作者：刘凌波; 黎纬明; 何伟; 张敏; 肖娟; 仲照...重组融合蛋白质类t淋巴细胞细胞毒性免疫逃逸抗fas锤头状核酶下调细胞毒t细胞
摘要：目的研究抗Fas锤头状核酶下调细胞毒T细胞(CTL)的Fas表达,以及CD80-免疫球蛋白G(CD80-IgG)融合蛋白增加急性粒-单核白血病细胞表面的CD80分子表位对CTL杀伤急性粒-单核白血病细胞能力的影响.方法构建可有效切割Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒,通过电穿孔法导入小鼠脾脏T细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测T细胞Fas的表达;同时构建pcDNA/CD80-IgG融合基因真核表达载体,采用脂质体技术导入中国地仓鼠卵巢细胞株(CHO)细胞中,并采用免疫亲和层析法纯化CHO细胞上清中的CD80-IgG融合蛋白,用其孵育急性粒-单核白血病细胞株(WEHI-3)后,与上述转染Fas mRNA锤头状核酶的T细胞进行同种异体白血病细胞和淋巴细胞混合培养;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)检测T细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝微量反应比色法(MTT法)检测T细胞增殖和CTL体外杀伤WEHI-3细胞的能力.结果凝胶图像分析小鼠脾脏T细胞Fas 蛋白电泳条带的灰度比值显示:以对照组为1,空载体(pEGFPC1)和Fas核酶RZ596重组真核表达载体(pEGFP-RZ596)转染组分别为0.98和0.45(P＜0.01);当转染pEGFP-RZ596的小鼠脾脏T细胞与高表达Fas配体的(64%±3%)WEHI-3细胞混合培养后,T细胞凋亡率为37%,对WEHI-3细胞的杀伤活性为67%,而对照及转染pEGFPC1小鼠脾脏T细胞组的凋亡率和对WEHI-3细胞的杀伤活性分别为88%、84%(P＜0.01)和32%、31%(P＜0.01).WEHI-3细胞表面CD80表达率仅为5.1%±0.4%,经CD80-IgG融合蛋白预孵育后增至27.4%±2.2%(P＜0.01);小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育和未孵育的WEHI-3细胞杀伤率分别为64%和49%(P＜0.01).转染Fas核酶的小鼠脾脏T细胞对CD80-IgG融合蛋白预孵育的WEHI-3细胞杀伤率增至82%(P＜0.01).结论联合抗Fas核酶和 CD80-IgG融合蛋白能使小鼠CTL免于FasL-Fas途径的凋亡;并显著增强其杀伤急性粒单核白血病细胞的效应.
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