作者：白波; 黄弘轩; 黄芳立; 张姝江; 杜秀藩; ...间质干细胞骨形态发生蛋白质类慢病毒属多西环素
摘要：目的 构建携带四环素真核诱导表达系统（Tet-on）调控的人骨形态发生蛋白2（hBMP-2）慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞.方法 设计目的基因hBMP-2引物,将扩增纯化的目的基因hBMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物.hBMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液.用hBMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到hBMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数（MOI）.用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素（DOX）诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况.结果 PCR后得到目的基因hBMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的hBMP-2-GV347质粒.hBMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得hBMP-2-GV347慢病毒浓缩液.在DOX诱导下,hBMP-2-GV347慢病毒载体在293 T细胞内表达BMP-2蛋白.hBMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA.结论 本研究成功构建携带Tet-on系统调控hBMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白.
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