作者：王莉; 曾颖; 夏红; 刘芳; 苏波; 凌晖; 苏...真核表达载体转染人胃癌bgc823细胞
摘要：细胞周期检测点Chkl和Chk2在参与G2/M期起着重要作用,本研究构建Chk1/2的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌BGC823细胞,进-步证明Chk1/2高表达对BGC823细胞G2/M期的影响.根据NCBI GenBank Chk1/2基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从人胃癌细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第-链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序对重组质粒进行鉴定.用脂质体将重组质粒转染BGC823细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物.结果显示,菌落特异性PCR表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,经测序与NCBIBLAST分析证实为Chk1和Chk2基因.稳定转染空载体pcDNA3.1 的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的BGC823细胞,经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在BGC823细胞中的表达较对照组与空载体组明显增加（ P 〈0.05）.流式细胞术检测显示,Chk1转染组G2/M细胞较对照组与空载体组明显增加 （ P 〈0.05）,而Chk2转染组G2/M细胞无明显差异 （ P 〉0.05）.上述结果表明,成功构建pcDNA3.1/Chk1与pcDNA3.1/Chk2真核表达载体和Chk1与Chk2高表达的BGC823细胞,Chk1高表达可阻滞BGC823细胞于G2/M.
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