作者：; 李起鸿; 戴刚; 石国华关节软骨细胞酶消化法体外培养高效分离细胞生物学活性细胞存活率细胞外基质体外传代培养甲苯胺蓝免疫组化多糖含量骨分离细胞透明质酸酶胰蛋白酶edta细胞形态蛋白多糖软骨基质第一代第三代
摘要：目的观察设计的三步酶消化法分离原代关节软骨细胞的效果,并对体外培养不同代次细胞的生物学活性进行评价.方法三步酶消化法设计为以培养液配制的1 g/L胰蛋白酶及1 g/L EDTA混合液、1 g/L透明质酸酶和2 g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化.结果 (1)关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为50.3×106个细胞,细胞存活率平均为98.8%.(2)原代和第一代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(92±10) μg/cm2;第三代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应明显减弱,第四代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(48±12) μg/cm2.结论 (1)三步酶消化法可使关节软骨基质完全消化降解,具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作简便等特点.(2)原代和第一代软骨细胞具有良好的生物学活性,而第三代以后的细胞生物学活性低下.
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