞因子：IL-2R表达：
静止T细胞：中等亲和力受体，
βγ
活化T细胞：高亲和力受体，αβγ
IL-2选择性地促进经抗原活化的T细胞增殖。
第三节
T细胞的效应功能
一、Th细胞的效应功能
1．Th细胞的效应
（1）
Th1
细胞的生物学活性：
1)
通过分泌细胞因子和表达CD40L
诱生、募集和激活Mφ，消灭胞内寄生菌；诱导Mφ高表达
B7和MHCⅡ类分子，促进抗原的加工和提呈。
2)
促进
CTL
活化增殖。也促进Th细胞和
NK细胞的活化增殖，辅助B
细胞产生调理性抗体
3)
活化中性粒细胞，促进杀伤病原体。
（2）
Th2
细胞的生物学活性：
1)
辅助体液免疫应答
促进B
细胞活化、增殖和分化为浆细胞，产生抗体。
2)
参与I型超敏反应和抗寄生虫免疫。
（3）
Th17细胞的生物学活性：
分泌
IL-17，刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞分泌多种细胞因子等，促进固有免疫，参与炎症反应、感染性疾病和自身免疫病的发生。
二、CTL细胞的效应功能
主要杀伤胞内寄生病原体的宿主细胞、肿瘤细胞等，可高效、特异性杀伤靶细胞，而并不损伤正常组织。杀靶机制：
⒈效-靶细胞结合
⒉CTL的极化
⒊致死性攻击
主要两种途径杀伤靶细胞⑴穿孔素/颗粒酶途径⑵Fas/FasL途径
三、记忆性T细胞
T
细胞增殖后一部分分化成记忆细胞，其表型为CD45RO+，有较长的寿命。记忆细胞对特异性抗原有记忆能力，再次遇到
抗原后能迅速活化、增殖、分化为效应细胞，产生更迅速、更强、更有效的应答。
第十三章
B淋巴细胞介导的体液免疫应答
外来抗原进入机体后诱导抗原特异性B细胞活化、增殖，并最终分化为浆细胞，产生特异性抗体，存在于体液中，发挥重要的免疫效应作用，此过程称为特异性体液免疫应答
第一节
B细胞对TD抗原的免疫应答
一、B细胞对TD抗原的识别特点
①不仅能识别蛋白质抗原，还能识别多肽、核酸、多糖类、脂类、小分子化合物②可特异性识别完整抗原的天然构象或识别抗原降解所暴露的表位的空间构象③识别抗原无需经APC的加工处理，无MHC限制性
二、B细胞活化需要的信号
（1）第一信号
1.第一活化信号经由Ig/αIgβ传导入胞内
BCR被多价抗原交联后，ITAM模体中酪氨酸磷酸化，募集并活化Syk，活化细胞内信号转导的级联反应，经PKC、MAPK、钙调蛋白三条途径激活转录因子，参与并调控B细胞激活、增殖相互基因的表达
2.B细胞活化中共受体的作用
成熟B细胞表面，CD19、21、81非共价键结合成共受体复合物，提高敏感性
（2）第二信号
主要由黏附分子对的相互作用所提供，最重要的是CD40/CD40L
（3）TB细胞相互作用与B细胞免疫应答
一方面，B细胞可作为抗原提呈细胞活化T细胞，另一方面活化的T细胞可以提供B细胞活化的第二信号，并分泌多种IL-4等细胞因子协助B细胞的进一步分化
三、B细胞增殖和终末分化
需Th细胞的辅助，发生于外周淋巴器官的T细胞区和生发中心
四、B细胞在生发中心的分化成熟
在外周淋巴器官的T细胞区激活的部分B细胞进入初级淋巴小结，分裂增殖，形成生发中心，分裂增殖的B细胞称为生发中心母细胞，母细胞分裂增殖产生的子代细胞体积小，称为生发中心细胞
生发中心分为两个区域：明区、暗区，前者FDC（滤泡树突状细胞）较多，后者生发中心母细胞紧密聚集
