基于miR30骨架的HPSE—shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究

作者：刘晓艳; 方红; 朱定仙; 张妤慢病毒属遗传载体rna干扰微rnas转录启动子葡糖醛酸糖苷酶聚合酶链反应

摘要：目的：模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA，将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内，实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控。方法：设计3条基于miR30骨架的HPSE—shRNA，通过PCR获得目的片段，回收后与线性化OVPP．GFP载体连接产生重组慢病毒载体LVPP—GFP／miR—HPSE—shRNA，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LVPP-GFP／miR．HPSE-shRNA、pHelper1．0载体和pHelper2．0载体共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒，感染A375细胞。以实时荧光定量PCR检测HPSE．mRNA的表达情况，以Westenblot检测HPSE蛋白的表达水平。结果：构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体，经阳性菌落PCR鉴定与测序，结果正确。实时荧光定量PCR和Westenblot结果表明，LVPP—GFP／miR—HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE—mRNA和蛋白的表达明显降低。结论：本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE—shRNA慢病毒载体，实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控，为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据。

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