作者：刘卫鹏; 张传仓; 杜江; 朱为国; 封志纯细胞培养连续传代胰腺间质细胞细胞体外培养新生sd大鼠胰腺组织形态学特征原代培养细胞细胞生长曲线
摘要：目的:对胰腺间质细胞进行原代及传代培养,观察其形态学的变化.以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法.方法:用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液,取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死,体积分数0.75的乙醇浸泡消毒,无菌条件下取出胰腺组织,去除红细胞,剪切,加入胰蛋白酶消化,消化终止后细胞筛过滤,收集滤过的细胞悬液离心,弃上清液,重复1次.收集获得的单个胰腺间质细胞.接种于含体积分数0.1的胎牛血清、0.05g/L的亚胺培南的DMEM/F-12(1:1)培养基,培养48 h后换液,弃上清及悬浮细胞,继续培养48h后,换用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的完全培养基培养24 h,再换正常培养基继续培养,在培养细胞达到80%～90%的细胞汇合时,按1:3进行传代培养.测定细胞生长曲线及贴壁率,原代细胞及传代细胞用双硫腙染色,鉴定有无胰腺β细胞.结果:①原代细胞及传代细胞形态学观察:原代培养换液前,显微镜下可见细胞大小不等,悬浮,有较多细胞碎片.48 h首次全量换液后,悬浮细胞减少,经3次换液可基本去除.加用阿糖胞苷培养24 h,大量细胞相继死亡.至第10-14天,培养细胞明显增加,基本铺满瓶底,以星形、梭形为主,细胞呈放射状或漩涡状生长,部分区域呈灶状.传至第5代细胞出现老化.②细胞生长曲线:细胞从传代后第2天,数量即开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大,以后数量略有下降.传代培养对数增殖期为2-4 d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期.③细胞的贴壁率:传代细胞培养2 h已有部分细胞贴壁;培养4 h贴壁细胞接近50%;培养10 h贴壁达79%;培养12 h细胞全部贴壁,而且部分细胞开始分裂增殖,细胞形态与原代细胞基本相似.④胰腺β细胞的化学鉴定:对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色.培养前细
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