作者：高琳琳; 李尧华; 吴燕川; 于顺; 陈彪金属蛋白酶类糖尿病非胰岛素依赖型
摘要：目的:利用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶,并分析其活性.方法:实验于2004-05/11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成.将编码大鼠胰岛素降解酶的cDNA插入质粒pGEX-4T-1并转化大肠杆菌BL21,使其表达谷胱甘肽巯基转移酶为标签的融合蛋白质.凝血酶定点分解融合蛋白,用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲合层析方法纯化基因重组胰岛素降解酶.重组胰岛素降解酶的活性应用高压液相色谱进行判断.结果:[1]胰岛素降解酶cDNA编码区片段的亚克隆:重组质粒亚克隆的cDN段为3 060 bp,编码1 019个氨基酸.[2]胰岛素降解酶在原核细胞的表达与纯化:重组质粒pGEX-rIDE在原核细胞中表达为可溶性组分,培养菌液可收获目的基因重组酶约0.5 mg/L,纯化的胰岛素降解酶在SDS-PAGE上表现为单一条带,其表观相对分子质量为110 000,与野生型酶相同.[3]基因重组蛋白质对胰岛素的降解作用:牛胰岛素与基因重组蛋白质的洗脱峰分别出现在34.5和38.3 min,将纯化的重组蛋白与胰岛素在37℃下共同孵育后,胰岛素含量明显减少.孵育的最初20 min质量变化明显,其峰面积值减少了约50%,但其余时间降解不明显.该蛋白质对14-3-3蛋白的两个亚型没有降解作用.结论:基因重组rIDE具有天然酶的活性,但该活性在孵育20 min后胰岛素降解延缓,可能是胰岛素的降解产物反馈抑制了rIDE活性,与酶的自身调节有关.本实验制备了具有生物学活性的基因重组型大鼠胰岛素降解酶,为进一步制备抗胰岛素降解酶单克隆抗体以及探讨胰岛素降解酶与2型糖尿病发生之间的关系打下了基础.
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