作者：艾永兴; 肖昌; 郝军元; 胡薇; 潘风光; 郑...p15tapsf9昆虫细胞杆状病毒
摘要：为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用，本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白。为后期纯化的需要，对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造，并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP—p15。将2个供体质粒转化到DHl0Bae感受态菌中，对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和BacmidCTAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化，提取大质粒Bacmid-N-TAp-p15和Bacmid-C-TAP—p15并进行转座鉴定。将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Baemid—C-TAP—p15转染入sf9昆虫细胞中，72h后收集培养上清中的杆状病毒，并进行病毒的扩增和滴度测定，结果所获2株重组杆状病毒N—TAPp15和CTAP-p15的滴度分别为3．6×10^7，5．4×10^7pfu／mI。。将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达，结果与对照组相比，重组p15融合蛋白得到了有效的表达，表达量分别为4．32％和4．7％。Western blotting结果表明，所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应；说明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达。
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