作者：杨冀萍; 刘怀军; 王藏海; 李春岩; 王黎脑缺血再灌注损伤半胱氨酸蛋白酶类线粒体细胞凋亡
摘要：目的：观察半胱氨酸蛋白酶3在局灶性脑缺血再灌注不同时间、灶周皮质的动态时空变化。方法：实验于2005—05／08在河北医科大学第二医院神经分子影像医学和神经病学实验室完成。①选择清洁级健康新西兰白兔66只，雄性，兔龄4．5—5个月，体质量（2．6±0．2）奴，采用兔大脑中动脉阻断局灶性脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组（n=6），模型组（n-60），模型组按再灌注时间又分为6个时间点，即1h、6h、1d、3d、7d、14d，每个时间点10只大白兔，各时间点依方法不同又分为组织学检测组（n=5）和流式细胞术检测组（n=5）。②采用免疫组化SP法检测皮质半胱氨酸蛋白酶3表达：应用Meta Morph显微图像分析系统于400倍光镜下随机观察并测量灶周皮质5个不重复视野神经细胞胞浆半胱氨酸蛋白酶3阳性表达光密度值，计算其平均数。③流式细胞术检测细胞凋亡率和灶周皮质半胱氨酸蛋白酶3的表达：经计算机分析系统，绘制细胞数DNA分布图，以二倍体峰前亚二倍体峰（凋亡峰）判定细胞凋亡，计算DNA断裂的凋亡细胞百分数（细胞凋亡率）。④透射电镜取材和观察：开颅取脑后，立即取梗死灶周1mm×1mm×2mm大小的标本，经过一系列处理后，在光镜下进一步确认已切到梗死灶周后，行超薄切片。醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后，日立H-9000型透射电镜进行超微结构观察并照相。⑤结果行单因素方差分析。结果：66只大白兔全部进入结果分析。①免疫组化及流式细胞术分析发现，半胱氨酸蛋白酶3在2h缺血再灌注1h迅速增多，并随再灌注时间延长而加剧，3d达高峰，然后逐渐下降，14d仍高于基线水平。②灶周皮质凋亡率和脱氧核苷酰转移酶法计数TUNEL阳性细胞数在再灌注1h也逐渐增多，1-3d达高峰，然后逐渐下降，14d降至基线水平。③超微结构显示假手术组
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