DC的树突表面高表达CD21分子，抗原-抗体复合物通过C3d与CD21分子结合，附着在FDC树突上，或结合于FDC树突上的Fc受体，聚集在一起，呈串珠状，称串珠样小体
生发中心四个事件
（1）体细胞高频突变和Ig亲和力成熟 生发中心母C的轻链和重链V基因，可发生高频率的点突变，称体细胞高频突变
（2）Ig的类别转换
可变区相同而Ig类别变化的过程称Ig的类别转换，或称同种型转换，
遗传学基础是同一V区基因与不同重链C基因的重排
（3）浆细胞的形成 浆细胞是B细胞分化的终末细胞，除了少量线粒体，内含大量粗面内质网，分泌抗体，BCR表达少
（4）记忆B细胞的产生
特异性表面标志：CD27，不产生抗体，再次遇同一抗原可迅速活化大量产生特异Ig
第二节
B细胞对TI抗原的免疫应答
某些抗原，如细菌多糖、多聚蛋白质及脂多糖等属TI抗原，能激活初始B细胞而无需Th细胞的辅助
㈠B细胞对TI-1抗原发生的应答
TI-1抗原又称B细胞丝裂原，成熟或不成熟的B细胞均可被TI-1抗原激活，诱导产生低亲和力的IgM，无记忆性
㈡B细胞对TI-2抗原发生的应答
TI-2仅能激活成熟B细胞，主要是B-1细胞
TI-2抗原通过高度重复的抗原表位使B细胞的mIg广泛交联而被激活，（但过度交联使成熟B细胞产生耐受）可直接激活B-1细胞，T细胞分泌的细胞因子可明显增强此类B细胞的免疫应答，并发生抗体类型转换，可产生IgM
IgG
第三节
体液免疫应答抗体产生的一般规律
特定抗原初次刺激机体所引发的应答称为初次应答；初次应答中形成的记忆淋巴细胞再次接触相同抗原刺激后，可迅速、高效、持久的应答，即再次应答或回忆应答
㈠初次应答
特点为潜伏期长，抗体水平低，亲和力低，抗体升高所需时间长，抗体主要为IgM
㈡再次应答
①潜伏期短②抗体浓度增加快③抗体维持时间长④诱发再次应答所需抗原剂量小⑤再次应答产生高亲和力抗体IgG
再次应答的强弱取决于两次抗原刺激的间隔长短，过长或过短反应均弱
第十四章
固有免疫系统及其应答
固有免疫，亦称非特异性免疫，是长期进化形成的防御机制，包括屏障结构、固有免疫细胞、体液中的抗菌物质
第一节
组织屏障及其作用
一、皮肤黏膜及其附属成分的屏障作用
⒈物理屏障
⒉化学屏障
⒊微生物屏障
二、体内屏障
⒈血-脑屏障
⒉血-胎屏障
第二节
固有免疫细胞
主要包括吞噬细胞（中性粒细胞和单个核吞噬细胞）、树突状细胞、NK细胞、NK T细胞、γδT细胞、B1细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。
一、吞噬细胞
1.中性粒细胞
有很强的趋化作用、吞噬功能，病原体在局部引发感染时，可迅速穿越血管内皮进入感染部位进行杀伤
2.单核吞噬细胞
包括血液中的单核细胞和组织器官中的巨噬细胞，可做变形运动，对玻璃和塑料表面有很强黏附能力，借此在体外培养时可与淋巴细胞分离
巨噬细胞特点
①寿命长，可在组织中生存数月
②形态大，呈多样性
③表达MHCⅠ或Ⅱ类分子
④对玻璃塑料可吸附
3.巨噬细胞表面受体及其配体
(1)巨噬细胞表面受体及其识别的配体
(a)模式识别受体（PRR）
指单核巨噬细胞和DC等固有免疫细胞表面或细胞器室膜上，能够识别病原体某些共有特定分子结构的受体。包括甘露糖受体、清道夫受体（可识别磷脂酰丝氨酸，即凋亡细胞重要表面标志）、Toll样受体（分两类，表达于细胞膜上的和细胞器膜上的），
