作者：陈金霞; 陈姗姗; 董文韬; 王博; 郭小舟; ...黑腹果蝇保幼激素met泛素化修饰位点点突变
摘要：目的预测黑腹果蝇保幼激素(juvenile hormone,JH)受体Methoprene tolerant(Met)的泛素化修饰位点,并验证其功能。方法利用UbPred和CKSAAP_UbSite在线预测工具对Met的泛素化位点进行预测;通过重叠PCR技术将预测的各泛素化修饰位点赖氨酸分别突变为丙氨酸,同时将第46和526位赖氨酸突变为丙氨酸;将突变后的Met插入至表达载体p Ac5. 1/V5-His B中,构建各位点突变的表达质粒;转染果蝇Kc细胞,并经格尔德霉素(geldanamycin,GA)处理,Western blot法检测各位点突变后Met的表达。结果根据UbPred和CKSAAP_UbSite在线网站预测结果,选取7个赖氨酸位点作为Met的潜在泛素化修饰位点,CKSAAP_UbSite及UbPred预测分值最高的分别为第46和526位赖氨酸。构建的Met各位点突变表达质粒转染果蝇Kc细胞后,于相对分子质量约82 000处均可见Met目的蛋白的表达,经GA处理后,Met表达下降。结论成功构建了Met的7个预测泛素化修饰位点的单突变表达质粒及1个双突变表达质粒,这些位点的突变均不足以抑制GA诱导Met的降解。
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