作者：马晋平; 詹文华; 汪建平; 彭俊生; 高劲松...sgc7901细胞rna质粒shhtert基因转染胃癌小分子gfp基因
摘要：目的构建针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit, hTERT)基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pU6-hTERT-siRNAs,观察其对胃癌SGC7901细胞hTERT基因的特异性抑制作用.方法采用报告基因质粒pCX-GFP(5 510 bp)和含有鼠U6启动子pU6 (3 300 bp)质粒,设计合成针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列,构建SHi-pU6-GFP质粒.应用LipofectamineTM2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞、SGC7901细胞,并用荧光显微镜观察转染效果.设计合成针对hTERT的siRNAs,构建重组pU6-hTERT-siRNAs质粒.LipofectamineTM2000介导pU6-hTERT-siRNAs质粒转染SGC7901细胞.分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)定性和定量检测hTERT基因表达情况.结果质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRⅤ和XbaⅠ酶切电泳后,前者出现3 300 bp和约300 bp条带,而后者出现3 300 bp和约350 bp条带,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符.说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒.K562细胞和SGC7901细胞中分别观察到转染pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少.定性、定量检测SGC7901细胞转染pU6-hTERT-siRNAs组hTERT基因表达抑制.结论针对hTERT基因设计的siRNAs表达质粒可以特异性抑制SGC7901细胞hTERT基因表达.
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