(b)病原相关模式分子（PAMP）
即PRR识别结合的配体，是病原体及其产物所共有的、某些高度保守的特定分子结构
(c)调理性受体
巨噬细胞表面参与调理作用的受体，包括IgG
Fc受体和补体受体
(d)细胞因子受体 包括趋化因子受体MCP-1R、MIP-1α/βR等，在相应趋化因子作用下，可募集至感染和炎症部位；IFN-γ等细胞因子受体，通过与相应细胞因子结合而使巨噬细胞活化。
4.巨噬细胞的生物学功能
①清除、杀伤病原体
巨噬细胞借助表面的PRR和调理性受体，摄取抗原性异物，杀伤病原体
⑴氧依赖性途径 主要效应分子是反应性氧中间物和反应性氮中间物
⑵氧非依赖性途径 无需氧分子参与的杀菌作用，包括酸性环境、溶菌酶、防御素
⑶消化和清除
溶酶体起作用
②参与和促进炎症反应
通过分泌趋化因子、促炎症细胞因子等发挥作用
③杀伤靶细胞
④加工、提呈抗原
⑤免疫调节
二、树突状细胞
能诱导初始T细胞活化，是重要的免疫调节细胞
，广泛分布于脑以外的全身组织和脏器。
据来源分为：髓样DC和淋巴样DC。是专职抗原提呈细胞，未成熟
DC
摄取、加工处理抗原能力强，提呈抗原能力弱；成熟DC
摄取、加工处理抗原能力弱，提呈抗原能力强。
成熟DC分两个亚群：①髓样树突状细胞（mDC）②浆细胞样树突状细胞（pDC）
三、自然杀伤细胞
来源于骨髓淋巴干细胞，发育成熟需要骨髓的微环境。主要分布于外周血和脾。
无需抗原预先激活即可杀伤肿瘤及病毒感染细胞。在抗体存在的情况下，也可通过细胞表面的Ig
G
FcR杀伤与IgG结合的肿瘤细胞或病毒感染细胞，这种作用为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）
㈠NK细胞杀伤作用的机制
⒈穿孔素/颗粒酶途径
⒉Fas/FasL途径
⒊TNF-α/TNFR-I途径
㈡NK细胞活性的调节
按照NKC受体识别的配体性质不同，分为识别HLAⅠ类分子和非的HLAⅠ类分子调节性受体
按照受体功能分，有两类受体：
杀伤细胞活化受体——与靶细胞表面相应配体结合后，可激发NK细胞产生杀伤作用
杀伤细胞抑制受体——与靶细胞表面相应配体结合后，可抑制NK细胞产生杀伤作用
⒈识别HLAⅠ类样分子的活化性受体
杀伤细胞免疫球蛋白样受体；杀伤细胞凝集素样受体
⒉识别非HLAⅠ类样分子的活化性受体
NKG2D；自然细胞毒性受体（是NKC特有标志，也是其活化性受体）
四、NK
T细胞
指能同时组成性表达CD56和TCR-CD3复合受体的T细胞
五、γδT细胞
六、B1细胞
七、其他固有免疫细胞
⒈肥大细胞
⒉嗜碱性粒细胞
⒊嗜酸性粒细胞
第三节
固有体液免疫分子及其主要作用
主要包括补体系统、急性期蛋白、细胞因子、抗菌肽、具有抗菌作用的酶类物质
第四节
固有免疫应答
固有免疫应答
指体内固有免疫细胞和分子，识别、结合病原体及其产物或其他抗原性异物，被迅速活化，并产生相应生物学效应，从而将病原体等抗原性异物杀伤、清除的过程
一、固有免疫应答作用时相
⒈瞬间~阶段
①屏障作用②巨噬细胞的作用③补体激活④中性粒细胞的作用
0-4h
⒉早期~阶段
①巨噬细胞募集②巨噬细胞活化③B-1细胞活化④NK细胞、NK
T细胞、γδT细胞活化
4-96h
⒊适应性免疫应答诱导阶段
96h后，诱导T细胞活化
