人Bcl-2基因重组腺病毒的构建及其在螺旋神经节细胞中的表达

作者：罗凌惠; 龚树生; 宋鹏; 鄢开胜; 刘英鹏螺旋神经节细胞基因重组腺病毒增强型绿色荧光蛋白细菌内同源重组法hek293细胞聚合酶链反应方法western螺旋神经节损伤显微镜下观察blot检测mrna水平原代培养病毒颗粒cells腺病毒介导构建表达

摘要：目的构建表达人Bcl-2基因的重组腺病毒,并研究其在原代培养螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC)的表达特性.方法采用细菌内同源重组法,从pUC-CAGGS/Bcl-2质粒中获得人Bcl-2 cDNA,克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,后者和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内同源重组,在HEK293细胞中包装成为重组Ad增强型绿色荧光蛋白/Bcl-2腺病毒,电镜观察病毒颗粒,用病毒感染原代培养的大鼠螺旋神经节细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,用逆转录聚合酶链反应方法检测Bcl-2基因在螺旋神经节细胞的转录表达,用Western Blot检测其蛋白的表达.结果经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,呈规则六边形.荧光显微镜下观测到感染病毒的SGC细胞发出明亮的绿色荧光.分别在mRNA水平及蛋白水平证实有外源性Bcl-2 基因的表达.结论细菌内同源重组法是一种简便、高效的制备方法.构建的重组Ad增强型绿色荧光蛋白/Bcl-2腺病毒能有效的感染SGC,并可在SGC中正确地转录和翻译,为进一步研究腺病毒介导的Bcl-2基因对螺旋神经节损伤的保护作用奠定基础.

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