作者：陈惠; 赵海霞; 王红宁; 杨婉身; 吴琦; 倪...黑曲霉植酸酶phya基因定点突变毕赤酵母表达
摘要：对来源于黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变,不改变其所编码氨基酸,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变.构建了含正确突变的克隆载体pUC18-phyAm和酵母表达载体pPIC9kphyAm,电击转化毕赤酵母,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各2株.这4株转化子的Southern印迹结果表明,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中.表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,蛋白质分子大小为70.15 kD.转化子酶活测定结果表明,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子.经密码子优化的突变重组酵母株PP-NPm-8于麦芽汁培养基中诱导36 h后酶活力可达47 600U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP-NP-2(23 667 U/ml)提高了约1倍,且重组转化子遗传稳定性良好.
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