二、固有免疫应答特点
非特异性识别；未经克隆扩增即可迅速产生免疫效应
三、固有免疫应答与适应性免疫应答的关系
⒈启动适应性免疫应答
⒉影响适应性免疫应答的类型
⒊协助适应性免疫应答产物发挥免疫效应
固有免疫应答
适应性免疫应答
主要参与的细胞
黏膜上皮细胞，吞噬细胞，树突状细胞，NK细胞，NK
T细胞，γのT细胞，B-1细胞
αβ
T细胞，B-2细胞
主要参与的分子
补体，细胞因子，抗菌蛋白，酶类物质
特异性抗体，细胞因子
作用时相
即刻
96小时
96小时后启动
识别受体
模式识别受体
较少多样性
特异性抗原识别受体，胚系基因重排编码，具有高度多样性
识别特点
直接识别病原体某些共有高度保守的分子结构，具有多反应性
识别APC提呈的抗原肽-MHC分子复合物或B细胞表位，具有高度特异性
作用特点
未经克隆扩增和分化，迅速产生免疫作用，免疫免疫记忆功能
经克隆扩增和分化，成为效应细胞后发挥免疫作用，有免疫记忆功能
维持时间
维持时间较短
维持时间较长
第十五章
免疫耐受
对抗原特异应答的T、B细胞，在抗原刺激下，不能被激活，不能产生特异免疫效应及或特异性抗体，从而不能执行免疫应答的现象，称免疫耐受
诱导免疫耐受的抗原称耐受原
第一节
免疫耐受的形成及表现
一、胚胎期及新生期接触抗原所致的免疫耐受
⒈胚胎期嵌合体形成中的耐受
:接触同种异型抗原所致免疫耐受
⒉在胚胎期人工诱导的免疫耐受:
胚胎发育期，不成熟自身免疫应答细胞接触自身抗原后，发生克隆清除，形成对自身抗原的耐受
二、后天接触抗原导致的免疫耐受
㈠抗原因素
⒈抗原剂量
抗原剂量过高或过低引起的免疫耐受，称为低带及高带耐受
⒉抗原类型及剂型
单体易激活耐受，多聚体易产生应答
⒊抗原免疫途径
静脉注射及口服易致全身耐受
⒋抗原持续存在
⒌抗原表位特点
能诱导Treg细胞活化的抗原表位，称为耐受原表位
⒍抗原变异
㈡机体方面的因素
受客观环境因素影响
第二节
免疫耐受机制
中枢耐受
指在胚胎期及出生后T、B细胞发育过程中，遇自身抗原所形成的耐受
外周耐受
指成熟T、B细胞，遇内源性或外源性抗原，不产生正免疫应答，而显示免疫耐受
一、中枢耐受
T细胞及B细胞分别在胸腺及骨髓微环境中发育，此间进行阴性选择，启动细胞凋亡，致克隆消除，减少出生后自身免疫病的发生。
诱导中枢耐受的抗原：
1)体内各组织细胞普遍存在的抗原
2)组织特异性抗原：如部分内分泌相关蛋白，胰岛素、甲状腺球蛋白可表达于胸腺髓质上皮细胞。
二、外周耐受
1.克隆清除及免疫忽视
克隆清除
指体内某些组织特异性抗原浓度很高，且外周存在对其有高亲和力的T细胞克隆，一旦与抗原接触后，可经APC提呈，但因这些未经活化的APC表达较少的协同刺激分子，不能产生第二信号，致使此类被自身抗原活化的T细胞发生凋亡，而被克隆清除。
免疫忽视
指体内某些组织特异性抗原浓度低，或外周存在的T细胞克隆对其亲和力低，虽由活化的APC提呈，因缺乏第一信号，不足以活化T细胞，表现为自身组织特异性抗原与自身应答性T细胞克隆并存状态，在正常情况下不引起自身免疫病，称为免疫忽视。
2.克隆无能及不活化
绝大多数组织特异性抗原浓度太低，不足以活化相应的T细胞。当抗原浓度适宜，自身反应性T细胞与组织细胞MHC-I—自身Ag复合物接触，产生第一信号，但无第二信号，细胞不能充分活化，导致细胞克隆处于无能或不活化状态。
3.
