作者：赵锦荣; 白玉杰; 王琰; 张庆华; 罗明; 闫...高通量耐利福平结核分枝杆菌技术检测耐药决定区pcr扩增快速检测方法临床应用价值建立方法焦磷酸测序pcr产物h37rv临床分离株检测灵敏度自动化程度生物素化基因片段rpob链亲和素序列测定
摘要：目的基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术,建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法,并探讨其临床应用价值.方法设计一对聚合酶链反应(PCR)引物,其中一引物经生物素化修饰,PCR扩增含耐药决定区一297 bp 长的rpoB基因片段,借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物.设计2个正向测序引物,运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定.通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析,评价所建立方法的检测敏感性.通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析,评价所建立方法的检测特异性.结果 PCR扩增后,可在2 h内得到耐药决定区序列.所建立方法的检测灵敏度为 50 fg DNA/反应.在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变,而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变.结论所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测.
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