作者：夏庆; 彭明兵; 郑志菊; 王伟; 孙达权; 曹...肝细胞癌基质金属蛋白酶2迁移侵袭
摘要：目的:构建人基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)基因重组真核表达载体,探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体,p EYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP,siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,钙蛋白酶(calcium-activated neutral protease,Calpain)特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达变化。结果:成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比,MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调(P=0.000),细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低(P=0.000或P=0.001),48 h侵袭率明显降低(P=0.004),E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及Vimentin表达明显下调(P=0.000)。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比,过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强(P=0.015或P=0.001),48 h侵袭率明显升高(P=0.011),细胞E-cadherin表达明显下调,N-cadherin及Vimentin表达明显上调(P=0.003或P=0.001)。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率(P=0.000),上调E-cadherin,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平(P=0.000)。结论:本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2,成功表达MMP-2-YFP融合蛋白;并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。
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