丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

作者：刘妍; 成军; 白桂芹; 严福明; 吴顺华; 王...肝炎丙型肝炎病毒属病毒非结构蛋白质类双杂交系统技术ns4b基因结合蛋白基因人肝细胞非结构蛋白克隆

摘要：目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCV NS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析.结果成功克隆出HCV NS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程.结论成功克隆出HCV NS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索.

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