限制性内切酶介导的重叠延伸在人环氧合酶-1（COX-1）基因克隆中的应用

作者：陈晓红; 王伟; 程桂芳限制性内切酶重叠延伸外显子

摘要：建立一种用于克隆全长基因的、限制性内切酶介导的重叠延伸法．对全长基因进行分段扩增，并利用适当的限制性内切酶对基因序列内相应的限制性位点进行酶切，从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板，在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因．将环氧合酶-1(COX-1)基因的外显子9巧妙地拼接到了缺失外显子9的COX-1cDN段中，获得了COX-1基因的全长cDNA．该方法分3步进行．首先，通过RT-PCR分别扩增跨外显子9的cDN段和缺失外显子9的cDN段，并克隆到pMD18-T载体上；其次，PCR扩增外显子9片段，限制性内切酶Stu Ⅰ酶切缺失外显子9 cDN段的重组质粒，二者以一定的比例混合，互为模板，在pfu DNA聚合酶的作用下进行延伸，从而产生一个双链的DNA分子．最后，以延伸产物为模板，用COX．1cDNA两端的引物进行PCR扩增，产生包含外显子9的COX-1基因的全长cDNA．这种限制性内切酶介导的重叠延伸方法，对于克隆mRNA剪接水平上受调控的基因尤为有用，同时也为基因的重组和修饰提供一个新的思路．

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