免疫调节细胞的作用
调节性T细胞（Treg）：CD4+CD25+Foxp3+，具有负调节作用，通过细胞间的直接作用，抑制CD8+、CD4+T细胞的应答。
后天诱导Treg细胞和其他类型T细胞，通过分泌IL-10、TGF-β，抑制DC的成熟，抑制Th1、CTL的功能。
4.细胞因子的作用
5.信号转导障碍与免疫耐受
蛋白酪氨酸磷酸酶、ITIM基序等分子是负信号调控分子，如果这些负调控分子表达不足或缺陷，会破坏免疫耐受，致自身免疫病。
6.免疫隔离部位的抗原在生理条件下不致免疫应答
脑及眼的前房部位为特殊部位，抑制同种异型抗原的组织，不诱导应答，移植物不被排斥，为免疫隔离部位
原因：①生理屏障②抑制性细胞因子③PD-1的负调控作用
第三节
免疫耐受与临床医学
一、建立免疫耐受
⒈口服免疫原
⒉静脉注射抗原
⒊移植骨髓及胸腺
⒋转染基因
⒌脱敏治疗
抑制IgE产生
⒍防止感染
⒎诱导产生具有特异拮抗作用的调节性细胞 小鼠EAE是实验性自身免疫性脊髓炎
⒏自身抗原肽拮抗剂的使用
二、打破免疫耐受
⒈免疫原及免疫应答分子用于肿瘤免疫治疗
⒉抗免疫抑制分子及调节性T细胞用于肿瘤免疫治疗
⒊细胞因子及其抗体的合理使用
⒋多重抗感染措施，防止病原体产生抗原拮抗分子
第十六章
免疫调节
第一节
免疫调节是免疫系统本身具有的能力
免疫调节是机体对免疫应答过程做出的生理性反馈
⒈感知与调节
可以由免疫系统自行实施
⒉应答与调节
主要是负反馈调节，调节和应答各司其职
⒊调节与干预 干预为人为介入，包括对正常免疫应答途径实施干预、对免疫调节途径进行变革
⒋调节与疾病
第二节
固有免疫应答的调节
一、炎症因子分泌的反馈调节
Toll样受体（TLR）与病原相关模式分子（PAMP）结合后，通过NF-kB和MAP激酶相关信号途径，引起多种促炎症因子基因的激活，通过炎症反应清除病原体感染。然而，过量出现的炎症介质可能导致局部和全身性疾病，为此，免疫系统必需启动相应的机制，对TLR介导的炎症应答实施调节。
效应期：维持适当的反应强度；耐受期：无反应性
二、SOCS蛋白调控细胞因子的分泌
SOCS:
细胞因子信号转导抑制蛋白
细胞因子一旦与受体结合，受体分子间的聚合作用使与之相联的Jak激酶因相互磷酸化而激活，招募带有SH2结构域的STAT并使其磷酸化。细胞因子得以发挥其生物学功能。
三、补体调节蛋白对补体效应的调节
补体活化途径的调控，保证了补体在启用调理作用、炎症反应和介导细胞毒性清除病原体的同时，不致无节制地大量消耗，也可避免补体对自身组织和细胞的损伤。
第三节
抑制性受体介导的免疫调节
一、免疫细胞激活信号转导的调控
1．信号转导中两类功能相反的分子
PTK为蛋白酪氨酸激酶；PTP为蛋白酪氨酸磷酸酶。
受体分子胞内段上特定的氨基酸基序：
ITAM和ITIM
2．免疫细胞活化中两类功能相反的免疫受体
激活性免疫受体®带有ITAM®招募PTK®一般启动激活信号的转导；
抑制性免疫受体®带有ITIM®招募PTP®一般终止激活信号的转导。
两类受体的表达在时相上会有差别，即PTP的招募和激活往往在免疫细胞行使功能活化之后。
二、各种免疫细胞的抑制性受体及其反馈调节
1．共信号分子对T细胞增殖的反馈调节
