作者：尚庆丽; 马景学; 高健; 白玉; 宋欣; 朱京...内皮抑素类色素上皮细胞培养的大鼠近交bn
摘要：目的应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮（RPE）细胞，为脉络膜新生血管（CNV）基因治疗奠定基础。方法采用人内皮抑素真核表达载体pSec TagA—h内皮抑素，应用电转移法及脂质体介导法转染Brown Norway（BN）大鼠RPE细胞，以平阳霉素筛选出表达内皮抑素的RPE细胞，传代培养3周。转染后提取RPE细胞总DNA，聚合酶链反应（PCR）产物琼脂糖凝胶电泳，原位杂交，蛋白印记和免疫组织化学观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测转染RPE细胞培养上清液中内皮抑素的表达水平；四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）测定所表达内皮抑素蛋白活性。结果PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550碱基对左右的特异性条带；原位杂交，免疫组织化学观察到大量RPE细胞表达内皮抑素mRNA及内皮抑素蛋白；蛋白印记显示，RPE细胞裂解产物中有内皮抑素阳性条带；ELISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20d6个时间点培养上清液内皮抑素蛋白表达量分别为（321．5±41．0）、（162．5±23．45）、（78±11．22）、（78±9．87）、（78±10．06）、（78±12．67）ng／ml；MTT显示，培养上清液中内皮抑素能够抑制脐静脉内皮细胞304的增生，IC50为45．68μg／ml，对RPE细胞、K562的生长无影响。结论经电转移法及脂质体介导转染法获得体外培养稳定表达内皮抑素的RPE细胞是可行的，转染成功的RPE细胞能够稳定表达内皮抑素蛋白，所表达的内皮抑素蛋白具有生物活性。
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