作者：景一娴; 饶菁菁; 廖飞; 杨晓兰米氏常数尿酸酶碱性磷酸酶反应过程分析
摘要：目的:联用设定底物浓度下初速度(initial velocity,Vi)和过程分析法所得酶最大反应速度(maximal reaction rate,Vm)与米氏常数(Michaelis-Menten constant,Km)比值(Vm/Km),据米氏方程推算酶的Km和Vm。方法:以苛求芽孢杆菌尿酸酶(Bacillus fastidious uricase,BFU)及其突变体(A1R,A1R/V144A)、牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)及大肠杆菌碱性磷酸酶突变体R168K为模型。用A293 nm记录尿酸酶反应曲线、A450 nm记录碱性磷酸酶水解4-硝基-1-萘基磷酸酯(4-nitro-1-naphthyl phosphate,4NNPP)反应曲线;以反应时间为自变量、用积分速度方程拟合不超过10%Km初始底物浓度下酶反应曲线测定Vm/Km,分析设定底物浓度下初速度反应数据确定初速度Vi;据相同酶量Vi和Vm/Km按米氏方程计算Km;据所得Vm/Km和Km推算Vm。结果:以E-H(Eadie-Hofstee)法分析50%200%Km底物浓度下Vi所得Km均值为其参考值;联用策略测定Vi所设定的底物浓度越高,则所得Km相对偏差越小;测定Vi所设定的底物浓度从35%Km逐渐升高到120%Km,所得Km趋于稳定且相对偏差不超过20%。据此联用策略发现,苛求芽孢杆菌尿酸酶在生理pH下活性降低的原因不是其Km明显升高,而是其Vm下降。结论:当底物溶解度低于Km时,这种联用策略更适合测定酶的Km和Vm。
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