作者：温振才; 曹津津; 卢强鲤鱼inoscdna克隆外周血白细胞差异表达分析
摘要：试验旨在获得鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS） cDNA全长序列,并以此为基础探讨在丝裂原刺激下外周血白细胞中iNOS的表达变化.以从鲤鱼正常外周血白细胞cDNA文库中获得的iNOS的EST序列为基础,采用基因文库筛选和cDNA 5 ＇末端快速扩增技术（5’-RACE）相结合的方法,成功扩增出鲤鱼iNOS cDNA全长序列,然后进行鲤鱼外周血白细胞原代培养,分成对照组和试验组,其中试验组分别为脂多糖（LPS,1.0 μg/mL）刺激4、12h,刀豆蛋白A（ConA,1.0 μg/mL）刺激4、24 h,对照组为相同培养时间无丝裂原刺激的外周血白细胞,根据得到的iNOS cDNA全长序列和鲤鱼β3-actin序列分别设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测各组外周血白细胞中iNOS在mRNA水平上的表达情况并进行分析.序列分析结果显示,最后获得的cDN段共3 704 bp,包含74 bp的5’端非编码区,246 bp的3 ＇端非编码区,一个3 384 bp的完整的开放阅读框（ORF）,共编码1 127个氨基酸.序列同源性分析结果显示,该序列与鲫鱼iNOS基因同源性高达100％;实时荧光定量PCR结果显示,经LPS、ConA刺激的试验组外周血白细胞中iNOS表达量均升高,且短时间（4 h）刺激的表达量高于长时间（LPS 12 h;ConA 24 h）刺激的表达量.综上所述,在LPS、ConA刺激过程中,iNOS在外周血白细胞中表达量均有上调,结果提示存在炎症反应的动态变化.
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