ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

作者：王霞; 侯敏; 孙兴会; 张宇清; 李平; 谭理...融合蛋白基因毕赤酵母克隆表达鉴定尿激酶型纤溶酶原激活物

摘要：为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)突变体所构成的融合蛋白基因，并在Pichia pastoris中表达，应用PCR获得了人ATF-PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF-PAI2 CD)，将其克隆到酵母表达载体pPIC9K，获得融合基因表达质粒pZWY-ATF-PAI2CD,该质粒转化毕赤酵母菌GS115，用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子，然后用甲醇诱导表达．工程菌用摇瓶发酵，表达产物ATF-PAI2CD占培养液中总蛋白50％以上,经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达95％．Western印迹检测具有PAI-2与uPA的免疫原性，经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性．经流式细胞仪(FCM)检测，能与肿瘤细胞特异性结合．结果表明，ATF-PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达，且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能．提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景。

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