CTLA-4,配体是B7；PD-1,配体是B7家族的PD-L1/L2。
一般在T细胞获得双重激活信号后约24小时诱导性表达
,
而CD28组成性地先表达。
2．B细胞通过FcgRII-B受体实施对特异性体液应答的反馈调节
配体：IgG
Fc段，其活化需与BCR交联。
激活成分：抗抗体，或抗原抗体复合物。
FcrR
II-B受体的胞浆段有ITIM基序，可引发抑制性信号，终止B细胞的分化和分泌抗体。抗BCR抗体必需是BCR或相应抗体分子大量出现，越过免疫系统感知的阈值，将被视作为一种新出现的、以特定独特型为表位的自身抗原，并产生相应的抗BCR
IgG抗体。
3．杀伤细胞抑制性受体调节NK细胞活性
（1）杀伤细胞Ig样受体（KIR）：配体是HLAⅠ类分子和非经典的HLA-G分子；
（2）杀伤细胞凝集素样受体（KLR）：配体是非经典Ⅰ类分子HLA-E提呈的肽段；
（3）免疫球蛋白样转录体（ILT），配体为HLAⅠ类分子的近膜端结构域（a3结构域）。
4.其他免疫细胞的调节性受体
第四节
调节性T细胞参与免疫调节
一、自然调节T细胞
表型：CD4+CD25+foxp3+
二、适应性调节T细胞
又称诱导性调节T细胞（iTreg）一般在外周由抗原及多种因素激发而产生，可以来自初始T细胞，也可从自然调节性T细胞分化而来。适应性调节T细胞的分化和功能发挥必需有特定细胞因子的参与。
Tr1和Th3是两类重要的适应性调节T细胞。
特
点
自然调节性T细胞
适应性调节T细胞
诱导部位
胸腺
外周
CD25表达
+
+
+
-/+
转录因子Foxp3
+
+
+
+
抗原特异性
自身抗原(胸腺中)
组织特异性抗原和外来抗原
发挥效应作用的机制
细胞接触为主
分泌细胞因子为主
功能
抑制自身反应性T细胞介导的病理性应答
抑制自身损伤性炎症反应、阻遏
病原体和移植物引起
举例
CD4+
CD25+
T细胞
CD4+
的Tr1和Th3
三、Th1和Th2的免疫调节作用
Th1分泌IFN-γ
Th2分泌IL-4
第五节
抗独特型淋巴细胞克隆对特异性免疫应答的调节
一、抗独特型抗体和独特型网络
1．抗体分子的抗原表位(同种型、同种异型、独特型)
同种型：有两重含义，一是指物种内抗体类别的差异；二是指同类抗体结构的种间差异。显然，由抗体分子同种型诱导产生抗抗体，必需通过种间免疫。
同种异型：同一物种个体间针对同种异型的抗抗体有可能在同种异体输血中出现。
独特型：是指TCR、BCR或Ig的V区具有的独特的氨基酸顺序和空间构型。
2．独特型网络与抗原内影象
抗独特型抗体有两种：针对支架部分的称Ab2α型，针对抗原结合部位的称Ab2β型。
抗原内影像：抗独特型抗体中的Ab2b,
因其结构和抗原表位相似，并能与抗原竞争性地和Ab1结合，因而b型的抗独特型抗体被称为体内的抗原内影像
3．独特型网络调控的实质是淋巴细胞克隆在BCR或TCR间引发的相互作用
关键成分是
表达特定BCR的B细胞克隆及随后发生的克隆扩增
二、以独特型为核心的两种调控格局
1．通过第二抗体增强机体对抗原的特异性应答
2．通过第二抗体抑制机体对抗原的特异性应答
第五节
其他形式的免疫调节
一、活化诱导的细胞死亡对效应功能的反馈调节
1、活化诱导的细胞死亡的机制及免疫调节：
