作者：刘金泽; 刘云惠; 余子豪; 李永霞; 王明晓...red重组rpsl基因基因敲除大肠杆菌flgk基因
摘要：为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法，本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因（str^S，即rpsL基因）和卡那抗性基因（kan^R），采用重叠延伸PCR方法将str^S基因和kan^R基因拼接，并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中，再以重组载体为模板，以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr^S-kan^R打靶片段和Parastr^S-kan^R打靶片段，然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10，并通过链霉素最小抑菌浓度（MIC）试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示，野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000 μg/mL、2 000 μg/mL和500 μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型，具有反向筛选的能力，但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统，为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。
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