作者：宋自芳; 郑启昌; 舒晓刚; 朱林; 胡安斌; ...arresten基因内皮细胞增殖血管内皮细胞生长因子表达及血管生成抑制因子亲和层析纯化脐静脉内皮细胞prset基因重组技术原核表达载体表达载体构建高效表达生物学活性比色法测定克隆表达
摘要：目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因,并探讨其生物学活性.方法利用基因重组技术,从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段,亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中,构建表达载体pRSETAN.将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.菌体经超声波破碎,镍柱亲和层析纯化并复性.采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性.结果酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.在表达宿主菌中,arresten基因获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白质的27%;表达产物经亲和层析纯化后,蛋白质纯度达96%.经复性,重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用.结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达;复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖.
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