已激活的T细胞，发挥效应后可以自行发生凋亡，这一现象为激活诱导的细胞死亡（AICD）主要由Fas和FasL介导
2．AICD的失效引发临床疾病
Fas或FasL基因发生突变后，使反馈调节失效。人类的常见疾病为自身免疫性淋巴细胞增生综合症
二、免疫-内分泌-神经系统的相互作用和调
第十七章
超敏反应
超敏反应（hypersensitivity）是指机体受到某些抗原刺激时，出现生理功能紊乱或组织细胞损伤的异常适应性免疫应答。超敏反应又常被称为变态反应。前三型均由体液免疫介导，可经抗体被动转移；第IV型由细胞免疫介导。
型别
参加成分
发生机制
临床常见病
特异性免疫物质
非特异性辅助物质
Ⅰ型速发型过敏反应
IgE
IgG4
肥大细胞
嗜碱性粒细胞
嗜酸性粒细胞
1.抗原刺激机体产生IgE，IgE结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面
2.抗原再次进入机体，与细胞表面IgE结合
3.靶细胞活化，释放生物介质
4.介质作用于效应器官，导致平滑肌痉挛，小血管扩张，毛细血管通透性增加，腺体分泌增加
1．过敏性休克
2．支气管哮喘
3．过敏性鼻炎
4．过敏性胃肠炎
5．荨麻疹
Ⅱ型细胞毒型细胞溶解型
IgG
IgM
补体系统
吞噬细胞
NK细胞
1.抗体与细胞本身或粘附在细胞表面的抗原结合，或抗原抗体复合物吸附在细胞表面
2.激活补体，溶解靶细胞
3.调理Mφ，吞噬靶细胞
4.激活杀伤细胞，杀伤靶细胞
1．异型输血反应
2．新生儿溶血性症
3．免疫性血细胞减少症
4．甲状腺机能亢进
Ⅲ型免疫复合物型血管炎型
IgG
IgM
补体系统
中性粒细胞
嗜碱性粒细胞
血小板
1．中等大小可溶性IC沉积于血管基底膜、关节滑膜等处
2．激活补体
3．吸引中性粒细胞，释放溶酶体酶
4．引起血管炎及血管周围炎
1．血清病
2．感染后肾小球肾炎
3．系统性红癍狼疮
4．类风湿性关节炎
5．过敏性肺泡炎
Ⅳ型迟发型细胞介导型
致敏T细胞
淋巴因子
巨噬细胞
1．抗原刺激T细胞致敏。
2．致敏T细胞再次与抗原相遇，产生免疫效应
3．TH
1释放淋巴因子，引起炎症反应
4．Tc直接杀伤靶细胞
1．传染性超敏反应
2．接触性皮炎
3．移植排斥反应
第十八章
自身免疫性疾病
免疫自身稳定
是指机体的免疫系统对自身的组织细胞成分处于免疫耐受状态不发生免疫应答。
第一节
概述
自身免疫:机体免疫系统对自身成分发生免疫应答的能力,通常对机体不造成损伤。
自身免疫病：因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态
自身免疫性疾病的特点
1)患者体内可检测到针对自身抗原的自身抗体和/或自身反应性T淋巴细胞
2)自身抗体和/或自身反应性T淋巴细胞介导对自身细胞或自身成分的适应性免疫应答，造成损伤或功能障碍；
3)病情的转归与自身免疫反应强度密切相关；4)易反复发作，慢性迁延。
自身免疫性疾病的分类
1.器官特异性自身免疫病(患者的病变一般局限于某一特定的器官)
(1)针对自身抗原的自身抗体或淋巴细胞损伤靶器官或腺体细胞。
(2)某些自身抗体可通过对靶器官或腺体的正常功能过度刺激或抑制.
