四步法消除SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

作者：张驰宇; 张高红; 杨敏; 贲昆龙引物二聚体sybrgreen四步法rna定量

摘要：为建立一种新的SYBR greenⅠ实时定量RT-PCR方法，使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响，对RT-PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析，依据PDs和扩增产物的熔解温度(Tm)特点，在通用的三步法的延伸步骤之后，增加一个短暂的(5s)恒温和荧光检测步骤，使这个步骤的温度高于PDs的Tm，但低于扩增产物的Tm，简称该法为四步法，PDs的Tm通常高于72℃，但低于扩增产物的Tm，将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm，但低于扩增产物的Tm时，四步法能够有效地消除PDs的影响，对三步法和四步法SYBR greenⅠ实时定量RT-PCR进行了比较，发现三步法根本不能用于RNA的实时定量，而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量，选择Tm值尽可能小的引物，使PDs与扩增产物Tm值之间有足够的差距，将更有利于四步法的应用，并可成功地用于低丰度RNA的准确定量。

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