作者：卓超; 钱元恕嗜麦芽窄食单胞菌mbl表达亚胺培南e试验酶基因重组体金属酶克隆
摘要：目的探讨嗜麦芽窄食单胞菌所产金属β-内酰胺酶的酶学特性及分子生物学特征. 方法以MBL-E试验筛查到的一株产金属β-内酰胺酶(MBL)嗜麦芽窄食单胞菌750为研究对象;MBL的等电点、对酶抑制剂的酶稳定性及抗生素的水解率按常规测定;抽提细菌染色体、PCR扩增blaMBL全基因并进行测序;构建blaMBL-pET32a(+)重组体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.结果菌株750仅产一种β-内酰胺酶,其pI为6.6;以对亚胺培南的水解率为100%计,对青霉素、拉氧头孢、头孢他啶、氨曲南的相对水解率分别依次为1420%、27%、9%和1%,酶活性可被EDTA抑制,但不受克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等β-内酰胺酶抑制剂影响.染色体DNA模板的PCR结果显示,酶全基因全长为867 bp,经序列分析和同源性比较,与已报道的金属酶L1的编码基因blaS(注册号AJ291672)和blaL1(AF010282)的核苷酸同源性均为99.31%,推定的氨基酸序列同源性分别为99.31%和98.96%.大肠杆菌BL21(DE3)转化含酶基因的blaMBL-pET32a(+)重组质粒后,MBL- E试验为产MBL阳性,对亚胺培南和头孢他啶的MIC分别为12 mg/L和2 mg/L,对亚胺培南的MIC较母株低10倍左右;SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为48kDa,其中酶蛋白约为26kDa.结论嗜麦芽窄食单胞菌750所产MBL为染色体介导的L1型金属酶;构建的含酶基因的重组体blaMBL-pET32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达并重现其耐药特征;表达株对亚胺培南的耐药水平低于母株提示MBL仅是菌株750耐药性决定因素之一.
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