作者：林冬佳; 陈燕活; 彭志翔; 高燕粪肠球菌脂磷壁酸巨噬细胞自噬
摘要：目的 通过研究粪肠球菌脂磷壁酸（LTA）对巨噬细胞自噬功能的影响,为后续进一步深入探讨顽固性根尖周炎的发病机制提供实验依据。方法 体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7,细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LTA的细胞毒性作用;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测LTA作用下巨噬细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1的表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测自噬相关基因LC3、Beclin1 m RNA表达水平的变化;构建稳定表达自噬双荧光慢病毒载体HBLVm RFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系,激光共聚焦显微镜观察自噬情况;SPSS 20.0统计软件进行数据分析。结果 CCK-8结果表明,选用20μg/m L LTA及其以下浓度处理巨噬细胞24 h均未见明显毒性作用（t=2.102,P=0.1106）;Western blot结果表明,LTA刺激巨噬细胞后：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值表达量（0.42±0.04）与对照组（0.04±0.02）相比显著提高,差异有统计学意义（F=14.25,P〈0.001）,Beclin1蛋白表达量（0.56±0.11）与对照组（0.28±0.08）相比呈上升趋势（F=3.459,P=0.0258）,均存在剂量依赖效应;实时荧光定量PCR结果表明,LTA刺激巨噬细胞后,LC3基因表达水平（5.94±0.85）与对照组（1.03±0.28）相比显著提高（F=12.93,P〈0.001）;Beclin1基因表达水平（2.22±0.21）与对照组（1.02±0.28）相比呈上升趋势（F=6.036,P〈0.001）,存在剂量依赖效应;成功构建稳定表达HBLV-m RFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系,激光共聚焦显微镜下观察显示,LTA作用组自噬体形成量（58±6）与对照组（18±8）相比差异有统计学意义（F=12.36,P=0.0021）。结论 粪肠球菌LTA可诱导巨噬细胞产生自噬,且存在剂量依赖效应。
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