作者：张增艳; 许景升; 刘耀光; 王晓萍; 林志珊...小麦中间偃麦草抗病育种转基因育种抗病基因同源序列黄矮病候选基因基因克隆克隆池pcr可转化人工染色体
摘要：根据已克隆植物抗病(R)基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物，利用同源序列法PCR扩增、克隆到9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段(Resistance Gene Analogs，RGAs)。利用抗黄矮病材料(含Bdv2)、感黄矮病材料(无Bdv2)进行RFLP分析，筛选到1个NBS类RGA序列TirgaZl与Bdv2连锁。根据TirgaZl的序列重新设计l对引物，优化PCR扩增条件，将其转化为经典特异PCR标记(SC-TZl)。利用该特异PCR标记(SC-TZI)和克隆池．PCR法筛选抗黄矮病小麦-中间偃草易位系HW642基因组的可转化人工染色体(Transformation-competent Artificial Chromosome，TAC)文库，分离到4个阳性TAC克隆Tl～T4。限制酶切图谱分析结果表明，Tl～T3为l类，插入片段约23kb，T4为另l类，插入片段约为25kb。以TirgaZl为探针，通过Southern杂交证实了阳性TAC克隆Tl、T4为含有TirgaZl序列的抗病基因候选克隆。分别以中间偃麦草、HW642和小麦亲本为探针对阳性克隆Tl、T4进行Southern分析，结果表明，阳性TAC克隆Tl、T4的插入片段均具有抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段7XL，Tl、T4为抗黄矮病基因候选克隆。测定和分析阳性克隆Tl插入片段5’端-6448bp部分的序列，表明其最长完整开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)为2675bp，其编码产物具有信号肽、低复杂性结构、NB-ARC、跨膜域等结构，与已克隆的NBS-LRR类抗病基因RPP13、I2C等具有同源性。抗黄矮病基因候选克隆Tl、T4的生物学功能有待通过转化、抗病鉴定进行验证。
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