食欲素1受体与胆囊收缩素2受体在细胞内的相互作用分析

作者：姜云璐; 王正文; 程葆华; 白波; 陈京食欲素受体胆囊收缩素受体荧光共振能量转移免疫共沉淀

摘要：食欲素1受体（orexin 1 receptor,OX1R）与胆囊收缩素2受体（cholecystokinin receptor,CCK2R）在结肠癌细胞中高表达,且异常表达的OX1R、CCK2R与其配体诱导的结肠癌细胞增殖密切相关,但具体机制尚不清楚。以前的研究证实,OX1R与CCK1R在HT-29细胞中能以二聚体的形式发挥作用。本文利用多种（荧光）共振能量转移技术（FRET）结合免疫共沉淀（Co-IP）,进一步研究活细胞中OX1R与CCK2R是否发生相互作用。生物发光能量共振转移（BRET）结果显示,在控制供体（OX1R-Rluc）量不变,而逐渐增加受体（CCK2R-e YFP）转染量时,与无刺激的（对照）细胞比较,食欲素或胃泌素刺激HEK293T细胞5 min,BRET信号伴随受体表达量的增加而增加,并达到最大值。采用荧光共振能量转移技术在HEK293T细胞中,能够检测到OX1R-e YFP与CCK2Re CFP明显的FRET信号。同时,受体漂白FRET（ap FRET）结果揭示,在同时表达OX1R-e YFP和CCK2R-e CFP的细胞膜特定区域,进行受体蛋白（OX1R-e YFP）完全光漂白、破坏了受体-供体之间的相互作用和能量传递后,由于供体（CCK2R-e CFP）荧光强度比漂白前明显增强,其荧光共振能量转移效率（FREPe）明显增加,是对照转染细胞的3.7倍（P〈0.05）。此外,基因转染结合Co-IP结果显示,仅有在共转染HA-OX1R与Myc-CCK2R的HEK293T细胞提取液的免疫沉淀物中,可同时检出HA-OX1R、Myc-CCK2R融合蛋白,而在未转染或单转Myc-CCK2R的细胞提取液沉淀物中,却不能同时检出两种融合蛋白。以上结果表明,在活细胞生理条件下,OX1R可与CCK2R相互作用,这为进一步探讨二者相互作用在结肠癌细胞增殖中的作用及相关信号通路提供了新的线索。

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