作者：梁敏坚; 洪国强; 李朝霞; 胡波; 许珏; 李...乙型肝炎病毒核心基因表达产物应用评价抗体检测中国药品生物制品检定所乙型肝炎病毒核心抗原表达及聚丙烯酰胺凝胶电泳hbcabhbcag酶联免疫吸附测定毕赤酵母表达系统大肠杆菌表达免疫反应性阳性符合率最低检出量
摘要：目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用.方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg 的C基因,插入pPIC9酵母表达载体.携带有C片段的pPIC9转化毕赤酵母菌株GS115,经甲醇诱导表达HBcAg.分别用分子筛纯化毕赤酵母表达的HBcAg(A)、单克隆HBcAb特异结合纯化毕赤表达的HBcAg(B)、分子筛纯化大肠杆菌表达的HBcAg(C)、单克隆HBcAb特异结合纯化大肠杆菌表达的HBcAg(D)作为固相抗原,辣根过氧化物酶标记多克隆HBcAb为探测抗体,用竞争抑制法酶联免疫吸附测定(competitive inhibition ELISA)检测HBcAb标准品及含有乙型肝炎病毒PCR阳性和阴性血清的临床标本.结果聚丙烯酰胺凝胶电泳、immunoblot、ELISA显示HBcAg在毕赤酵母中高效表达;分别用抗原A、B、C、D制备的试剂检测中国药品生物制品检定所HBcAb国家参考品:试剂A与B结果相同: 阴性符合率(-/-)15/15,阳性符合率(+/+)15/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品?=1∶ 128,3#=1∶ 16,4#=1∶ 64.试剂C与D结果相同:阴性符合率(-/-)15/15;阳性符合率(+/+)14/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶ 32;3#=1∶ 16;4#=1∶ 32;大肠杆菌抗原的灵敏度明显低于毕赤酵母抗原.对乙型肝炎病毒PCR阳性及阴性的临床标本进行检测,结果如下: PCR阳性组HBcAb阳性检出率:试剂A 97.8%; 试剂B 98.1%;试剂C 96.6%;试剂D 91.4%;A、B、C三组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);D分别与A、B、C相比较差异均有统计学意义(P＜0.005).PCR阴性组HBcAb阴性检出率:试剂A 80.3%;试剂B 80.9%;试剂C 75.0%;试剂D 85.7%;AB两组比较差异无统计学意义(P＞0.05); AC、AD、BC,BD、CD相比较差异均有统计学意义(P＜0.005);分子筛纯化的大肠杆菌HBcAg含有干扰检测的杂质,结果出现假阳性;大肠杆菌HBcAg存在表位缺�
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