作者：王臻; 杨旻; 李立文; 苏明权; 于文彬骨肉瘤程序细胞死亡基因表达调控质粒载体
摘要：目的通过构建能产生长双链RNA的质粒载体,探讨长双链RNA非特异性诱导人骨肉瘤细胞凋亡的可行性.方法以无毒性、完全外源性基因绿色荧光蛋白EGFP基因为RNA模板,使用2个启动子同时从正反向引导DNA序列产生正义和反义链RNA,构建产生长双链RNA的质粒载体.转染人骨肉瘤细胞系MG63,48 h后对细胞进行凋亡荧光染色、流式细胞仪及MTT法测定,对数据进行统计学处理.结果成功获得能产生长双链RNA的质粒载体pCI-neo-dsEGFP,MTT法测定显示随着pCI-neo-dsEGFP质粒剂量的增加(0.05 μg,0.10μg,0.15 μg,0.20μg,0.25 μg,0.30μg),细胞的吸光度逐渐减小.转入pCI-neo-dsEGFP组的MG63细胞经凋亡荧光染色呈现大量绿色不规则荧光,出现凋亡现象,而对照组没有出现.流式细胞仪检测结果显示阴性对照组MG63细胞凋亡率为0.028±0.006;pCIneo-dsEGFP质粒剂量1.0 μg时MG63凋亡率为0.175±0.021;2.0 μg时凋亡率为0.348±0.032;3.0μg时凋亡率为0.381±0.027;阳性对照组MG63细胞凋亡率为0.386±0.029.随着dsRNA剂量的增加,骨肉瘤细胞生长的抑制效应逐渐增加.当pCI-neo-dsEGFP质粒剂量为3.0μg时,对MG63细胞产生的凋亡效应与100μl的5-FU(50μg/ml)产生的凋亡效应差异无显著性.结论长双链RNA能非特异性诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡,为骨肉瘤的基因治疗打下基础.
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