作者：张敏; 刘芳; 刘陵波; 童允洁; 肖娟; 仲照...锤头状核酶cd95小鼠细胞毒t淋巴细胞胰岛移植物试剂盒检测胰岛细胞凋亡胶原酶消化法免疫印迹检测细胞增殖活性体外构建活性检测
摘要：目的研究锤头状核酶通过调控CD95的表达,对小鼠胰岛细胞凋亡的影响;探索提高胰岛移植物存活率的新途径.方法体外构建针对CD95 mRNA 93位点的锤头状核酶(pU6-Rz93)和突变型核酶(pU6-dRz93).采用Ⅴ型胶原酶消化法分离小鼠胰岛细胞,通过干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素1α(IL-1α)诱导其高表达CD95后,经钠米载体-Effectene将核酶转染至该细胞.通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测(Western blot)法检测胰岛细胞CD95的表达.胰岛细胞经抗CD95的抗体(JO2)作用后,以Caspase-3活性检测试剂盒检测转染前后细胞Caspase-3活性的变化;MTT法测细胞的增殖;Annexin-Ⅴ凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,并观察了各组细胞对细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤的反应能力.结果细胞因子可诱导小鼠胰岛细胞高表达CD95分子.转染pU6-Rz93组的胰岛细胞CD95的表达与转染空载体组和转染pU6-dRz93组相比,明显下降.经JO2处理后,转染pU6-Rz93组胰岛细胞的Caspase-3活性和凋亡率明显降低,细胞增殖活性和抵抗CTL杀伤的能力显著增强.结论针对Fas mRNA 93位点的锤头状核酶能显著抑制小鼠胰岛细胞CD95的表达,使其免于CD95途径的凋亡;为提高胰岛移植物的存活率提供了实验基础.
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