作者：高学军; 蔡霞; 张鹏; 唐胜建成纤维细胞细胞培养的细胞衰老皮肤人工表皮细胞生长因子胶原基因表达刺激反应体外培养代次
摘要：背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,其质量好坏直接影响组织工程化皮肤的质量.其在体外培养过程中胶原基因表达及对表皮细胞生长因子刺激反应,可以反映不同代次成纤维细胞的增殖能力,为皮肤组织工程筛选合适的种子细胞提供依据.目的:观察体外培养不同代次人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达及对表皮细胞生长因子刺激的反应性,为组织工程化皮肤种子细胞的选择提供部分依据和参数.设计:自身对照实验.单位:潍坊医学院整形外科研究所.材料:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成.实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织,均自愿提供.方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,去除皮下疏松结缔组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200 U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30 min,收集细胞悬液,用血细胞计数板做细胞计数,观察细胞活性,接种于培养皿中,细胞培养达到80%汇合时,用混合消化液消化,镜下见胞质回缩终止消化,以1:2接种入新培养皿,进行传代培养.②细胞鉴定:用相差显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色.③不同代次成纤维细胞胶原基因表达的分析:抽提不同代次(P0,P5,…,P65)成纤维细胞总核糖核酸,获得样本cDNA,进行逆转录聚合酶链反应,所得反应产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳对照分子量标准,分析扩增产物是否为所预期.④氚-胸苷(3H-TdR)掺入量测定对表皮生长因子刺激的反应性:取P10和P60代成纤维细胞,实验组均添加含表皮生长因子的条件培养液,对照组用不加表皮生长因子的条件培养液.细胞培养至80%汇合时,血清饥饿72 h.加入含200 μL/L表皮生长因子无血清DMEM培�
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