作者：王海波; 王多春; 毕振强; 阚飙气单胞菌嗜水聚合酶链反应评价研究
摘要：目的建立嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR实验室检测方法。方法根据嗜水气单胞菌主要黏附素基因（aeromonas hydrophila major adhesion gene，aha）的保守序列设计引物和TaqMan探针。引物选取200～700nmol／L6个浓度梯度，探针选取100～400nmol／L4个浓度梯度，以完全随机设计资料的方差分析分别优化引物和探针的浓度。以45株霍乱弧菌、20株副溶血弧菌、10株河流弧菌、4株拟态弧菌、5株创伤弧菌、1株溶藻弧菌、1株弗尼斯弧菌、5株沙门菌属细菌、10株志贺菌属细菌和2株类志贸邻单胞菌为对照，评价该方法的特异性。对所建立的方法进行菌液灵敏度检测和DNA灵敏度检测，并将嗜水气单胞菌人工污染健康人的粪便，实验室内评价该方法从粪便中检测嗜水气单胞菌的能力。结果6组引物浓度所得的循环阈值（cycle threshold，Ct）分别为（x^- ±s）：20．69±0．33、20．72±0．21、20．81±0．12、20．74±0．12、20．51±0．16和20．69±0．11，选择上下游引物的浓度为200nmol／L（F=1．33，P=0．28），4组探针浓度所得的Ct值分别为（x^- ±s）：20．56±0．08、20．82±0．05、20．82±0．11和20．93±0．09，选择探针的浓度为100nmol／L（F=5．26，P=0．01）。该方法DNA的检测下限为100fg／μl，纯菌液的检测下限为80CFU／ml，粪便中嗜水气单胞菌的检测下限为8×10^3CFU／ml，人工粪便标本增菌8h后的检测下限为8CFU／ml。该方法对其他细菌的染色体无扩增。结论以aha基因为目标检测片段建立的嗜水气单胞菌实时PCR方法灵敏度高、特异度强，可用于纯菌和粪便标本中嗜水气单胞菌的快速检测。
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