作者：张绍昆; 刘一; 吴宏; 单玉兴; 徐莘香关节软骨细胞表达外源性免疫细胞化学转染酶切位点gfp基因
摘要：目的探讨含有绿色荧光蛋白(GFP)的外源性人胰岛素样生长因子(hIGF)-1基因真核表达载体在关节软骨细胞内稳定表达的可行性,建立IGF-1基因工程化的关节软骨细胞.方法利用基因重组技术,将GFP cDN段插入pcDNA3.1-hIGF-1载体中,构建重组载体pcGI.然后采用脂质体方法,转染原代关节软骨细胞,经G418筛选后,继续体外单层培养4周.原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,荧光显微镜观察GFP的表达,Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测软骨细胞表型,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测软骨细胞增殖能力.结果根据重组载体pcGI内的酶切位点,设计采用BamH I酶切显示为线性化,Xba I酶切显示为512 bp、1 768 bp、5 915 bp三个片段,HindⅢ则酶切下3 023 bp、5 172 bp二个片段,证明所构建的质粒方向及大小正确,含有GFP和hIGF-1 cDN段.稳定转染pcGI的软骨细胞原位杂交、免疫细胞化学和荧光显微镜证实了hIGF-1和GFP的表达,同时MTT显示转染后的软骨细胞增殖能力增强,并能维持Ⅱ型胶原的表达.结论外源性hIGF-1和GFP基因在关节软骨细胞内获得稳定表达,体外单层培养的转染关节软骨细胞增殖能力增强,同时维持软骨细胞表型.
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