作者：杨帆; 张海青; 王敏; 纪卫东; 张文娟甲基化转移酶基因敲除表观遗传膀胱癌t24细胞
摘要：目的 采用常间回文重复序列丛集（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术,构建RNA甲基化转移酶（METTL）3与METTL14的基因同时敲除的人膀胱癌细胞株T24细胞,为职业性肿瘤的靶向基因干预提供新的工具与手段。方法 设计并合成靶向METTL3和METTL14的小向导RNA（sgRNA）寡核苷酸序列,构建至Lenti-multiCRISPR载体;采用慢病毒系统将诱导型质粒Lenti-i Cas9-neo转染至T24细胞,以流式细胞术分选阳性克隆,将重组质粒Lenti-multi-METTL3-METTL14转染至阳性分选细胞并筛选,以免疫印迹法检测T24-Lenti-multi-CRISPR空载体细胞（对照组）、METTL3-METTL14双基因敲除T24细胞株T24-KO-METTL3-METTL14（双基因敲除组）的METTL3和METTL14蛋白的相对表达量。结果 目的 sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的Lenti-multi-CRISPR质粒载体,测序正确;诱导型质粒Lenti-i Cas9-neo成功转染至T24细胞中,经流式分选获得大量阳性细胞;经强力霉素诱导后,获得METTL3-METTL14双基因敲除的稳定细胞株。强力霉素处理96 h后,双基因敲除组细胞的METTL3、METTL14蛋白相对表达量较对照组细胞分别下降52.08%和64.04%（P〈0.01）。结论 首次获得METTL3-METTL14双基因稳定敲除的T24细胞,为人膀胱癌细胞的候选基因干预靶点及膀胱癌的防治机制研究奠定基础。
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