作者：江毅; 姜立娜; 周俊国南瓜msap体系优化引物筛选
摘要：以南瓜自交系北观(Cucurbita maxima)为材料,利用正交设计L16(4^5)优化南瓜MSAP预扩增和选择性扩增体系的主要因素。结果表明,第一步最佳酶切时间2 h,HapⅡ(HpaⅡ,MspⅠ)用量0.5μL;第二步酶切时间6 h,EcoRⅠ用量0.4μL;连接体系包括酶切产物21μL,EcoRⅠ接头(5μmol·L^-1)、HapⅡ接头(5μmol·L^-1)各1.0μL,连接时间12 h,T4 DNA Ligase用量为0.5μL;最佳预扩增反应体系(25μL)包含2.0μL连接产物,1.5μL 10×PCR Buffer(Mg^2+plus),2.0μL dNTP(2.5 mmol·L^-1),0.6μL Taq酶(5 U·μL^-1),0.4μL上下游引物(10μmol·L^-1);最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释120倍的模板4.0μL,其他同预扩增体系。最后,利用建立好的MSAP体系进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳验证并筛选出适于南瓜MSAP分析的36对引物,表明优化后的MSAP体系多态性好,体系稳定,可重复,为后续进行南瓜MSAP分析奠定了基础。
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