作者：韩琛璐; 王春筱; 李金燕; 罗莉霞人胚胎干细胞晶状体小体转录因子高通量测序
摘要：目的探讨人胚胎干细胞（hESC）定向分化为晶状体小体（LB）过程中晶状体发育相关转录因子的表达特点和规律。方法通过＂三阶段法＂体外诱导hESC定向分化为LB。取hESC（D0）和诱导分化不同时间点的细胞，应用高通量测序技术，通过生物信息学方法分析晶状体发育相关的转录因子及其亚型的表达变化特点和规律。采用Western blot法和免疫荧光染色技术对相关基因在蛋白水平的表达进行检测。结果光学显微镜下，未分化的hESC呈圆形；分化后0～6 d（D0～D6）的细胞更圆且排列更紧密；D7～D18细胞由圆形逐渐延长变为梭形；D19～D32，形成有三维立体结构的透明结构，即LB。荧光定量PCR结果显示，干细胞标记基因的表达在分化过程显著降低，而晶状体特异性基因的表达明显升高。免疫荧光染色结果显示，LB表达晶状体特异性蛋白α-crystallin和β-crystallin。高通量测序聚类分析结果显示，D0与D32之间的转录因子基因表达谱差异最为显著，而D6和D18之间的差异最小。前基板基因DLX3、DLX5、DLX6、HES1、HES4、OTX2和EYA1在分化第一阶段表达显著升高，随后下降；晶状体特异性基因中SOX2蛋白表达逐渐降低，而后升高，而PAX6蛋白的表达随分化时间延长逐渐增加；晶状体分化基因MAB21L1、CMAF、PROX1及PITX3等在分化早期变化不显著，在分化第三阶段表达明显增加。结论体外定向分化的3个阶段依次对应体内晶状体发育的前基板外胚层（PPE）阶段、前晶状体外胚层（PLE）和晶状体外胚层（LE）阶段、晶状体泡（LV）和晶状体细胞分化阶段，提示hESC体外定向分化过程很好地模拟了体内晶状体的胚胎发育过程，为研究晶状体发育和先天性晶状体疾病的分子机制提供了理想的模型。
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