作者：程海; 徐开林; 孙海英; 鹿群先; 何徐彭; ...慢病毒属血友病a体外表达基因治疗
摘要：目的构建含有人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，观察其在体外培养细胞中的表达情况。方法用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因（BDDhFⅧcDNA）片段，将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点，构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ，限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向。采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒，包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝（Chang—Liver）细胞和成人骨髓基质细胞（MSC），并以pXZ171作为对照。流式细胞术（FCM）检测载体的感染效率，一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性，PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，包装后能有效感染多种靶细胞，感染效率分别为：HLF细胞（74．52±7．57）％、MSC（42．34±5．84）％和Chang-Live细胞（27．24±6．53）％。感染后48h检测到HLF细胞、Chang—Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达，FⅧ活性分别为（54．1±5．6）％、（22．5±2．9）％和（12．5±2．7）％。PCR检测到目的基因的整合。结论成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ，在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ。
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