作者：孙菊鲜; 康春婷; 远宜彤; 李钊; 葛欣; 辛...三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶定点突变随机突变
摘要：三孢布拉氏霉菌中carRA基因编码的CarRA为双功能酶,该酶的R结构域具有番茄红素环化酶的功能,是三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成途径过程中的关键酶,其酶活性的高低即环化能力的强弱决定了番茄红素的积累水平。为深入研究三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的功能,以酿酒酵母菌株W303为出发菌株,首先构建了二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸高效合成的酿酒酵母底盘菌株W303-thmgr-Bts 1,在该底盘菌株中表达三孢布拉氏霉菌的carB和carRA基因,完成类胡萝卜素代谢途径的构建。在此基础上对R结构域进行定点突变和随机突变,并成功构建了5个单一保守位点的突变酶和依赖于酵母同源重组的番茄红素环化酶随机突变体库。通过评估各突变株的菌落颜色和测定类胡萝卜素的产量来确定一系列位点的突变对R结构域催化番茄红素合成β-胡萝卜素能力的影响,最终筛选出了影响该蛋白活性的关键氨基酸位点,为三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的催化机制研究与酶活性改良奠定了理论基础。
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