作者：李忠; 杨柳; 陈光兴; 林炎水; 段小军组织工程软骨细胞绿色荧光蛋白标记逆转录病毒载体
摘要：目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用.方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成.选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增.再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体.首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损.倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况.结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析.①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3 d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形.随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱.流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%.②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4 h细胞开始变形,2～3 d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形.体外培养6周,细胞密度增�
注：因版权方要求，不能公开全文，如需全文，请咨询杂志社