代表疾病：桥本氏甲状腺炎、毒性弥漫性甲状腺肿、胰岛素依赖的糖尿病
2.全身性自身免疫病
由针对多种器官和组织靶抗原的自身免疫反应引起，患者的病变可见于多种器官和组织。代表疾病：系统性红斑狼疮
第二节
自身免疫性疾病的免疫损伤机制及典型疾病
发病原因:自身抗体和/或自身反应性T淋巴细胞介导的免疫应答。
发病机制:由自身抗体/自身反应性T淋巴细胞，或二者共同引起的针对自身抗原的超敏反应性疾病，其发病机理和超敏反应的发病机理相同。
一、自身抗体引起的自身免疫性疾病
自身抗体包括:
细胞膜或膜吸咐成分自身抗体
细胞表面受体自身抗体（1）激动型抗受体自身抗体（2）阻断型抗受体自身抗体
细胞外成分自身抗体(细胞外基质成份)
1.
自身抗体引起的细胞破坏性自身免疫性疾病：自身抗体与细胞表面抗原结合后引起的损伤机制：a.
补体依赖的细胞毒作用（CDC）、b.
补体和抗体的调理作用、c.
ADCC、d.
嗜中性粒细胞的破坏细胞作用。常见疾病有自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癜、血型不合引起的输血反应。
2.
细胞表面受体自身抗体引起的自身免疫性疾病：抗体与细胞表面受体结合，过度刺激器官功能（如Graves病），或阻断受体与配体结合，抑制器官功能（如重症肌无力）。
3.
细胞外成分自身抗体引起的自身免疫性疾病：如肺出血肾炎综合征，系由抗基底膜Ⅳ胶原自身抗体启动的免疫应答，导致肾炎和肺部出血。
4.
自身抗体-免疫复合物引起的自身免疫性疾病：如SLE，因免疫复合物沉积在各种组织的小血管壁，激活补体引起细胞损伤；核抗原物质释出又导致产
生更多的自身抗体，进一步加剧损伤。
二、自身反应性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病
⒈胰岛素依赖型糖尿病：CTLà胰岛的β细胞
--使胰岛素分泌严重不足
⒉实验性变态反应性脑脊髓膜炎（EAE）
存在：髓鞘碱性蛋白（MBP）特异的Th1
⒊人多发性硬化病（MS）存在：髓鞘碱性蛋白（MBP）特异的Th1
⒋多发性硬化症(中枢神经系统的疾病)
三、自身抗体、自身反应性淋巴细胞均可导致发病
重症肌无力（MG）（抗乙酰胆碱受体自身反应性T细胞）
类风湿关节炎：（抗关节滑膜抗原的自身反应性淋巴细胞
）
第三节
自身免疫性疾病发生的相关因素
一、抗原方面的因素
1．免疫隔离部位抗原的释放
免疫隔离部位
2.
自身抗原发生改变：由生物、物理、化学以及药物等因素引起。
3.
分子模拟
有些微生物与人的细胞或细胞外成分有相同或类似的抗原表位，在感染人体后激发的针对微生物抗原的免疫应答，也能攻击含有相同或类似表位的人体细胞或细胞外成分，这种现象被称为分子模拟。
二、免疫系统方面的因素
1．MHCⅡ类分子的异常表达
:
只在APC表达。胰岛素依赖糖尿病β胰岛细胞高表达MHCII。
2．免疫忽视的打破：免疫忽视
是指免疫系统对低水平抗原或低亲和力抗原不发生免疫应答的现象。
3．调节性T细胞的功能失常：发挥免疫抑制。
4．活化诱导的C死亡发生障碍：激活的效应性淋巴C在行使效应功能后死亡的现象称为活化诱导的细胞死亡（AICD）。
5．淋巴细胞的多克隆激活：
6．表位扩展：免疫系统针对一个优势表位发生免疫应答后，可能对隐蔽表位相继发生免疫应答，这种现象被称为表位扩展。
三、遗传方面的因素
1．HLA等位基因的基因型和人类自身免疫性疾病的易感性相关
2．与自身免疫性疾病发生相关的其他基因
3．性别与某些自身免疫性疾病的发生相关
第四节
自身免疫性疾病的防治原则
1．预防和控制微生物感染：采用疫苗和抗菌素控制，尤其长期感染。
2.
