作者：李瑶; 杨梦铱; 李琳; 陈春来; 隋森芳; 孙...唇腭裂snf7单分子检测vps4
摘要：目的构建参与唇腭部发育的重要蛋白ESCRTⅢ的单分子检测体系。方法分析ESCRTⅢ蛋白的结构,选取不影响结构稳定和纤丝形成的氨基酸进行突变,体外提取突变蛋白检测蛋白的稳定性,吸收光谱检测突变蛋白荧光标记的效率,负染电镜观察突变蛋白形成纤丝的能力,负染电镜观察和离心沉淀分析突变体蛋白形成的纤丝被Vps4解聚的能力。结果选取了ESCRTⅢ蛋白Snf7上的5个位点,K57,G58,N59,G120和D122,分别突变为半胱氨酸,其中K57C突变体蛋白不稳定聚沉,G58C突变体蛋白荧光标记效率低,N59C和G120C突变体蛋白影响纤丝形成,只有D122C突变体蛋白稳定,标记效率高,且标记后的蛋白能正常形成纤丝并被Vps4蛋白解聚。结论筛选出了Snf7 D122C突变体适用于利用单分子技术检测ESCRTⅢ纤丝的解聚动态过程,从而为进一步在细胞水平和体内研究ESCRT系统对腭部发育的作用提供支持。
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